Лазерная гипертермия опухолей с нанотермосенсибилизаторами

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ЕРМИЯ ОПУХОЛЕЙ: ЕНСИБИЛИЗАТОРАМИ
. Сироткина, младший научный сотрудник НИИ ПФМ1-
В. В. Елагин, младший научный сотрудник НИИ ПФМ1-
М. В. Ширманова, младший научный сотрудник НИИ ПФМ1-
М. Л. Бугрова, к.б.н., научный сотрудник НИИ ПФМ1-
Л. Б. Снопова, к.б.н., старший научный сотрудник НИИ ПФМ1-
В А Надточенко, д.х.н., главный научный сотрудник2-
В А Каменский, к.ф. -м.н., ведущий научный сотрудник3-
Е. В. Загайнова, д.м.н., зам. директора НИИ ПФМ1
1 Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород-
2Институтхимической физики им. H.H. Семенова РАН, Москва-
3 Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород
Цель работы — исследование возможности использования золотых наночастиц для проведения локальной лазерной гипертермии опухоли.
Материалы и методы. Исследование выполнено на 16 самках мышей линии СВА с перевитым раком шейки матки. Животным внутривенно вводили раствор золотых наночастиц объемом 0,2 мл с концентрацией 109 частиц/мл. Размер частиц составлял 200−250 нм- максимум экстинкции, связанный с плазмонным резонансом, находился на длине волны 850−950 нм. Наблюдение проникновения наночастиц в опухолевый узел осуществляли методом оптической когерентной томографии. В период максимального накопления наночастиц в опухоли проводили гипертермию на лазерной установке ЛСП-АЗОР, генерирующей излучение в непрерывном режиме на длине волны 810 нм. Длительность воздействия на опухоль составляла 20 мин. Противоопухолевый эффект проводимого воздействия оценивали по торможению роста опухоли.
Результаты. Определение момента достижения максимальной концентрации наночастиц в опухолевой ткани позволило наиболее эффективно осуществить лазерное воздействие. Использование наночастиц в качестве термосенсибилизаторадало возможность снизить мощность лазерного излучения и обеспечить локальность воздействия.
Ключевые слова: золотые наночастицы, лазерная гипертермия, оптическая когерентная томография, ИК-термография.
English
Laser hyperthermia of tumors with nanothermosensibilizers
MA Sirotkina, junior scientific worker of the AFM SRI1- V.V. Elagin, junior scientific worker of the AFM SRI1-
M.V. Shirmanova, junior scientific worker of the AFM SRI1- M.L. Bugrova, c.b.s., scientific worker of the AFM SRI1-
L.B. Snopova, c.b.s., scientific worker of the AFM SRI1- VA Nadtochenko, ChD, head scientific worker2-
VA Kamensky, c. phm.s., leading scientific worker3-
E.V. Zagainova, MD, deputy director of the AFM SRI1
Для информации: Сироткина МаринаАлександровна, тел. раб. 8(831)465−41−13.
1 Nizhny Novgorod state medical academy, N. Novgorod-
2 N.N. Semyonov Institute of chemical physics of the RAS, Moscow-
3 Institute of applied physics of the RAS, N. Novgorod
Aim of work is investigation of the gold nanoparticle use possibility for a local laser hyperthermia of tumor.
Materials and methods. The investigation is made on 16 female-mice of the CBA line with a twisted cancer of the neck of the uterus. A solution of gold nanoparticles with a 0.2 ml volume with a concentration of 109 particles/ml was intravenously infused into the animals. The particle size was 200−250 nm- a maximum of extinction, connected with a plasma resonance, was at the wavelength of 850−950 nm. An observation of the nanoparticle penetration to a tumoral node was accomplished by a method of optical coherent tomography. A hyperthermia at the LSD-AZOR laser apparatus, generating radiation in a continuous mode at a wavelength of 810 nm, has been conducted in a period of the nanoparticle maximum accumulation in a tumor. The duration of effect to a tumor was 20 min. The antitumoral result of effect was assessed according to the tumor growth inhibition.
Results. A detection of a moment of the nanoparticle maximum concentration in a tumoral tissue achievement has permitted a more effective laser effect. The nanoparticle use as a thermosensibilizer has permitted to decrease a laser radiation power and provide a local effect.
Key words: gold nanoparticles, laser hyperthermia, optical coherent tomography, IR-thermography.
Метод лазерной гипертермии является одним из перспективных в лечении онкологических заболеваний. Из-за патологического строения сосудов злокачественных опухолей при лазерном нагреве развиваются сосудистый стаз и многочисленные тромбозы и, как следствие, происходит значительное повышение температуры, в то время как в нормальных тканях скорость перфузии и вместе с ней теплоотдача возрастает линейно с ростом температуры. Нарушение кровотока в солидных опухолях и хроническая гипоксия значительно повышают термочувствительность опухолевых клеток и уже при температуре 43,5°С происходят необратимые повреждения клеток опухоли [1].
Однако существенным недостатком стандартной гипертермии является отсутствие избирательного действия, поскольку наряду с опухолевыми клетками нагреваются здоровые ткани вокруг опухоли. С развитием нанотехнологий гипертермия получила новые возможности. Для локализации процесса гипертермии все чаще применяют термосенсибилизаторы: магнитные или плазмонно-резонансные наночастицы, которые вводят в кровоток или непосредственно в опухолевый узел. Накопление наночастиц в опухолевой ткани резко повышает градиент температуры между опухолью и окружающими здоровыми тканями, обеспечивая локальность нагрева. Это делает лазерное воздействие прицельным и снижает его негативное влияние на нормальные ткани.
Плазмонно-резонансные наночастицы обладают уникальным свойством — способностью возбуждать локализованный поверхностный плазмонный резонанс в видимой или ближней ИК-области спектра, что приводит к повышенному поглощению и/или рассеянию ими зондирующего излучения [2]. При поглощении лазерного излучения такие частицы способны генерировать тепловую энергию, что позволяет снизить дозу лазерного излучения.
Существует возможность настройки спектрального положения и амплитуды плазмонного резонанса за счет изменения природы металла, размера, формы, структуры частиц и их диэлектрического окружения. Таким
образом, путем варьирования различных параметров таких наночастиц можно контролировать длину волны плазмонного резонанса и получать частицы с заданными оптическими свойствами [3, 4].
Немаловажным достоинством этих наночастиц является низкая токсичность, что делает их безопасными для применения в живых организмах. К тому же, в силу своего размера, они обладают высокой способностью проникать внутрь опухоли через эндотелий капилляров и накапливаться. Эта способность обусловливает феномен избирательного накопления наночастиц в опухоли [5].
Однако, несмотря на рост использования наночастиц в качестве термосенсибилизаторов и быстрое развитие этого направления, вопрос о распределении их в организме и накоплении в опухолевом узле остается до конца не изученным.
В настоящее время для исследования биораспределения и селективного накопления наночастиц в опухоли используют такие методы, как световая [6], электронная, конфокальная [7], многофотонная [8] микроскопия, количественный анализ проводят методами атомно-абсорбционной спектрометрии [9], нейтронноактивационного анализа [10]. Данные методы являются трудоемкими и дорогостоящими, требуют большого количества экспериментального материала и не позволяют проводить прижизненное исследование. Распределение наночастиц в условиях живого организма может быть изучено методом магнито-резонансной томографии, но для этого наночастицы должны быть мечены гадолинием [11]. Золотые наночастицы, обладающие поверхностным плазмонным резонансом, могут быть детектированы методом поверхностно-усиленной Ра-ман-спектроскопии. Так, в работе X. Qian использовали данный метод для наблюдения накопления наночастиц в опухолевом узле и печени при пассивной и направленной доставке [12].
Оптические методы визуализации чувствительны к изменению поглощающих или рассеивающих характеристик биоткани, поэтому позволяют безопасно и быстро исследовать проникновение и накопление нано-
частиц в биоткани на живых объектах [13−15]. К тому же они признаны безопасными, поскольку в качестве зондирующего излучения используют свет ближнего ИК-диапазона.
В частности, метод оптической когерентной томографии (ОКТ) позволяет по изменению оптических характеристик визуализировать процесс взаимодействия наночастиц с биотканями. ОКТ — это высокоразрешающий метод получения изображения внутренней микроструктуры тканей. Основной принцип его заключается в регистрации рассеянного тканью зондирующего излучения и построении изображения поперечного сечения исследуемой ткани. Современные ОКТ-устройства обеспечивают визуализацию структур биотканей на глубину до 2 мм с пространственным разрешением в несколько микрометров [16]. Объектами для ОКТ-исследований являются преимущественно покровные ткани — кожа и слизистые оболочки внутренних органов.
Цель работы — исследование возможности использования золотых наночастиц для проведения локальной лазерной гипертермии опухоли.
Материалы и методы.
Животные. Исследование выполнено на 16 самках мышей линии СВА массой 25−30 г. Модель неоплазии создавали путем подкожной перевивки опухолевого штамма рака шейки матки (РШМ 5). Исследование начинали проводить, когда опухолевый узел хорошо пальпировался и достигал размера 10 мм. Предварительно перед началом исследования проводили депиляцию участка кожи в районе опухолевого узла. Животных разделили на две группы. В опытной группе (12 животных) мышам в хвостовую вену ввели раствор наночастиц в объеме 0,2 мл. В контрольной группе (4 животных) одновременно с опытными животными также внутривенно ввели физиологический раствор в объеме 0,2 мл.
Наночастицы. В качестве термосенсибилизатора использовали коллоидный раствор плазмонно-резонанс-ных золотых наночастиц типа бипирамиды, стабилизированных хитозаном. Размер частиц- 200−250
нм (рис. 1, а), концентрация в растворе составляла 109 частиц/мл. Максимум экстинкции наночастиц находился на длине волны 850−950 нм (рис. 1, б). Эти оптические характеристики оптимальны для проведения гипертермии, а также для визуализации методом ОКТ. Размер и форму наночастиц определяли методом электронной микроскопии.
Оптический контроль накопления наночастиц в опухоли. Исследование накопления наночастиц в опухоли выполнено на оптическом когерентном томографе, разработанном в ИПФ РАН (Нижний Новгород). Данный прибор имеет следующие характеристики: длина волны зондирующего излучения- 900 нм, мощность — 2 мВт, пространственное разрешение — 15−20 мкм, глубина визуализации -до 1,5 мм, время получения одного изображения- около 2 с. Прибор предназначен для получения изображения микроструктуры биотканей на основе низкоинтенсивной интерферометрии [16].
Непосредственно перед проведением лазерной гипертермии прижизненно и неинвазивно осуществляли ОКТ-контроль накопления наночастиц в опухоли, поскольку очевидно, что для достижения желаемого терапевтического эффекта важно проводить воздействие в период максимального накопления.
Для этого ОКТ-зонд устанавливали на поверхность кожи над опухолью перпендикулярно, с контролируемым небольшим прижимом. ОКТ-исследование проводили без применения дополнительных просветляющих агентов.
Контрольные ОКТ-изображения опухоли получали перед инъекцией наночастиц. Затем, после их введения, процесс накопления в опухоли наблюдали путем многократного получения ОКТ-изображений. Для этого поверхность опухолевого узла условно делили на 5 областей: верхнюю, нижнюю, правую, левую и центр. Из каждой области снимали по 3 изображения, таким образом получали по 15 ОКТ-изображений каждые 30 мин. Длительность исследования составляла 5 ч.
а 6
Рис. 1. Электронная микрофотография золотых наночастиц, ув. 18 ООО (а) и спектр экстинкции (б)
Аналогично проводили ОКТ-исследование животных в контрольной группе.
Накопление наночастиц в опухоли оценивали визуально по увеличению интенсивности сигнала на ОКТ-изображениях, для чего сравнивали интенсивность ОКТ-сигналов на получаемых и контрольном (до введения наночастиц) изображениях. Высокий уровень ОКТ-сигнала на ОКТ-изображениях обусловлен наличием плазмонно-резонансных наночастиц в опухоли, которые являются источниками дополнительного обратного рассеяния. Период времени, когда наблюдаются наибольшие значения ОКТ-сигнала и глубины проникновения зондирующего излучения, характеризуется максимальным накоплением наночастиц в опухоли и оптимально подходит для проведения сеанса лазерной гипертермии.
Лазерная гипертермия. Для нагрева биоткани использовали медицинский лазер портативный одноволновой, ЛСП-АЗОР со сменным оптическим волокном. Для осуществления термотерапии работу лазера проводили в непрерывном режиме излучения на длине волны 0,81 мкм. Диапазон выходной мощности в непрерывном режиме регулировался от 0,5 до 15 Вт.
Для визуализации температурных изменений опухоли во время лазерной гипертермии с возможностью последующей компьютерной обработки использовали портативный компьютерный термограф ИРТИС-2000 МЕ, охлаждаемый жидким азотом. Температурное разре-
шение прибора- 0,02°С, время формирования кадра — 0,8 с.
Животным опытной группы в момент максимального накопления наночастиц в опухоли проводили однократный сеанс лазерной гипертермии. Для достижения терапевтического эффекта температуру опухоли поддерживали на постоянном уровне 44−45°С в течение 20 мин. При этом световой пучок диаметром около 1 см охватывал всю поверхность опухоли. Нагрев опухоли проводили под непрерывным контролем ИК-термогра-фа, который фиксировал интегральное значение температуры с поверхности кожи. В режиме реального времени на монитор компьютера выводилось изображение, получаемое каждые 3 с. В результате в память компьютера записывалась непрерывная серия изображений. Животным в контрольной группе воздействия на опухоль не оказывали.
После окончания лазерной гипертермии у животных из опытной группы производили забор образцов опухолевой ткани. Методом электронной микроскопии проводили верификацию наночастиц в этих образцах.
После сеанса лазерной гипертермии оценивали противоопухолевый эффект по торможению роста опухоли.
Результаты и обсуждение.
Оптический контроль накопления наночастиц в опухоли. ОКТ-изображение опухоли, врастающей в кожу (рис. 2), представляет собой однородную область со средним уровнем сигнала, кожа на изображении не
Рис. 2. ОКТ-исследование накопления наночастиц в опухоли, врастающей в кожу: а — гистологическое изображение опухоли (окраска гематоксилином и эозином, ув. 40) — б- ОКТ-изображение опухоли до введения наночастиц- в — ОКТ-изображение через 2 ч после инъекции- г- ОКТ-изображение опухоли через 4 ч после инъекции
идентифицируется (рис. 2, б). Первые 2 ч после инъекции наночастиц никаких изменений на ОКТ-изображениях опухоли не наблюдали. Через 2−2,5 ч после внутривенного введения в обеих группах наблюдалось постепенное увеличение ОКТ-сигнала и возрастание глубины визуализации. Максимальная выраженность этих изменений отмечалась через 4−5 ч, что соответствует максимальному накоплению в опухоли наночастиц.
Наличие наночастиц в опухолевой ткани подтверждено методом электронной микроскопии (рис. 3). Наночастицы обнаружены внутри опухолевых клеток: в цитоплазме и ядре.
Таким образом, ОКТ-исследование выявило время максимального накопления наночастиц в опухоли (4- 5 ч), которое является оптимальным для проведения лазерной гипертермии.
Лазерная гипертермия. Начальная мощность лазера, при которой происходит нагрев опухоли до 44 °C за несколько минут, была подобрана на модельном экспе-
рименте и составила 1,2 Вт. В случае лазерной гипертермии опухоли с наночастицами необходимая температура опухоли достигалась при мощности лазера 1,2 Вт, затем мощность уменьшалась до 1 Вт и оставалась такой в течение 20 мин — это позволяло поддерживать постоянную температуру в опухоли на протяжении всего сеанса гипертермии. При нагреве опухоли без наночастиц мощность лазера была постоянной в течение всего времени воздействия и составляла 1,2 Вт.
Отмечено, что нагрев опухоли до 44 °C при равных условиях воздействия происходил за 3−4 мин в группе опытных животных (с введением наночастиц) и более чем за 10 мин — в контрольной группе.
С помощью ИК-термографии установлено, что в случае проведения гипертермии опухоли, меченной золотыми наночастицами, наблюдался локальный нагрев опухолевого узла (рис. 4), в то время как при их отсутствии происходило диффузное распространение тепла из зоны опухоли в окружающие здоровые ткани.
Видимых повреждений опухоли (ожог, гиперемия) во
¦& lt-«
*•
л 1
Р & gt- ' • & lt-: *
'- & quot-Д-*¦
: Я
Рис. 3. Электронные микрофотографии опухолевой ткани. Золотые наночастицы показаны стрелками: а — наночастицы в ядре (ув. 7100) — б — наночастицы в цитоплазме опухолевой клетки вблизи ядра (ув. 44 ООО)
Рис. 4. Температурное распределение в биотканях при проведении лазерной гипертермии опухоли, содержащей наночастицы (б) и без наночастиц (г). Фотографии айв демонстрируют расположение опухолевого узла на теле животных
1Л-3,
°& gt--гЧ ¦: J

аз-Е|
время проведения сеанса гипертермии и после него не наблюдали. Через сутки в центре воздействия лазерного пучка появились некротические изменения в виде белого пятна с красным контуром (рис. 5, а). Через 3 сут размер пятна увеличивался и формировалась некротическая геморрагическая корка (рис. 5, б).
Лазерная гипертермия с нанотермосенсибилизаторами оказала выраженный противоопухолевый эффект. Торможение роста опухоли составило 53% на 8-е сутки после воздействия.
Заключение. Доказана эффективность проведения прижизненного и неинвазивного мониторинга накопления плазмонно-резонансных золотых наночастиц в экспериментальной опухолевой модели методом оптической когерентной томографии. Посредством анализа визуальных изменений установлено время максимального накопления наночастиц в опухоли — 4−5 ч после внутривенной инъекции. Применение наночастиц позволило более эффективно и прицельно осуществить лазерное воздействие на опухоль, обеспечить его локальность и снизить мощность лазерного излучения.
Полученные данные о торможении роста опухоли свидетельствуют о положительном лечебном эффекте лазерной гипертермии в сочетании с плазмонно-резо-нансными наночастицами.
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям (ГК 02. 512. 11. 2244), грантов РФФИ (09−02−97 072, 09−212 215, 09−02−539, 09−02−90 736), президентского гранта МД-3018. 2009.7.
Литература
1. Гзнфольд М. Л., Барчук А. С. Лазерная селективная гипертермия в лечении злокачественных новообразований. СПб, 2002 г.
2. Wijayaa A., Brownb К.А., Alperc J.D., Hamad-Schifferli К. Magnetic field heating study of Fe-doped Au nanoparticles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2007- 309: 15−19.
3. Daniel М., Astruc D. Gold Nanoparticles: Assembly, Supramolecular Chemistry, Quantum-Size-Related Properties and Applications toward Biology, Catalysis and Nanotechnology. Chem Rev2004- 104: 293−346.
4. Матвеевская H.A., Семиноженко В. П., Толмачев A.B. Коллоидные системы наночастиц SiO/Au и их оптические свойства. Материаловедение 2006- 7: 39−43.
5. Lee Т.М., Oldenburg A.L., Sitafalwalla S. et al. Engineered microsphere contrast agents for optical coherence tomography. Optics Letters2003- 28(17): 1546−1548.
6. Gobin A.M., Lee M.H., Halas N.J. et al. Near-Infrared Resonant Nanoshells for combined Optical imaging and photothermal cancer. NanoLetters 2007- 7(7): 1929−1934.
7. Alvarez-Roman R., NaikA., Kalia Y.N. et al. Skin penetration and distribution of polymeric nanoparticles. Jou Controlled Release 2004- 99: 53−62.
Рис. 5. Развитие некротических изменений в опухоли после
лазерной гипертермии: а — через 1 сут- б — на 3-и сутки после гипертермии
8. Park J., Estrada A., Sharp К. et al. Two-photon-induced photoluminescence imaging of tumors using near-infrared excited gold nanoshells. Optics Express 2008- 16(3): 1590−1599.
9. Liu S., Han Y., Yin L., Long L., Liu R. Toxicology Studies of a Superparamagnetic iron oxide nanoparticle in vivo. Advanced Materials Research 2008- 47−50: 1097−1100.
10. James W.D., Hirsch L.R., West J.L. et al. Application of INAA to the build-up and clearance of gold nanoshells in clinical studies in mice. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2007- 271(2): 455−459.
11. Alric C., Taleb J., Mandon C. et al. Gold nanoparticles designed for combining dual modality imaging and radiotherapy. Gold Bulletin 2008- 41(2): 90−97.
12. Qian X., Peng X. -H., O’Ansari D. et al. In vivo tumor targeting and spectroscopic detection with surface-enhanced Raman nanoparticle tags. Nature Biotechnology 2008- 26: 83−90.
13. Sirotkina M.A., Zagaynova E.V., Shirmanova M.V. et al. Detection of nanoparticles accumulation in biological tissues by optical coherence tomography in vivo. In: Nanoscale imaging, sensing, and actuation for biomedical applications VI. Proceeding of SPIE. A.N. Cartwright, D.V. Nicolau (editors). Bellingham: SPIE. 2009- V. 7188, p. 71880L-1 — 71880L-7.
14. Zagaynova E.V., Shirmanova M.V., Kirillin M. Yu. et al. Contrasting properties of gold nanoparticles for optical coherence tomography: phantom, in vivo studies and Monti Carlo simulation. Phys Med Biol 2008- 53: 4995−5009.
15. Kirillin M. ----------- & quot- ^---------
properties of
tides for OCT imaging of
/о study. Journal of Biomedical Optics 2009- 14 17−1-21 017−11. likonov V.M., Gelikonov G.V., Dolin L.S., et al. Optical coherence tomography: physical principles and applications. Laser Physics2003- 13(5): 692−702.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой