Особенности биохимической мацерации отечественного и импортного льняного сырья: закономерности расщепления полиуронидных соединений ферментами пектолитического комплекса

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Химия


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Биополимеры растений
УДК 581. 192:677. 11:577. 151. 04/36
ОСОБЕННОСТИ БИОХИМИЧЕСКОЙ МАЦЕРАЦИИ ОТЕЧЕСТВЕННОГО И ИМПОРТНОГО ЛЬНЯНОГО СЫРЬЯ: ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСЩЕПЛЕНИЯ ПОЛИУРОНИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ФЕРМЕНТАМИ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА
© С. В. Алеева, С.А. Кокшаров
Институт химии растворов РАН, ул. Академическая, 1, Иваново, 153 045 (Россия) e-mail: sva@jsc-ras. ru
Методом многофакторного регрессионного анализа получены индивидуальные корреляционные зависимости между показателями активности комплекса пектолитических ферментов и степенью расщепления пектина для нескольких видов волокнистых материалов отечественного и зарубежного производства, а также создана обобщенная модель с учетом степени метоксилирования полиуронидных цепей и содержания звеньев в кальций-пектатной форме. Данная корреляционная зависимость позволяет прогнозировать эффективность действия пектолитических препаратов по уровню активности присутствующих в них ферментов, а также осуществлять оптимизацию их состава для переработки льняного сырья с учетом особенностей химического строения полиуронидной клеящей основы связующих веществ в структуре комплексного льняного волокна.
Ключевые слова: лен-долгунец, пектиновые вещества, степень расщепления, пектиназный мультиэнзимный комплекс, активность ферментов, математическое моделирование.
Введение
Выявленное различие химического строения пектиновых веществ в структуре перерабатываемого льняного сырья [1] оказывает определяющее влияние на их способность к биокатализируемой гидролитической деструкции, которая, согласно современным представлениям [2], подчиняется общим закономерностям последовательно-параллельного действия ферментов-деполимераз. Как показано на рисунке 1, этот процесс осуществляется с участием четырех компонентов пектиназного мультиэнзимного комплекса (МЭК): ферментов эндополигалактуроназа, экзополигалактуроназа и экзополигалактуронозидаза, воздействующих на а-1,4-гликозидные связи в цепи главных валентностей полимера, а также пектинэстеразы, катализирующей расщепление эфирной связи в метоксилированных звеньях полиуронида. В зависимости от соотношения неэтерифицированной и метоксилированной форм мономерных звеньев в исходном пектине, обозначенном как [ГК-(Н- CH3)]n, преобладающим является один из двух маршрутов начальной стадии разрушения субстрата, которые различаются последовательностью действия эндополигалактуроназы и пектинэстеразы.
Маршрут (I) реализуется при наличии в полимере достаточного количества остатков свободной галакту-роновой кислоты. Присутствие метоксилированных звеньев в пектине нарушает его комплементарность в отношении деполимеризующих биокатализаторов и препятствует действию последних. В связи с этим гидролиз эфирных связей с участием пектинэстеразы в равной степени необходим как для перевода метоксили-рованных олигомеров (ГК-СН3)т в фрагменты полигалактуроновой кислоты (ГК)т, расщепляемые экзогенными ферментами до низкомолекулярных продуктов ГК и ГК2, так и для эффективной деструкции высоко-метоксилированного полимера по маршруту (II), предполагающему предварительный перевод субстрата в форму полигактуроновой кислоты (ГК-Н)П.
* Автор, с которым следует вести переписку.
[гК-(Н- СН-
X экзополи-галактуроназа
экзополига-, л актуро нозидаза
гк + сгки,
----т---------•
галактуроназа
экзополи-
экзополи-
галактуроназа
Рис. 1. Механизм конверсии пектина под действием ферментов пектолитического мультиэнзимного
При воздействии полиферментных пектолитических препаратов деструкция полиуронидных соединений осуществляется с параллельной реализацией маршрутов (I) и (II). Однако роль ферментов пектиназного МЭК при расщеплении пектиновых веществ в структуре льняного волокна до настоящего времени не выяснена, что определяет актуальность проведенного исследования.
Экспериментальная часть
Ферментативной обработке подвергались ранее исследованные [1] образцы чесаного голландского, бий-ского, вологодского и калужского льняного волокна, перерабатываемого на предприятии ОАО «Вологодский текстиль».
Ферментные препараты получены совместно с сотрудниками кафедры микробиологии Ивановской государственной медицинской академии в виде фильтратов культуральной жидкости бактериальных штаммов
В. с1гси1ат В. зиЫШз, Егу. саг^оуога из коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетики. Варьирование соотношения компонентов пектиназного МЭК достигалось изменением условий культивирования микроорганизмов, адсорбционным отделением эндополигалактуроназ при пропускании раствора через колонку с мелкодисперсным яблочным пектином, а также препарацией смесовых композиций.
Активность растворов пектолитических препаратов, содержащих компоненты пектиназного МЭК, оценивали по отношению к 1%-ному раствору модельных субстратов в соответствии с рекомендациями [4] следующими методами:
— пектинэстеразную активность (ПЭ, ед. /мл) — по количеству освобожденных карбоксильных групп на основании измерения скорости гидролиза сложноэфирных связей в макромолекуле высокометоксилирован-ного яблочного пектина- после одночасовой ферментации субстрата проводили потенциометрическое титрование 0,1 н раствором №ОИ-
— активность эндополигалактуроназы (эндоПГ, ед. /мл) — по снижению вязкости тестового раствора поли-галактуроновой кислоты в ходе ферментации- замеры вязкости реакционной смеси осуществляли на термо-статируемом при 30,0+0,1оС вискозиметре ВПЖ-2 с диаметром капилляра 0,8 мм-
— активность экзогенных ферментов (экзоПГ, ед. /мл) в связи с отсутствием возможности раздельной оценки экзополигалактуроназы и экзополигалактуронозидазы при одновременном их присутствии в поли-ферментной композиции определяли совокупно по увеличению числа концевых альдегидных групп при ферментативной деструкции полигалактуроновой кислоты с использованием метода обратного титрования раствором тиосульфата натрия.
Для оценки эффективности биодеструкции пектиновых примесей ферментативную обработку волокна осуществляли растворами энзимных препаратов с варьируемыми показателями их каталитических свойств в диапазонах ПЭ = 0,03−0,8 ед. /мл- эндоПГ = 0,2−27,9 ед. /мл и экзоПГ = 0,05−0,45 ед. /мл в течение 2 ч при температуре 40 °C, рН 6,5 и модуле ванны 1: 10. Для извлечения водорастворимых фракций расщепленного пектина волокно промывали теплой (40 °С) водой без использования вспомогательных веществ, высушивали на воздухе и определяли остаточное содержание полиуронидных соединений. Содержание пектина в волокне оценено методом [3] по поглощению света окрашенным комплексом полиуронидов с о-толуидином при длине волны 360 нм.
комплекса
Для получения корреляционных зависимостей между свойствами биопрепаратов и интенсивностью ферментативного гидролиза полиуронидных субстратов использовали математический аппарат многофакторных линейных регрессий (программа S-PLUS 2000 Professional).
Обсуждение результатов
В таблице представлены совокупность характеристик применяемых растворов полиферментных препаратов и результаты воздействия полученных технологических композиций для всех разновидностей анализируемых льняных волокнистых материалов. Следует заметить, что специфика методов определения активности разных видов ферментов предполагает возможность сравнения каталитических свойств только в рамках отдельного показателя, в связи с этим оптимизация содержания компонентов МЭК в системе проводится индивидуально для каждого из них, без сопоставления абсолютных значений между показателями. Диапазоны варьирования активности ферментов подобраны с учетом технологически необходимого удаления пектиновых примесей при подготовке льняного волокна к прядению на уровне 70−80% с остаточным их содержанием, обеспечивающим связывание не обладающих природной сцепляемостью элементарных волокон в сформированной пряже и получение необходимых прочностных показателей текстильного полуфабриката.
Сопоставление вклада индивидуальных ферментов пектолитического МЭК в эффективность деструкции полиуронидов анализируемых видов льняного волокна позволило подтвердить превалирующую роль пекти-нэстеразы и эндополигалактуроназы в процессе извлечения пектинов из волокнистой матрицы. Нетрудно видеть, что увеличение пектинэстеразной активности ферментного препарата в 2,3−2,9 раза обеспечивает прирост показателя степени расщепления пектина ДП для всех видов волокна в 1,2−1,3 раза (строки 2 и 5- 10 и 15 таблицы). При этом основное деполимеризующее действие на пектин оказывает фермент эндополига-лактуроназа, и эквивалентное (в 2,5 раза) повышение активности эндоПГ сопровождается увеличением степени удаления пектина в 1,6−1,7 раза (строки 7 и 10- 12 и 15). В случае отсутствия в препарате эндогенного фермента (строки 6 и 11) величина ДП для разных видов льняного волокна незначительна и определяется извлечением водорастворимых фракций полиуронидов, деполимеризованных на стадии первичной обработки растительного сырья в условиях лугового расстила.
Влияние состава пектиназного комплекса на деструкцию полиуронидных веществ при обработке голландского (ДПГ), бийского (ДПб), вологодского (ДПВ) и калужского (ДПк) льняного волокна
№ Активность биопрепарата, ед. /мл Степень расщепления пектинов, %
п/п ПЭ эндоПГ экзоПГ ДПГ ДПб ДПв ДПк
1 0,03 17,8 0,20 Зб 2б 23 21
2 0,12 17,8 0,20 4б 38 34 37
3 0,23 17,8 0,20 49 41 37 40
4 0,29 17,8 0,20 50 42 38 42
5 0,35 17,8 0,20 52 43 40 43
б 0,35 0,2 0,27 20 17 15 1б
7 0,35 11,1 0,27 42 Зб 34 Зб
8 0,35 12,3 0,27 44 38 35 37
9 0,35 17,9 0,27 52 44 40 44
10 0,35 27,9 0,27 бб 55 49 55
11 0,80 0,2 0,22 20 20 20 20
12 0,80 11,1 0,22 4б 43 41 43
13 0,80 12,3 0,22 48 44 42 44
14 0,80 17,9 0,22 57 51 47 51
15 0,80 27,9 0,22 78 б8 бЗ 70
1б 0,29 12,3 0,05 40 34 32 34
17 0,29 12,3 0,22 42 Зб 33 35
18 0,29 12,3 0,33 43 35 33 Зб
19 0,29 12,3 0,45 42 Зб 33 Зб
20 0,40 27,7 0,05 71 б0 55 б1
21 0,40 27,7 0,22 73 б2 5б бЗ
22 0,40 27,7 0,33 74 бЗ 57 б4
23 0,40 27,7 0,45 75 б4 58 б5
Варьирование показателя экзогенной активности препарата при низких значениях ПЭ и эндоПГ практически не оказывает влияния на степень извлечения полиуронидов из волокнистого материала (строки 1619). Вместе с тем при увеличении содержания технологически значимых ферментов пектинэстеразы и эндо-полигалактуроназы наращивание показателя экзоПГ способствует повышению эффективности обработки (строки 20−23), что свидетельствует о наличии кооперативного действия эндо- и экзогенных деполимераз при расщеплении твердофазных полиуронидных примесей волокнистого материала.
Логично предположить, что для извлечения пектиновых веществ из волокна полная конверсия полимеров до низкомолекулярных продуктов не требуется и достаточно обеспечить их деструкцию до экстрагируемых олигомерных фракций (ГК)т. Вместе с тем накопление в системе олигомеров повышает вероятность неполного высвобождения активного центра фермента от продуктов реакции, что схематически представлено на рисунке 2. При этом активная полость глобулы биокатализатора блокируется без перекрытия реакционного центра, изображенного на схеме незафонованным символом, что препятствует участию фермента в новых каталитических актах.
Для предупреждения временной потери активности эндополигалактуроназы необходимо дальнейшее расщепление олигомеров под действием экзогенных ферментов. Это способствует смещению равновесного процесса разрыва фермент-субстратного комплекса с высвобождением продуктов реакции и регенерацией фермента, что и лежит в основе синергизма в действии эндо- и экзогенных деполимераз.
Для количественной оценки индивидуального вклада ферментов пектолитического МЭК в процесс удаления клеящих веществ из текстильного материала и их кооперативного действия проведена математическая обработка совокупности экспериментальных данных таблицы методом регрессионного анализа. Вид корреляционной зависимости выбран в соответствии с уравнениями, предложенными для оценки степени деструкции примесей крахмальной шлихты амилолитическими препаратами [5]. В частности, эффективность удаления пектина из голландского льняного волокна описывается следующим уравнением:
АПГ = 13,88+1,53- ПЭ+1,99 • эндоПГ+1,78- экзоПГ+16,73-
эндоПГ- экзоПГ эндоПГ+ экзоПГ
, г = 0,9871.
Синергизм в действии деполимеризующих эндо- и экзоферментов в уравнении выражен в виде отношения произведения показателей активностей биокатализаторов к их сумме. Используемый вид данного члена уравнения адекватно отражает его физический смысл — преумножение влияния факторов в сравнении с их аддитивным увеличением и позволяет описать экспериментальные данные с достаточно высокой степенью корреляции.
Варианты учета возможного синергизма между полигалактуроназами и пектинэстеразой не позволили получить удовлетворительное описание процесса, поскольку при низких значениях коэффициента корреляции в уравнениях появлялись отрицательные значения причленных множителей, что исключено ввиду позитивного влияния каждого вида ферментов на расщепление полимера.
Рис. 2. Схема образования неактивных форм (1, 2) фермент-субстратного комплекса при накоплении в системе продуктов биокатализируемого расщепления полиуронидов
Значения причленных множителей у показателей активности отдельных видов ферментов в уравнении отражают их весомость в осуществлении деструкции пектиновых примесей волокна. Сравнительный анализ этих величин с учетом абсолютного значения каталитической активности биопрепарата позволил подтвердить очевидное преимущественное значение эндополигалактуроназы при разрушении пектиновых веществ голландского льняного волокна, характеризующихся относительно низким долевым содержанием метокси-лированых звеньев в полимерной цепи — О (ГК-СНз) = 0,38. При этом превалирующая роль в деструкции твердофазного полимера до водорастворимых продуктов принадлежит кооперативному действию эндо- и экзогенных деполимераз. Величина расчетного коэффициента данного слагаемого в уравнении максимальна и превышает значения причленных множителей при показателях активности эндоПГ, экзоПГ и ПЭ соответственно в 8,4- 9,4 и 10,9 раза.
Аналогичные корреляционные зависимости между показателями активности ферментов и достигаемой степенью расщепления полиуронидных примесей получены для исследуемых видов отечественного льняного волокна:
При этом установлено, что удаление пектиновых примесей также определяется действием эндогенной полигалактуроназы (эндоПГ) и усиливается экзоферментами. Вместе с тем существенно возрастает роль фермента пектинэстераза, обеспечивающего перевод гидролизуемого субстрата в деметоксилированное состояние. Причем величина множителя при показателе ПЭ возрастает по мере увеличения степени этерифи-кации полиуронидных соединений в анализируемых образцах волокнистых материалов: по данным [1], величина в (ГК-СН3) пектиновых веществ для бийского, вологодского и калужского льняного сырья составляет соответственно 0,54- 0,59 и 0,61.
Обращает на себя внимание общая для всех видов обрабатываемого льняного волокна закономерность, выражающаяся в том, что величина множителей при индивидуальных показателях активности эндо- и экзогенных деполимераз и «кооперативном» члене уравнения находится в обратно пропорциональной зависимости с величиной долевого содержания кальций-пектатных форм мономерных звеньев в (ГК-Са) в гидролизуемом пектине (в голландском, бийском, калужском и вологодском льне — соответственно 0,10- 0,17- 0,20 и
0,22). Проявление подобной взаимосвязи вполне закономерно, поскольку участки полимерных цепей, соединенные кальциевыми мостиками, недоступны для действия пектолитических ферментов.
Для учета особенностей химического строения пектиновых веществ при их ферментативной деструкции создана обобщенная математическая модель для всех видов льняного волокна, отражающая влияние меток-силированных и кальций-пектатных форм мономерных звеньев полиуронидов на проявляемую активность пектолитических ферментов:
В связи с нерегулярным строением полиуронидов льняного волокна каждый компонент пектиназного МЭК способен оказывать каталитическое влияние лишь на определенные структурные фрагменты полимерного субстрата: пектинэстераза — на метоксилированные участки полимерной цепи- эндо- и экзодеполимеразы — на связи между незамещенными звеньями галактуроновой кислоты. Математическая обработка данных
ДПБ = 5,66+22,57- ПЭ+1,51- эндоПГ+1,06 • экзоПГ+11,33
эндоПГ экзоПГ
, г = 0,9597-
эндоПГ+ экзоПГ
АПВ = 4,58 + 22,63 • ПЭ +1,41- эндоПГ + 0,82 • экзоПГ + 8,48
эндоПГ • экзоПГ
, г = 0,9680 —
эндоПГ + экзоПГ
АПК = 6,24 + 22,71- ПЭ+1,47 • эндоПГ+ 0,85 • экзоПГ+ 8,65
эндоПГ• экзоПГ
, г = 0,9514.
эндоПГ+ экзоПГ
эндоПГ • экзоПГ
-|1−0(ГК-Са)
+ 5,47
эндоПГ + экзоПГ
, г = 0,9730.
с использованием различных вариантов выражения взаимосвязи каталитических свойств биопрепарата с химическим строением полиуронидов позволила установить, что возведение показателей активности энзимов пектиназного МЭК в степень долевого содержания соответствующих фракций пектина наиболее адекватно отражает физический смысл действия ферментов, природа которого определяется состоянием карбоксильных групп в пектиновых веществах.
В частности, член уравнения, характеризующий весомость действия фермента пектинэстераза, позволяет учесть деструкцию только полиуронидных звеньев в этерифицированной форме, непосредственно участвующих в данном каталитическом акте. При этом чем выше степень метоксилирования полиуронида, тем больше вклад пектинэстеразы в процесс деструкции субстрата. При выражении действия деполимеризующих ферментов в степенном виде соответствующие слагаемые уравнения учитывают долю реакционноспособных участков полимерной цепи, потенциально подлежащих расщеплению, т. е. за вычетом количества мономерных звеньев, связанных кальциевыми мостиками. Примечательно, что в обобщенной зависимости соотношение величин причленных множителей каждого из слагаемых согласуется с тенденцией распределения весомости вклада компонентов МЭК в процесс деполимеризации пектина в уравнениях для отдельных видов волокнистого материала. Это обстоятельство наряду с высоким значением коэффициента корреляции полученной обобщенной зависимости подтверждает адекватность выбранного вида математической модели.
Полученная корреляционная зависимость имеет важное научно-практическое значение, поскольку позволяет прогнозировать эффективность действия пектолитических препаратов по уровню активности присутствующих в них ферментов и определять необходимую продолжительность их воздействия. С помощью обобщенного уравнения можно осуществлять оптимизацию состава полиферментных систем для переработки определенных видов льняного сырья с учетом особенностей химического строения полиуронидной клеящей основы связующих веществ в структуре комплексного льняного волокна.
Выводы
1. На основании сравнительного анализа индивидуальных закономерностей между показателями активности применяемого комплекса гидролитических ферментов и степенью расщепления пектина для различных видов волокнистых материалов отечественного и зарубежного производства оценен вклад отдельных видов ферментов в осуществление деструкции пектиновых примесей:
— при ферментативной деструкции низкометоксилированного пектина, выделенного из голландского льна, превалирующую роль играет член уравнения, характеризующий кооперативное участие эндо- и экзогенных деполимераз в разрушении твердофазного полимера до водорастворимых продуктов-
— для пектинов из отечественного сырья, являющихся высокометоксилированными соединениями, доминирующий вклад в деструкцию полимерного субстрата вносит член уравнения, учитывающий эффективность гидролиза эфирных связей в метоксилированных звеньях полимера под действием фермента пектинэ-стераза.
2. Получена обобщенная корреляционная зависимость деструкции полиуронидных соединений по показателям активности индивидуальных ферментов, которая позволяет прогнозировать эффективность действия пектолитических препаратов в процессах переработки волокнистых материалов отечественных и импортных сортов льняного сырья с учетом содержания в пектинах метоксилированных и кальций-пектатных форм мономерных звеньев.
Список литературы
1. Алеева С. В., Кокшаров С. А. Особенности биохимической мацерации отечественного и импортного льняного сырья: сопоставительный анализ химического строения пектиновых веществ // Химия растительного сырья. 2010. № 3. С. 11−16.
2. Грачева И. М., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. М., 2000. 512 с.
3. Отделка хлопчатобумажных тканей / под ред. Б. Н. Мельникова. М., 1991. 432 с.
4. Рухлядева А. П., Полыгалина Г. В. Методы определения гидролитических ферментов. М., 1981. 290 с.
5. Алеева С. В., Сибирев А. Л., Кокшаров С. А. Закономерности расщепления крахмальной шлихты мультиэнзим-
ными амилолитическими препаратами // Известия вузов. Химия и химическая технология. 2004. Т. 47, № 4.
С. 77−81.
Поступило в редакцию 17 сентября 2009 г.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой