Криоконсервация эмбрионов мышей инбредных линий гарантия сохранения их генофонда

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

БИОМЕДИЦИНА • № 1 2005, с. 96−102
Криоконсервация эмбрионов мышей инбредных линий — гарантия сохранения их генофонда
Х. Х. Семенов, Е. Л. Игнатьева, Т.Б. Бескова
Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
Исследована возможность сохранения жизнеспособности и генетического статуса линии мышиными эмбрионами, прошедшими процедуры замораживания, длительного хранения в низкотемпературном банке (-196 ОС), размораживания и трансплантации самкам-реци-пиентам. Установлено, что 4-летнее хранение в криобанке эмбрионов мышей инбредной линии C57BL/6Y не повлияло ни на их жизнеспособность, ни на генетический статус линии.
Ключевые слова: криоконсервация, эмбрионы, трансплантация, хромосомы, аберрации.
Введение
Криконсервация эмбрионов, то есть длительное хранение их при низких температурах (-196 ОС) — единственная возможность сохранения генофонда некоторых представителей животного мира.
Особую актуальность она приобретает в лабораторном животноводстве, от качества продукции которого зависят во многом результаты биомедицинских исследований. В настоящее время создано такое количество инбредных, конгенно-резистентных линий и мутантных форм мышей, часть из которых представляет собой адекватные модели наследственных патологий человека, таких, как диабет, мышечная дистрофия, разные формы анемии и т. д., что ни одно, даже очень крупное, научное учреждение не в состоянии содержать весь их набор. Кроме того, всегда есть угроза потери любой линии в результате генетического засорения или болезни.
Криобанки могут обеспечить полную сохранность генетической информации в виде эмбрионов, гонад, половых и соматических клеток. Возможность получения полноценных животных из криоконсерви-рованного материала экспериментально подтверждена для большинства лабораторных [3, 5−7, 9, 25−28], многих сельскохо-
96
зяйстенных [1, 4, 8, 11] и некоторых диких животных [21, 22].
Работы, посвященные криоконсервации эмбрионов, носят методический характер, в которых авторы исследуют влияние различных факторов на эффективность криоконсервации, т. е. на выживаемость замороженно-оттаянных эмбрионов. Так, в частности, особо дискуссионным остается вопрос по выбору скорости и конечной температуры, до которой необходимо проводить замораживание в постоянно контролируемых условиях.
В ранних исследованиях по криоконсервации эмбрионов млекопитающих успешные результаты были получены при использовании малых скоростей как при замораживании (0,2−0,5 ОС/мин), так и при оттаивании (4−25 ОС/мин), в сочетании с длительным процессом контролируемого замораживания [12−15, 17−19]. Однако в более поздних сообщениях [16,
24, 26, 27] показано, что высокая эффективность достигается при медленном замораживании (0,3−0,5 ОС/мин) и быстром оттаивании (450−650 ОС/мин). В этих работах помимо быстрой скорости оттаивания применены незначительные температуры охлаждения эмбрионов с постоянно контролируемой скоростью: -25 … -40 ОС.
Вместе с тем, вопрос о значении медленного замораживания активно оспарива-
ется. Так, Вилладсан и сотр. [23] использовали для замораживания эмбрионов млекопитающих двухступенчатые процедуры. На первом этапе, до -30 ОС, использовалась скорость охлаждения 0,3 ОС/мин, на втором, до -33 … -36 ОС, объекты замораживались со скоростью 0,1 ОС/мин, а затем погружались в жидкий азот (-196 ОС). Применяя такой способ замораживания, авторы получили 60%-ную выживаемость эмбрионов.
Таким образом, выбор скорости и конечной температуры, до которой необходимо проводить замораживание в постоянно контролируемых условиях, должен соответствовать более плавному переводу эмбрионов в равновесное состояние.
Оптимальная скорость охлаждения — это такая скорость, при которой обеспечивается предотвращение образования внутриклеточного льда и достаточно быстрое доведение до минимума соприкосновение клеток с высокими концентрациями солей.
Вместе с тем, оптимальная скорость зависит от концентрации криопротектора, а также от процедур, используемых при замораживании, т. е. температуры, при которой осуществляется добавление криопротектора, и времени эквилибрации зародышей с ним.
Исследования [20, 24−27] эффекта добавления и разбавления криопротектора при различных температурах (0, 20 и 37 ОС) на выживаемость замороженно-оттаянных эмбрионов показали, что высокая выживаемость была достигнута путем разбавления криопротектора при температуре 37 ОС независимо от температуры добавления. Все другие температурные комбинации добавления и разбавления криопротектора дают средние значения выживаемости.
В литературе по криоконсервации эмбрионов млекопитающих нам не удалось обнаружить работ, изучавших влияние низкотемпературного хранения на геном животных. Поэтому в задачу настоящей
работы входило, наряду с адаптацией метода криоконсервации эмбрионов в условиях НЦ БМТ РАМН, также исследование влияния глубокого замораживания и длительного хранения их в низкотемпературном банке (-196 ОС) на сохранение генетического статуса линии.
Материалы и методы
В эксперименте были использованы до-имплантационные эмбрионы мышей ВАLВ/c, полученных из питомника «Светлые Горы», и C57BL/6JY и NMRI, разводимых в коллекционном фонде НЦ БМТ РАМН. Для криоконсервации использовались эмбрионы в возрасте 3,5 дней на стадии морул и бластоцит. Это достигалось путем вымывания теплой средой 199 из половых путей 2,5−3,5-месячных самок на 4-й день после обнаружения влагалищной пробки в результате ночного спаривания.
В качестве криопротектора использовали диметилсульфоксид (ДМСО). Конечная концентрацияДМСО — 1,5 М. Добавление ДМСО осуществляли при комнатной температуре ступенчато:
0,5 М ДМСО в РВІ - 5 мин,
1,0 М ДМСО в РВІ - 5 мин,
1,5 М ДМСО в РВІ - 25 мин.
Криоконсервацию эмбрионов проводили в пластиковых трубочках с запаянными концами. Трубочка помещалась в камеру замораживания при температуре -6 ОС. Через 5 мин проводили сидинг, т. е. стимулировали процесс образования льда путем локального охлаждения стенки трубочки с помощью пинцета, концы которого предварительно охлаждались в жидком азоте.
Затем осуществляли контролируемое замораживание эмбрионов со средней скоростью 0,35 ОС/мин (0,2−0,5 ОС/мин) до температуры -40 ОС. После 3-минутной паузы трубочку с эмбрионами переносили в контейнер, который опускали в сосуд
Дьюара с жидким азотом на длительное хранение.
Размораживание эмбрионов осуществляли в теплой водяной бане при температуре 37 ОС. При этом температура повышается от -196 до +37 ОС за 24−27 секунд. Непосредственно после оттаивания, эмбрионы переносили в свежеприготовленный раствор 1,5 М ДМСО в PBI и отмывали от ДМСО при комнатной температуре (ступенчато) в обратной последовательности: 1,5 М ДМСО в PBI — 5 мин,
1,0 М ДМСО в PBI — 5 мин,
0,5 М ДМСО в PBI — 10 мин.
Затем эмбрионы переносили в чистую среду PBI. После адаптационного периода в течение одного-двух часов в термостате (37 ОС) эмбрионы оцениваются на жизнеспособность. Предварительная оценка жизнеспособности эмбрионов осуществляется путем прижизненной микроскопии. Для окончательного тестирования жизнеспособности эмбрионы трансплантируются в матку псевдобеременным самкам. Только рождение жизнеспособных мышей может свидетельствовать об успешности проведенных процедур по замораживанию и оттаиванию эмбрионов. В качестве самок-реципиентов были использованы мыши популяции ICR со смещением срока псевдобеременности на двое суток по сравнению со стадией развития эмбрионов.
В эксперименте по исследованию влияния глубокого замораживания и длительного хранения эмбрионов в криобанке на сохранение генетического статуса линии были использованы две группы мышей из линии С57ВL/6: опытная — с потомками эмбрионов, прошедших процедуры замораживания-оттаивания и длительного хранения в криобанке (4 года), и контрольная — с их аналогами, прошедшими естественный процесс утробного развития, предки которых все 4 года нормально размножались в условиях коллекционного фонда НЦ БМТ РАМН.
98
Контроль гомозиготности мышей опытной группы осуществлялся по генам гистосовместимости (Н-генам). Критерием гомозиготности служило 100%-ное приживление кожных трансплантантов. Обмен кожными трансплантантами с хвоста (мышей контрольной группы) на бок (мышей опытной группы) выполняли на животных одного пола. Метод подробно описан З. К. Бландовой [2].
Также было исследовано влияние замораживания-оттаивания и длительного хранения эмбрионов на чувствительность мышей линии С57ВL/6 к цитогенетическому эффекту тиофосфамида (тио-ТЭФ). В опыте участвовали 2 группы мышей 2-месячного возраста по 5 голов в каждой (по 4 самки и 1 самцу). Чувствительность оценивали по частоте клеток костного мозга с индуцированными хромосомными аберрациями на метафазных препаратах, приготовленных через 24 часа после обработки тио-ТЭФ в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно. Анализированы по 100 клеток от каждого животного. Методы введения мутагена, приготовления препаратов и учета хромосомных повреждений подробно описаны
Н. И. Сурковой, А. М. Малашенко [10].
Результаты
Апробировав многочисленные варианты по исследованию влияния различных факторов на выживаемость замороженно-от-таянных эмбрионов, мы избрали метод, представленный выше, как наиболее эффективный в условиях НЦ БМТ РАМН.
В целях выявления влияния срока хранения и генотипа замороженных эмбрионов на их жизнеспособность в криобанк (-196 ОС) были заложены 357 доимплан-тационных эмбрионов. В табл. 1 представлено число эмбрионов каждого генотипа. Срок хранения эмбрионов в криобанке в момент размораживания составил для генотипа С57ВL/6 — 4 года, для БАЬБ/с — 3 года, NMRI — 1 год.
По предварительной оценке, около 20% всех эмбрионов оказались поврежденными, причем примерно в равных количествах по каждому анализируемому генотипу. Причиной повреждений были главным образом разрывы блестящей оболочки с выходом цитоплазмы либо сжатие зародышей, по-видимому, в результате нарушенного осмотического процесса. Из 119 эмбрионов генотипа С57ВL/6, трансплантированных самкам-реципиентам на 2-й день псевдобеременности, родился 31 живой мышонок, что составляет 20,8% от общего числа заложенных в криобанк, или 26,0% от числа трансплантированных эмбрионов.
Результаты трансплантации заморожен-но-оттаянных эмбрионов у двух других исследованных генотипов мышей аналогичны или отличаются очень незначительно от С57ВL/6 (табл. 1). Следовательно, на конечный результат, т. е. на число рожденных мышей из криоконсервированных эмбрионов, практически не оказали влияния ни длительность срока хранения эмбрионов в криобанке (4 года и 1 год), ни их генотип.
Ответ на допустимость практического использования метода криоконсервации эмбрионов лабораторных животных (мышей, крыс) может дать лишь генетический контроль. Из исследуемых нами ге-
нотипов проверке генетического статуса были подвергнуты мыши линии С57ВL/6, так как NMRI — неинбредная популяция, а мыши ВАЬВ/с получены из питомника «Светлые горы». Проверку мышей на го-мозиготность осуществляли методом гистосовместимости. Кожные лоскуты от мышей линии С57ВL/6, разводимых в коллекционном фонде НЦ БМТ РАМН, были трансплантированы на мышей той же линии, но полученных после замораживания и 4-летнего хранения в криобанке (при температуре -196 ОС). По результатам генетического контроля установлено, что мыши, прошедшие стресс замораживания-оттаивания и длительного хранения в криобанке, были полностью гомозиготны, все трансплантанты прижились (срок наблюдения 300 дней). Таким образом была подтверждена генетическая стандартность мышей, прошедших в эмбриональной стадии процедуры замораживания, длительного хранения в криобанке, оттаивания и трансплантации самкам-реципиентам.
Следовательно, гены, контролируемые Н-генами или генами гистосовместимости, не претерпели изменений. Однако известно, что гены гистосовместимости контролируют не весь геном. Поэтому сравнительное исследование чувствительнос-
Таблица 1
Результаты трансплантации самкам-реципиентам (ІСЯ) замороженно-оттаянных
эмбрионов мышей
Г енотип заморожен-но-оттаяных эмбрионов Всего размороженных/поврежденных эмбрионов Транспланти- ровано эмбрионов Родилось мышей живых/мертвых Доля рожденных мышат (%)
— От общего числа размороженных эмбрионов От общего числа транс-плантиро-ванных эмбрионов
С57L/6JY 149/30 119 31/- 20,8 26,0
BALB/cY 68/11 57 13/2 22,0 26,3
N1^! 140/28 112 28/2 21,4 26,8
ти мышей к действию мутагена может дать дополнительную информацию о состоянии генома потомков мышей, полученных от эмбрионов, переживших стресс замораживания-оттаивания и длительного хранения в криобанке.
Результаты цитологического анализа клеток костного мозга потомков мышей, прошедших процесс замораживания-оттаивания и длительного хранения в низкотемпературном банке, а также их аналогов из коллекционного фонда после воздействия тио-ТЭФ в дозе 3 мг/кг представлены в табл. 2.
Сопоставив результаты настоящего опыта с ранее полученными данными [10] на мышах этой же линии, но с исследованиями спонтанного уровня хромосомных повреждений в клетках костного мозга, нетрудно заметить, что тио-ТЭФ в дозе
3 мг/кг вызвал достоверное увеличение клеток с аберрациями в костном мозге обеих исследованных групп мышей. Основным типом структурных повреждений как в опытной группе мышей, так и в контрольной были фрагменты. Незначительное число аберраций представлено кольцами и хроматидными обменами. В контрольной
группе мышей обнаружена одна клетка с множественными аберрациями, т. е. у них имелись хромосомные повреждения, относящиеся к нескольким типам аберраций. Прослеживая ответ мышей опытной и контрольной групп на одну и ту же дозу тио-ТЭФ, мы видим, что различия между ними по частоте хромосомных нарушений в клетках костного мозга не достоверны.
Таким образом, все манипуляции с эмбрионами, а именно заморозка, длительное хранение при низкой температуре, разморозка, расконсервация и трансплантация приемным матерям, не оказали значимого влияния на чувствительность клеток костного мозга родившихся из них мышей. Полагаем, что вышеприведенные исследования дают основание считать, что хранение эмбрионов в криобанке не изменяет их генетического статуса, и, следовательно, может являться вполне приемлемой формой сохранения генофонда животных на длительный срок. Это означает, что хранение эмбрионов в криобанке (-196 ОС) вполне может быть рекомендовано в практику содержания мышей как наиболее экономичный способ их поддержания, в частности в коллекционном фонде.
Таблица 2
Чувствительность клеток костного мозга к тио-ТЭФ в дозе 3 мг/кг у потомков мышей С57БЬ/6, прошедших стресс замораживания-оттаивания и длительного хранения в криобанке, и их аналогов, разводимых в условиях коллекционного фонда ГУ НЦ БМТ РАМН
— Группы животных Просмотрено метафаз Частота клеток (%), содержащих Частота клеток (%) со структурными аберрациями
гепы фрагменты кольца обмены множест- венные аберрации
— После крио- 12 55 9 8 0
консервации 500 (2,4) (11,0) (1,8) (1,6) (0,0) 14,4 ± 3,53
Из коллекци- 10 64 7 6 1
онного фонда 500 (2,0) (12,8) (1,4) (1,2) (0,2) 15,6 ± 3,65
Спонтанный
уровень
аберрации 1000 8 3 — - - 0,3 ± 0,05
100
Обсуждение результатов
Проведенные исследования были обусловлены необходимостью гарантии сохранения особо ценных медико-биологических моделей — инбредных линий лабораторных мышей, которые содержатся в коллекционном фонде НЦ БМТ РАМН.
Анализу подверглись эмбрионы от ин-бредных линий С57ВL/6Y, БALБ/cY и неинбредной популяции NMRI на доим-плантационной стадии развития (3,5 дня).
Полученные результаты подтвердили возможность рождения живых мышей из эмбрионов, прошедших вышеназванные процедуры. Хотя процент рождения живых мышей невысок (20%), однако он вполне гарантирует восстановление линии, так как для этого достаточно лишь одной репродуктивной пары мышей (самки и самца). Вместе с тем восстановление линии только тогда может считаться возможным, когда подтверждается ее генетический статус. Контроль гомозигот-ности мышей по генам гистосовместимости показал отсутствие каких-либо изменений в геноме линейных мышей, т. е. все они гомозиготны. В пользу сохранения генетического статуса линии свидетельствует также отсутствие достоверной разницы по чувствительности между животными опытной и контрольной групп к действию мутагена в дозе 3 мг/кг.
Следовательно, можно констатировать, что цель работы достигнута, а именно — в условиях НЦ БМТ РАМН возможно создание криобанка эмбрионов мышей коллекционного фонда, способного гарантировать сохранность любой линии в него заложенной, какие бы перемены не имели место (неблагоприятная для жизни экология или болезни).
Выводы
1. Получены положительные результаты по криоконсервации эмбрионов мышей на доимплантационной стадии развития.
2. На выживаемость эмбрионов в жидком азоте (-196 °C) не оказали влияния ни срок хранения (от 1 до 4 лет), ни генотип животного.
3. Метод генетического контроля позволяет дать однозначный ответ на допустимость практического использования низкотемпературного замораживания эмбрионов, а именно возможность создания криобанка эмбрионов линий мышей коллекционного фонда НЦ БМТ РАМН.
Литература
1. Белоус A.M., Грищенко В. И., Паращук Ю. С. Криоконсервация репродуктивных клеток. Киев: Наукова думка, 1986, с. 207−211.
2. Бландова З. К., Душкин В Л., Малашенко A.M., Шмидт Е. Ф. Контроль гомозиготности инбредных линий мышей и крыс. В кн. Линии лабораторных животных для медикобиологических исследований. М.: Наука, 1983, с. 143−156.
3. Дыбан A.n. Опыты на зародышах млекопитающих. Методы биологии развития. М.: Наука, 1974, с. 217−245.
4. Клинский Ю. Д., Aлексеенко A. K Трансплантация зародышей сельскохозяйственных животных. Итоги науки и техники. Животноводство и ветеринария. М.: ВИНИТИ, 1972, т. 12, с. 84−89.
б. Малашенко A.М., Косарев A.В. Выбор линий мышей для тестирования химических мутагенов. Генетика, 1984, т. ХХ, № 8, с. 128.
6. Межевикина Л. М., Игнатьева Т. В., Вепрен-цев Б. Н. Выживаемость эмбрионов крыс и мышей при низкотемпературной консервации. Онтогенез, 1988, т. 19, № 5, с. 491−494.
7. Мельникова Е. В., Карнаухов В. Н., Дриняев В Л., Яшин В Л., Утешев В. К. Экспресс диагностика жизнеспособности яйцеклеток и зародышей млекопитающих. В кн. Консервация генетических ресурсов. Пущино, 1984, с. 1−21.
8. Пушкарь Н. С., Белоус А. М. Введение в криобиологию. Киев: Наукова думка, 1975, с. 334−337.
9. Семенов Х. Х., Игнатьева Е. Л. Криоконсервация эмбрионов — гарантия сохранения генофонда млекопитающих. Ланималогия, 1993, № 1, с. 88.
10. Суркова Н. И., Малашенко А. М. Мутагенный эффект тио-ТЭФ у лабораторных мышей IV. Влияние генотипа и пола на частоту индуцированных хромосомных аберраций в клетках костного мозга. Генетика, т. XI, № 1, 1975.
11. Шихов Н. Я., Сергеев М. И. Глубокое замораживание эмбрионов сельскохозяйственных животных. Сельскохозяйственная биология, 1982, т. XVII, № 3, с. 420−426.
12. Asahina E., Takahashi T. Survival of sea Urchin spermatozoa and embryos at very low temperatures. Cruobiology, 1977, v. 14, No. 6, 548 554.
13. Baust I.C., Lawrence A.L. Rapid freezing an assential criterion for the successful cryopre-servation of immature larve shrimp. Cryobiology, 1977, v. 14, No. 6, 705−710.
14. Bernard A., Fuller I. Cryopreservation of in vitro fertilized cell mouse embryos using a low glycerol concentration and normothemic cryoprotectant equlibration: a comparison with in vitro to fertilized ova. Crio-Lett., 1983, v. 4, No. 3, 171 178.
15. Betteriolge K.I. The importance of embryo or oocyte preservation in farm animal production and research. Cryobiology, 1979, v. 16, No. 6, 602−609.
16. Miyamoto H. Factors affecting the survival of mouse embryos during freezing and thawing. I. Vitro Festil and embryo transfer, 1986, v. 3, No. 1, 28−32.
17. Miyamoto H., Ishiboshi T. Survival of frozen thawed mouse and rat embryos in the presence of ethylene glycol. I. Reprod and Fertil, 1977, v. 50, No. 2, 373−375.
18. Miyamoto H., Okimasu E., Ishibashi T. Survival of mouse embryos after freezing to various low temperatures under different cryoprotective agents and cooling rates. I. Zootechn. Sci. 1979, v. 50, No. 5, 312−319.
19. Mobraaten Larry E. Mouse embriocryo-banking. I. Vitro Festil and embryo transfer. 1986, v. 3, No. 1, 28−32.
20. Roll W.F., Meyer T. K. Fracture damage to the zonae of mammalian embryos during cryopreservation and its avoidance. Cryobiology, 1986, v. 23, No. 6, 437−439.
21. Sheiton K., Craft I. The successful cryopreser-vation of in vitro fertilized mouse embryos. Cryo. Lett., 1982, v. 2, No. 6, 10, 305−310.
22. Trounson A. Comparative embryo transfer in Australia. Theriogenology, 1986, v. 19, No. 1, 13−29.
23. Willadsen S.M., Polge C., Rowson L.E., Moor R.M. Reservation of sheep embryos in liquid nitrogen. Cryobiology, 1974, v. 11, No. 6, 560−563.
24. Whittingham D.G. Survival of mouse embryos after freezing and thawing. Nature, 1971, v. 233, No. 5314, 125−126.
25. Wilmut I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci., 1972, v. 11, No. 6, 1071−1079.
26. Whittingham D.G., Whitten W.K. Long-term storage and eareal transport to frozen mouse embryos. I. Reprod. and Fertil, 1974, v. 36, No. 4, 433−435.
27. Whittingham D.G. Low-temperature storage of mammalian embryos. In: Basic aspects of freeze-preservation of mouse strains. Stuttgard, 1976, 44−45.
28. Whittingham D.G. Survival of mouse embryos frozen to -196 OC and -296 OC. Science, 1972, v. 178, No. 4, 411−414.
CRYOPRESERVATION OF MAMMALIAN EMBRYOS H.H. Semenov, E.L. Ignatieva, T.B. Beskova
Research Centre for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow
Method of criopreservation of mouse embryos for conservation of mouse strains and their genomes has been studied. It was found that keeping C57BL/6 inbred strain mice embryos in criobank (-196 OC) during
4 years did not affect viability and stability of genome.
Key words: cryopreservation, embryos, transplantation, chromosomes, aberrations.
102

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой