Разработка иммунохроматографических тестов для экспресс-диагностики больных гепатитом в

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 57. 083. 3:543. 544:615. 383:616. 36−002−07
Б. П. Челобанов, Г. Н. Афиногенова, И. О. Чешенко, Т. В. Шарова, А. В. Зырянова, С.Н. Велиев
РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ТЕСТОВ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ В
ООО НПО «БИОТЕСТ», Новосибирск Г У НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Сконструирована опытная партия иммунохроматографических экспресс-тестов для определения HBsAg в сыворотке крови. В тест-системе использовали пару моноклональных АТ специфичных к, а детерминанте HBsAg и рекомбинантный HBsAg. Оптимизацию тест-системы проводили на образцах сыворотки здоровых доноров с добавлением рекомбинантного HBsAg. Чувствительность и специфичность полученной тест-системы определяли на стандартной панели сывороток, содержащих HBsAg разной субтиповой специфичности в концентрациях от 0,1 до 0,5 нг/мл и на сыворотках больных гепатитом В и здоровых доноров. Для выявления возможной кросс-реактивности использовали образцы сывороток больных гепатитами, А и С, ВИЧ-инфицированных, больных с заболеваниями печени неинфекционной природы, пациентов после гемодиализа и беременных женщин. Разработанную тест-систему сравнивали с аналогичными экспресс-тестами различных фирм, а также с наборами для определения HBsAg методом ИФА. Установлено, что разработанная тест-система по специфичности не уступает ИФА и позволяет выявлять 0,25 нг/мл HBsAg в сыворотке крови.
Ключевые слова: HBsAg, гепатит В, Вирусный гепатит В (ВГВ) — широко и повсеместно распространенная парентеральная инфекция человека, характеризующаяся симптомами поражения печени и интоксикации и определяющая большую часть летальности при вирусных гепатитах. За последние несколько лет в России регистрируемая заболеваемость находится на уровне 18−21 случая на 100 000 человек в Европейской части и до 30−40 на Дальнем Востоке, в Тыве и Якутии [1]. Вирус гепатита В отличается исключительно высокой инфекционностью, вирулентностью и устойчивостью в условиях окружающей среды, что приводит к высокой частоте передачи данного вируса по сравнению с ВИЧ и ВГС. Установить вирусную природу гепатита и получить информацию об его этиологии возможно только путем выявления серологических маркеров вирусов гепатита [2]. Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg) является основным показателем инфицирования пациента вирусом гепатита В и представляет собой элемент защитной оболочки вируса. Концентрация HBsAg в крови у инфицированных вирусом гепатита В колеблется в очень широких пределах от 0,1 нг/мл до 0,5 мг/мл [3]. Основным резервуаром и источником заражения ВГВ являются лица с субклинической формой заболевания — вирусоносители, с концентрацией HBsAg от 0,1 до 0,5 нг/мл. Существование бессимптомного носительства ВГВ определяет ос-
иммунохроматографический анализ
новные трудности в борьбе с данной инфекцией
[4]. В связи с этим, несмотря на уже существующие унифицированные методики диагностики ВГВ, необходимо внедрение в практику простых, надежных и быстрых, не требующих специальной аппаратуры скрининговых тестов, особенно для групп лиц с повышенным риском заболеваемости
[5].
Цель данного исследования заключалась в разработке иммунохроматографических экс-пресс-тестов для определения четырех основных подтипов антигена HBsAg в сыворотке крови с чувствительностью не менее 0,25 нг/мл.
Материалы и методы
Коллоидное золото получали согласно ТУ 9154−001 -93 099 853−06. Содержание частиц золота в растворе определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 520 нм. Размер частиц и степень агрегации определяли методом трансмиссионной электронной микроскопии, с последующей обработкой компьютерной программой Image-Pro Plus V4.1 (Media Cybernetics, L.P.). Отклонение от номинального размера составляло не более 25%. Количество агрегирующих частиц составляло не более 3%.
В работе использовали моноклональные AT HV-42, HV-101 и HV-102 («БИОСАН», Новосибирск), полученные против HBsAg субтипа ad, специфичные к, а детерминанте и рекомби-
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, № 5 (127), 2007 г.
83
нантный MBs Ад субтипа ayw («КОМБИОТЕХ», Москва). Конъюгаты моноклональных АТ с коллоидным золотом получали согласно [6J. Конъюгаты моноклональных АТ с биотином получали согласно [7].
При конструировании стрипов использовали различные пористые материалы, специально разработанные для пммунохроматографи-ческих тестов («МіІІіроге», США- «Whatman», Великобритания- «Sartorius», Германия).
Нанесение тестовой и контрольной линии на питроцеллюлозиую мембрану и конъюгатов на подушки конъюгатов проводили на диспенсере DCI-210 («ZЕТACorporation», Корея). При оптимизации нанесения контрольной и тестовой линий варьировали концентрацию АТ (от 0,5 до 2 мг/мл), авидина (от 0,25 до 5 мг/мл) и HBsAg (от
0,1 до 1 мг/мл), буферную систему (буфер трис-НС1, боратный буфер, фосфатный буфер), pH (от 5 до 11), концентрацию метанола или этанола (or 1 до 10%), объем и скорость нанесения. При оптимизации нанесения конъюгата варьировали концентрацию конъюгатов АТ-биотин (от 0,02 до
1 мг/мл) и конъюгатов АТ-золото (от 2 до 10 ое), буферную систему (буфер трис-HCl, боратный буфер, фосфатный буфер), pH (от 7 до 9), концентрацию сахарозы (от 1 до 10%), объем и скорость нанесения. После нанесения реагентов иитро-целлюлозную мембрану и подушки конъюгатов сушили в вакуумной сушке Vacuum Drying Oven («ZETACorporation», Корея) и хранили в эксикаторе при относительной влажности & lt- 20%.
Для определения чувствительности и специфичности тест-системы использовали «Контрольную панель сывороток, содержащих и не содержащих HBs-аитиген» («Медико-биоло-
гпческий союз», Новосибирск), «Стандартную панель сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg», («Вектор-Бест», Новосибирск) и образцы сывороток больных гепатитами А, В или С, ВИЧ-инфицированных пациентов, больных с заболеваниями печени неинфекционной природы, пациентов после гемодиализа, беременных женщин и здоровых доноров (образцы сывороток были предоставлены, с согласия больных, специализированными лечебно-профнльными отделениями клиник г. Новосибирска).
Длясравнительногоанализачувствительности экспресс-тестов различных производителей были взяты следующие иммунохроиатографические тест-системы для определения HBsAg: Hepatitis В Surface Antigen (HBsAg) Test («IND Diagnostic», Канада), HBsAg Rapid Hepatitis В Surface Antigen Test Device («ACON Laboratories», США), SD HBsAg («Standard Diagnostic», Корея), HBsAg Hepatitis В Surface Antigen Test («YVondfo Biotech. Co. «, Китай), HXA-HBsAg-Фактор («ФАКТОР-МЕД», Россия).
Результаты
Иммунохроматографический тест представляет собой диагностическую панель (Рис. 1), состоящую из подушки для внесения образца- подушки конъюгата, содержащей антитела, конъюгированные с коллоидным золотом (Рис. 1, схема 1) или двух подушек конъюгата — вторая подушка содержит антитела, конъюгированные с биотином (Рис. 1, схема 2) — нитроцеллюлозной мембраны с иммобилизованными на тестовой линии антителами (Рис. 1, схема 1) или авидином (Рис. 1, схема 2) и с иммобилизованными на контрольной линии антигенами- абсорбирующей подушки. После внесения образца антигены образца взаимодейс-
Схема 1
Схема 2
Обраіеи Коньки ат
А
Тестовая. шипя (антитела)
Контрольная линия (антиген)
Подушка Полушка обрата конъюгата
Ннтронеллюлозная
мембрана
ж
Абсорбирующая
нолушка

Обратен Конъюгат 1, Тестовая линия Контрольная линия Конъюгат 2 (ави. тнн) (Антиген)
К. п'-и. ыйный, 4 *"*
Подушка Подушки Ннтроисллюлоэная Абсорбирующая обрата конъюгатов мембрана подушка
^ ^ 4
Рис. 1. Устройство и принцип работы иммунохроматографических тестов
Контрольная линия
Тестовая линия (положительно)

твуют с конъюгатами антител, Схема 1
нанесенными на подушку конъюгата. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллю-лозной мембраны и взаимодействует с иммобилизованными на тестовой линии антителами (Рис. 1, схема 1) или авидином (Рис. 1, схема 2). 13 результате появляется одна окрашенная сиренево-розовая полоска. Не связавшиеся на тестируемой полосе антитела, мигрируют далее вдоль нитроцеллюлозной мембраны и взаимодействуют с иммобилизованными на контрольної»! линии антигенами. В результате появляется вторая окрашенная сиренево-розовая полоска. Если анализ проведен правильно, контрольная линия должна проявляться всегда, независимо от присутствия исследуемого антигена в образце биологической жидкости.
Обычно в иммунохроматографических тест-системах используют схему 1, поскольку схема 2 хотя и позволяет добиться большей чувствительности, но требует больше затрат п более сложна в разработке. Нами были отработаны оба варианта постановки иммунохроматографнческогоанализа на МВяАц. при этом были проверены различные материалы в качестве подушки образца, подушки конъюгата, абсорбирующей подушки, подобраны подходящие мембраны и оптимизированы условия нанесения реагентов (см. «материалы и методы»).
Основными показателями каждой разрабатываемой тест-системы являются чувствительность и специфичность. Для определения аналитической чувствительности полученных тест-систем готовили ряд серийных разведений, охватывающих диапазон концентрации от 50 до 0,1 нг/мл рекомби натного Ш^Ад в донорской сыворотке. Было показано, что разработанные тест-системы на 11 ВхАд (схема 1 и схема 2) обладают чувствительностью 5 и 0,25 нг/мл соответственно (Рис. 2). Выбранная по результатам проведенной работы схема 2 была положена в основу конструкции экспресс-теста на НВэАд («НВхАд-ВіоТевІ: «), который был подвергнут дальнейшим лабораторным испытаниям.
Поскольку время проявление тестированной полосы зависит от концентрации антигена в сыворотки (Рис. 3), время окончательного учета
Схема 2
Контрольная
1ИНМЯ
5 10 20 50 К 0,1 0. 25 0.5 I
нг/мл нг/мл
Рис. 2. Аналитическая чувствительность ИХА тестов на Ш! хА^
НВэАй нг/мл 0.1 0. 25 0.5 1
тт
_ I 5 минут


10 МИНУТ
НВ$Лк
1ІО. ТОЖИТ.
НВяАк отри на г.
ПВиЛд
положит.
НВэЛв отри цат.
НВбЛк
положит.
НВжЛц отри цат.
Рис. 3. Зависимость скорости проявления тестовой линии от концентрации ИВхАк в образце
результата регистрировали, но выявлению самой меньшей концентрации НВзАй. В нашем случае за 25 мин выявляется достоверно 0,25 нг/мл НВяАй, в сыворотке больного.
Изучение специфичности и чувствительности сконструированного теста проводили по утвержденным стандартам, используя две утвержденные ГИСКом стандартных панели сывороток, согласно прилагаемой инструкции, в трехкратной
25 минут
повторностях. При контроле серий тест-системы «HBsAg-BioTest», проведенных на стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg, были установлены показатели чувствительности и специфичности, соответствующие 100% (Таблица 1).
Изучение аналитической чувствительности и специфичности тест-системы проводили в соответствии с указанием М3 РФ от 01. 04. 2002 № 524-У, с использованием утвержденных панелей сывороток содержащих различные количества HBsAg. Показатели чувствительности по отношению к референс-препарату составили 0,25 нг/мл (Таблица 1).
Тест-системы, разрешенные для использования в России, обязаны учитывать эффекты возможной кросс-реактивности, появление которой может быть обусловлено следующим причинами:
1. Изменение состава крови у беременных женщин.
2. Наличие в крови антикоагулянтов, продуктов гемолиза.
3. Аутоиммунные заболевания.
4. Сопутствующие инфекционные заболевания, передающиеся половым путем.
Для выявления возможной кросс-реактивнос-ти использовали образцы сывороток больных гепатитами, А и С, ВИЧ-инфицированных, больных с заболеваниями печени неинфекционной природы, пациентов после гемодиализа и беременных женщин. Результаты проведенных анализов по выявлению кросс-реактивности полученных тестов с различными образцами сывороток приведены в таблице 2.
Было показано, что полученные тесты обладают низкой кросс-реактивностью, демонстрируя специфичность 97%.
Воспроизводимость метода является одним из важных показателем стабильности качества тест-системы, и обычно проводят внутрисерийное и межсерийное испытания. Оценка воспроизводимости одной серии тест-системы осуществляли на выборке сывороток, путем двухкратной постановки восьми положительных и восьми отрицательных сывороток. Воспроизводимость метода в пределах одной серии показала 100% совпада-емость результатов с исходными показателями сывороток.
Межсерийная воспроизводимость определялась для тех же 8 проб (отрицательных и положительных), путем тестирования 3 разных партий. Отрицательные и положительные результаты тестов также были верными в 98% случаев.
Качество экспресс-тестов оценивали так же путем сравнения с тест-системами других производителей. В качестве образцов были взяты
Таблица
Характеристики ИХА тест-системы на HBsAg
Показатели Тии образца НВ5/^
Диагностическая Позитивные образцы 100%
чувствительность Сероконверсионные панели 100%
Аналитическая чувствительность Стандарты 0,25 нг/мл
Диагностическая Здоровые доноры 97%
специфичность Госпитализированные пациенты 100%
Потенциально кросс-реактивные образцы 97%
Таблица 2
Данные по кросс-реактивности тестов «HBsAg» с сыворотками пациентов, взятых из различных специализированных отделений
Количество образцов «HBsAg»
Заболевание Положи- тельные Отрица- тельные
НАУ 4 1* 3
НВУ 15** 15 0
НСУ 5 0 5
ВИЧ 1+2 3 0 3
Пациенты после гемодиализа 3 0 3
Здоровые доноры 30*** 1 29
Беременные 10*** 0 10
Больные с заболеваниями печени неинфекционной природы 0 10
Примечание: * - слабоположительный (концентрация
HBsAg в крови не выше 0,25 нг/мл). ** - положительные образцы, бъши взяты у пациентов на разных стадиях болезни. *** - отрицательные образцы, используемые для оценки теста, были взяты у целевых групп, для которых предназначен тест, таких как доноры, госпитализированные пациенты, беременные женщины.
образцы сывороток здоровых доноров с добавлением рекомбинантного HBsAg в различных концентрациях и образцы сывороток больных гепатитом В, клинически охарактеризованные методом ИФА (тест система «Вектогеп В — НВв-антиген», ЗАО «Вектор-Вест»), содержащих концентрации антигена, позволяющие произвести качественную и количественную оценку чувствительности. Полученные результаты представлены в таблице 3. Видно, что разработанная нами конструкция экспресс-теста находится на первом месте по чувствительности среди аналогичных ИХА тест-систем отечественных и зарубежных производителей
Таким образом, разработанная нами тест-система достоверно выявляет 0,25 нг/мл HBsAg в крови человека (чувствительность теста составила 100%, специфичность — 97%). Данная тест-система может быть рекомендована для обследования населения в небольших диагностических лабораториях, не имеющих специального обору-
Таблица 3
Сравнительная характеристика различных ИХА
тест-систем на HBsAg
HBsAg, нг/мл 5 1 0,5 0,1
«HBsAg-BioTest», Схема 1 ООО «Биотест», Россия ** * - -
«HBsAg-BioTest», Схема 2 ООО «Биотест», Россия * ** ** ** *
Hepatitis В Surface Antigen (HBsAg) Test IND Diagnostic, Канада * * * ** * -
HBsAg Rapid Hepatitis В Surface Antigen Test Device ACON Laboratories, США * * * ** - -
SD HBsAg Standard Diagnostic, Корея * * * * * * -
HBsAg Hepatitis В Surface Antigen Test Wondfo Biotech. Co., Китай ** * - -
HXA-HBsAg-Фактор ООО «ФАКТОР-МЕД», Россия ** * - -
Примечание: * * * - контрольная и тестовая линии окрашены с одинаковой интенсивностью или тестовая линия окрашена сильнее, чем контрольная — сильноположительный ответ. ** - тестовая линия окрашена слабее, чем контрольная — среднеположительный ответ- * - тестовая линия окрашена слабо, контрольная — интенсивно окрашена — слабоположительный ответ.
дования и высококвалифицированного персонала, для быстрого обследования индивидуального донора доноров крови, органов и тканей человека в неотложных ситуациях или при отсутствии лабораторного оборудования. Кроме того, надежность, объективность и простота в применении позволяет использовать тест в качестве домашней диагностики.
DEVELOPMENT OF AN IMMUNOCHRO-MATOGRAPHY TESTS FOR RAPID DIAGNOSTICS OF VIRAL HEPATITIS TYPE В PATIENTS
B.P. Chelobanov, G.N. Afinogenova, I.O. Chesh-enko, T.V. Sharova, A.V. Zyrianova, S.N. Veliev A pilot lot of Immunochromatographic express-tests for detection of HBsAg in a blood serum is constructed. In the test-system a couple of monoclonal antibodies specific to «а» determinant of HBsAg and recombinant HBsAg were used. Test system optimization was made on the serum samples of healthy donors with supplement of recombinant HBsAg. The sensitivity and specificity of obtained test system
were detected on the standard panel of serums, containing HBsAg of various subtypes in the concentration of 0,1 to 0,5 ng/ml and on the serums of hepatitis В recipients and healthy donors. To reveal a possible cross-reactivity, the serum samples of hepatitis A and С patients, HIV infected, patients with hepatic diseases of noninfectious nature, of patients after hemodialysis and pregnant women were used. This new constructed test system was compared with similar express test systems of various companies and also with the ELISA kits for detection of HBsAg. It was found that constructed test system does not yield to ELISA on its specificity and allows to detect 0,25 ng/ml of HBsAg in blood serum.
Литература
1. Субтипы HbsAg вируса гепатита В в Западной Сибири / И. Г. Нетесова, P.D. Swenson, Т. В. Калашникова и др. // Вопр. вирусол. — 2004. — Т. 49. — № 1. — С. 17−20.
2. Маркеры вирусного гепатита В у южных алтайцев пос. Мендур-Соккон (Республика Алтай). Субти-пирование HBsAg изолятов ВГВ с помощью моноклональных антител / И. Г. Нетесова, P.D. Swenson, Л. П. Осипова и др. // Журн. микробиол., эгшдемиол. и им-мунобиол. — 2001. — № 2. — С. 29−33.
3. Courouce, A.M. Screening for markers of infections transmitted by transfusions in the blood collected in France from 1996 to 1998 / A.M. Courouce, J. Pillonel, C. Saura // Transfus. Clin. Biol. — 2000. — Vol. 7. — № 2. -P. 153−170.
4. Айтов K.A. Течение парентеральных вирусных гепатитов у наркоманов / К. А. Айтов, Ю. К. Плотникова, Н. К. Боброва //Ж. инфекц. патол. — 2003. — Т. 10. — № 4. — С. 11−12.
5. Дифференциальная лабораторная иммунодиагностика вирусных гепатитов, методические указания / А. А. Новик, В. Н. Цыган, В. Ю. Никитин и др. — М., 2002. — 74 с.
6. DykmanL.A. Use of colloidal gold to obtain antibiotin antibodies / L.A. Dykman, L. Yu. Matora, V.A. Bogatyrev //J. Microbiol. Meth. — 1996. — Vol. 24. — P. 247−248.
7. Моул С. Получение моноклональных антител к гибридным белкам, продуцируемым в клетках Е. coli / С. Моул, Д. Лейн- под ред. Д. Гловера. // Новое в клонировании ДНК. Методы: Пер. с англ. — М., 1986. -
С. 171−207.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой