Разработка иммунозолотых диагностических систем для идентификации возбудителя туберкулеза in situ

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
14. Савицкий В. П., Ботвинкин А. Д. Бешенство в Сибири и на Дальнем Востоке. Эпидемиология, эпизоотология, профилактика. Аннотированный библиографический указатель за 1881−1980 гг. — Омск.: НИИПИ. 1981.
15. Селимов М. А. Пути ликвидации гидрофобии. — М.: Медицинская литература, 1963.
16. Селимов М. А. Бешенство. — М.: Медицина, 1978.
17. Сидоров Г. Н. Роль диких собачьих (Canidae) в поддержании эпизоотического процесса в природных очагах бешенства на территории России в связи с особенностями экологии этих животных. // Автореф. дис. … докт. биол. наук. — Новосибирск. 1995.
18. Сидоров Г. Н. Аспекты исторического развития природных очагов бешенства в Европе и Северной Азии // Ветеринарная патология, 2002- 1: 21−25.
19. Сидоров Г. Н., Ботвинкин А. Д., Кузьмин И. В. Особенности поведения диких млекопитающих, инфицированных вирусом бешенства // Зоологический журнал, 1998- 77 (11): 1310−1316.
20. Сидоров Г. Н., Полещук Е. М., Сидорова Д. Г. Природные очаги бешенства в России в XX — начале XXI веков // Ветеринарная патология, 2004- 3(10): 86−101.
21. Сидоров Г. Н., Сидорова Д. Г., Полещук Е. М. Бешенство диких млекопи-
тающих на территории России в конце 20-начале 21 веков // Зоологический журнал, 2010- 89 (1): 26−36.
22. Сидорова Д. Г. Современные экологические особенности проявления эпизоотического процесса бешенства в природных очагах. // Автореф. дис … канд. биол. наук.- Новосибирск. 2009.
23. Сидорова Д. Г., Сидоров Г. Н., Полещук Е. М., Колычев Н. М. Бешенство в Восточной Сибири в XX начале XXI веков // Бюлл. Восточно-сибирского научного центра СО РАМН, 2007- 3 (55): 168−172.
24. Токаревич К. Н., Грекова Т. И. По следам минувших эпидемий. — Л.: Ле-низдат, 1986.
25. Хадарцев О. С., Федоров Ю. М., Жилина Н. Я. и др. Бешенство в Российской Федерации в 2000—2005 гг. — М.: Изд-во Министерство с. -х. РФ, 2006.
26. Щербак Ю. Н. Эпидемиология бешенства природного типа. // Автореф. дис… докт. мед. наук — Киев, 1982.
27. Baer G.M. Natural History of Rabbies. — Ney-York, San-Francisco. London.: Acad. Press, 1975.
28. Gier H.T. Rabies in the wild. // J. Wildlife Management, 1948- 12 (2): 142−143.
29. Johnson H.N. Fox rabies // J. Med. Assn. Alabama, 1945- 14: 268−271.
30. Winkler W.G. Fox Rabies. In The natural history of rabies. — New-York, San Francisco, London, 1975.
SUMMARY
E.S. Berezina, G.N. Sidorov, E.M. Polishchuk, D.G. Sidorova. Small wild canines and their role in the incidence of human rabies in Russia. The role of foxes, raccoon dogs, corsacs, arctic foxes in the incidence of human rabies during 1957- 2007 years was studied. Small canines infected with rabies 28,3% victims, most of them were rural men. Foxes inflicted wounds in the hands (39%) and face (20%), raccoon dogs bit hands only (100% cases), corsacs mostly bit hands (83%), while arctic foxes in most cases bit people in the face. Minimal incubation period was noted after contact with the raccoon dog (20 days), while maximal one (320 days) — after contact with the fox. Average incubation period after contact with raccoon dog was 92 days, with corsac — 87 days, with fox — 62, and with arctic fox — 33 days. The number of mortal cases increased in summer and winter.
w 619: 6165'-2 525 Разработка иммунозолотых
диагностических систем для идентификации возбудителя туберкулеза in situ
С.А. Староверов1'23, И.В. Видяшева1, А.С. Фомин3, О.А. Василенко2,3, М.Л. Малинин2,3, К.П. Габалов2,3, В.А. Богатырев1, Л.А. Дыкман1
1 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (Саратов).
2 Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН.
3 Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова.
Ключевые слова: иммунодот, коллоидное золото, микобактерии, фаговая библиотека.
Сокращения: ИФА — иммуноферментный анализ,
КЗ — коллоидное золото, PPD — Purified Protein Derivate
Введение
Для иммунологических исследований традиционно используют антитела — поликлональные (полученные от иммунизированных животных) или моноклональные (полученные с использованием гибридомных технологий). Последние широко применяют в производстве диагностических тест-систем. Однако получить антитела с использованием животных, когда речь идет о низкоиммуногенных или токсичных антигенах, бывает очень трудно. Для решения подобных задач в молекулярной биологии используют генно-инженерные технологии: клонирование узнающих фрагментов — гипервариабельных
участков иммуноглобулинов (миниантител). Генно-инженерные технологии дешевле и могут успешно конкурировать по селективности с гибридомными. К таким методам относится технология фагового дисплея антител [4, 17].
Создание и использование комбинаторных фаговых библиотек является принципиально новой стратегией получения специфических антител. Дж. Мак-Каферти с соавторами в 1990 г. впервые показали возможность экспрессии фрагментов антител в составе белка оболочки фага [14]. Они же продемонстрировали возможность быстрой и эффективной селекции (биопаннинга) клонов, несущих вы-сокоаффиные антитела, с помощью иммобилизованного антигена. Этот метод не сопряжен с использованием животных (и значит, с длительными процедурами иммунизации), дорогих сред и культур животных клеток.
В современной литературе большое число публикаций посвящено получению антител при помощи фаговых биб-
РВЖ. МДЖ № 2−2011
29
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
лиотек на токсины столбняка, ботулизма, опухолевые антигены, бактериальные рецепторы и др. [6, 9, 11].
В то же время, традиционные технологии получения поликлональных антител могут быть значительно улучшены использованием КЗ в качестве адъюванта. Это позволяет получать высокоафинные антисыворотки без трудоемких процедур истощения и аффинной очистки [7]. Еще одно преимущество использования КЗ в иммунохимических исследованиях — его универсальность, т. е. возможность его применить в качестве выявляющего агента как в рутинных методах с непосредственной визуализацией глазом так и в ультраструктурных экспериментах с электронно-микроскопическим разрешением [1].
При диагностике туберкулеза используют туберкулин, который представляет собой вытяжку микобактерий, состоящую из термостабильных белков и жирных кислот. Его широко применяют при диагностике туберкулеза посредством кожного теста (пробы Пирке и Манту) [10, 13]. Однако многие вопросы, связанные с механизмами воздействия туберкулина на организм животного или человека, остаются открытыми. Известно, что антитела на туберкулин при его внутрикожном введении не образуются, и иммунный ответ на него — клеточный. Поэтому получение антител на туберкулин представляется важной задачей.
Получение специфических антител на туберкулин связано с определенной сложностью, т. к. в его состав входит целый набор белков с молекулярной массой от 9 до 65 кДа [16]. Кроме того, мажорный полипептид 9,7 кДа, входящий в состав туберкулина, способен вызывать ингибирование миграции макрофагов и частичное угнетение бласттрансформации у морских свинок и тем самым тормозить выработку антител [12].
Цель исследования
Сравнить антитела на туберкулин, полученные при использовании фаговой библиотеки, и антитела, полученные на конъюгаты антигена с КЗ при иммунизации животных. Оценить возможность применения указанных антител при идентификации возбудителя методами световой и электронной микроскопии и твердофазного ИФА.
Материалы и методы
Приготовление конъюгатов белков с КЗ. В качестве микробного антигена применяли туберкулин PPD (БИОК, Россия). Антигенную фракцию из туберкулина выделяли методом высаливаливания сульфатом аммония. Затем посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) очищали выделенные белковые фракции молекулярной массой 10… 26 кДа, чистоту которых проверяли электрофорезом в 20% полиакриламидном геле.
КЗ со средним диаметром частиц 15 нм получали по методу Frens G. [8], используя реакцию восстановления золотохлористоводородной кислоты (Aldrich, USA) цитратом натрия (Fluka, Switzerland). Золотые нанооболочки были синтезированы путем восстановления золотохлористоводородной кислоты на золотых «зародышах», адсорбированных на поверхности силикатных наночастиц [15].
Иммунизация животных. Чтобы получить поликлональные антитела на туберкулин, конъюнат антигена с КЗ вводили 4 кроликам породы шиншилла. Контрольной группе вводили не конъюгированный с КЗ туберкулин в аналогичной дозе.
Титр полученных антител определяли в сыворотке посредством ИФА с применением меченных пероксидазой хрена антикроличьих антител [3], используя туберкулин в качестве иммобилизованного антигена, на микропланшетном спектрофотометре Multiskan Accent+ (Thermo, США).
Аффинная селекция миниантител из фаговой библиотеки. Миниантитела на туберкулин получали с использовани-
ем овечьей фаговой библиотеки (Griffin. 1), любезно предоставленной профессором W.J. Harris (Aberdeen University, Великобритания) [5].
Иммунодот-анализ. Специфичность полученных нами фаговых антител определяли методом иммунодот-анализа [1]. В работе использовали клетки Mycobacterium bovis вакцинного штамма БЦЖ (Bacillus Calmette- Gurnin), Escherichia coli штамма XL-1 Blue, Staphylococcus aureus 209-
R, Brucella abortus вакцинный шт. 82, Mycobacterium phlei и Mycobacterium smegmatis.
Микроскопия. Препараты для световой микроскопии готовили по следующей методике. Клетки микобактерий отмывали от питательной среды и ресуспендировали в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (рН 7,2) до концентрации микробных клеток 1×109/мл. Затем к микробной суспензии приливали миниантитела из расчета 100 000 частиц на одну микробную клетку Суспензию культивировали 1 ч при комнатной температуре. После этого двукратно отмывали от неприсоединившихся к микробным клеткам фагов. Затем микробную взвесь обрабатывали в антифаговых антителах, конъюгированных с КЗ (А520 = 0,1), в течение 1 ч при комнатной температуре и повторно отмывали от несвязавшегося с микробными клетками конъюгата. Полученный осадок ре-суспендировали в фосфатно-солевом буфере и готовили влажный препарат, который исследовали под световым микроскопом (DMI 3000, LEICA, Германия) в просвечивающем режиме без физического контрастирования и посредством электронной микроскопии (LIBRA 120, Carl Zeiss, Германия).
Результаты
Мы получили два вида антител на туберкулин: поликлональные (от кроликов, иммунизированных конъюгатом туберкулина с КЗ) и моноклональные, или миниантитела (выработанные клетками E. coli штамм XL-1 blue, зараженными специфичными к туберкулину фагами). Титр полученных поликлональных антител 1: 1024, моноклональных 1: 512.
Чувствительность и специфичность антител определили методом иммунодот-анализа. Моноклональные антитела показали меньшую чувствительность по сравнению с поликлональными, но последние были менее специфичными (дают более сильную визуальную окраску M. smegmatis), чем моноклональные.
При электронной микроскопии клеток M. bovis шт. БЦЖ, окрашенных с использованием поликлональных и моноклональных антител, было доказано, что оба вида антител адсорбируются на поверхности микробной клетки. При световой микроскопии M. bovis шт. БЦЖ, окрашенных антителами обоих видов, были прекрасно видны прокрашенные клетки.
Обсуждение
В результате иммунизации кроликов конъюгатом туберкулина с КЗ, титр антител у всех трех кроликов составил 1: 1024. У контрольной группы животных, которым вводили туберкулин без золота, антител к нему в сыворотке крови не обнаружили.
При постановке иммунодот-анализа с использованием миниантител чувствительность метода составила 104… 103 микробных клеток в 1 мкл. При использовании поликлональных сывороток мы детектировали 400. 200 микробных клеток в 1 мкл в случае положительной реакции.
При определении специфичности полученных антител установлено (рис. 1), что миниантитела реагируют как с самими бактериальными клетками, так и с туберкулиновой фракцией. С такими микроорганизмами, как E. coli XL-1 blue,
S. aureus 209-R, B. abortus вакцинный шт. 82, полученные миниантитела не реагировали.
30
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
ч •• V
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 1. Определение специфичности антител, полученных при помощи фаговой библиотеки. Фаговые частицы выявляли с использованием конъюгатов антифаговых антител с золотыми нанооболочками:
1 — миниантитела в концентрации 1013 частиц в мл-
2 — туберкулин в концентрации 1 мг/мл-
3 — M. bovis вакцинный шт. БЦЖ-
4 — E. coli XL-1 blue-
5 — S. aureus 209-R-
6 — B. abortus вакцинный шт. 82-
7 — бруцеллин в концентрации 1 мг/мл.
При тестировании поликлональных сывороток нами были получены аналогичные результаты.
После чего мы определили видовую специфичность миниантител и поликлональных сывороток. Для этого изучили перекрестные реакции антител на туберкулин у M. bovis и атипичных видов микобактерий: M. phlei и M. smegmatis. Установлено (рис. 2 и 3), что миниантитела дают частичный перекрест в больших концентрациях (от 2,5×108 микробных тел в мл и выше) с M. smegmatis. Перекрест миниантител с M. phlei в иммунодот-анализе обнаружен не был.
Рис. 2. Иммунодот-анализ микобактерий с использованием миниантител на туберкулин. Фаговые частицы выявляли с использованием конъюгатов антифаговых антител с КЗ:
А — M. bovis-
В — M. smegmatis-
С — M. phlei
Рис. 3. Иммунодот-анализ микобактерий с использованием поликлональных антител на туберкулин. Выявление проводили с использованием конъюгатов антикроличьих антител с КЗ:
A — M. bovis-
B — M. smegmatis-
C — M. phlei
При использовании поликлональных антител отмечена сходная реакция. Однако перекрестная реакция с M. smegmatis была более выраженная, что указывало на их более низкую специфичность.
Изложенные результаты дают возможность в дальнейшем использовать данный вид рекомбинантных антител для разработки диагностических тест-систем.
Следующим этапом исследований стало применение полученных миниантител для микроскопических исследований клеток микобактерий. На рисунке 4 приведены данные электронной микроскопии при выявлении антигенных детерминант на клеточной поверхности микобактерий миниантителами. Видно, что данный антиген распределяется на одном из субполярных концов клеточной поверхности микобактерий.
.. | 500 пт
Рис. 4. Выявление туберкулинового антигена на клетках M. bovis шт. БЦЖ при помощи миниантител. Фаговые частицы выявляли с использованием конъюгатов антифаговых антител с КЗ
При использовании поликлональных антител мы отметили диффузное распределение антигена по всей клеточной
Рис. 5. Выявление туберкулинового антигена на клетках M. bovis шт. БЦЖ при помощи поликлональных антител. Выявление проводили с использованием конъюгатов антикроличьих антител с КЗ
После электронной микроскопии мы изучили возможность применения полученных миниантител для иммунохимического обнаружения микобактерий в препаратах посредством световой микроскопии.
На практике используют два метода микроскопического исследования диагностического материала с целью выявления кислотоустойчивых микобактерий: метод прямой микроскопии (исследуют препараты, окрашенные по методу Циля-Нильсена, в обычном световом микроскопе проходящего света) и метод люминесцентной микроскопии, который так же, как и метод Циля-Нильсена, основан на проникновении в клетку карболового производного флуоресцентного красителя аурамина 0 [2].
поверхности микобактерий (рис. 5).
РВЖ. МДЖ № 2−2011
31
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
В своей работе мы выявляли микобактерии методом световой микроскопии с использованием КЗ в качестве контрастирующего красителя.
На рисунках 6 и 7 показаны препараты M. bovis вакцинного штамма БЦЖ. Микробные клетки выявляли миниантителами и поликлональными антителами к туберкулину и контрастировали антифаговыми и антикроличьими антителами, конъюгированными с КЗ. При использовании как фаговых так и поликлональных антител клетки микобактерий при световой микроскопии обнаруживаются как полиморфные палочки красного цвета.
Рис. 6. Выявление туберкулинового антигена на клетках M. bovis шт. БЦЖ при помощи миниантител. Фаговые частицы выявляли с использованием конъюгатов антифаговых антител с КЗ (стрелкой отмечены клетки микобактерий)
Рис. 7. Выявление туберкулинового антигена на клетках M. bovis шт. БЦЖ при помощи поликлональных антител. Выявление проводили с использованием конъюгатов антикроличьих антител с КЗ (стрелкой отмечены клетки микобактерий)
Выводы
Таким образом, данный метод в дальнейшем может послужить для обнаружения микобактерий в различных объектах окружающей среды (стать хорошим дополнением к имеющимся уже методам окраски) и для дифференциальной диагностики микобактерий (с использованием специфических антител).
Анализируя результаты можно отметить, что как поликлональные антитела, так и антитела, полученные при использовании фаговой библиотеки, можно успешно применять в иммунологических исследованиях. В дальнейшем полученные антитела планируется использовать для создания диагностикума на M. tuberculosis.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Дыкман Л. А., Богатырев В. А., Щёголев С. Ю., Хлебцов Н. Г. Золотые наночастицы: синтез, свойства, биомедицинское применение. — М.: Наука, 2008.
2. Люминесцентная микроскопия: Учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии». — М. — Тверь: Триада, 2008.
3. Медицинские лабораторные технологии. Справочник. Т. 2 / Под ред. Кар-пищенко А.И. — Спб.: Интермедика, 2002.
4. Тикунова Н. В., Морозова В. В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител // Acta Naturae., 2009- 3: 22−31.
5. Charlton K.A., Moyle S., Porter A.J.R., Harris W.J. Analysis of the diversity of a sheep antibody repertoire as revealed from a bacteriophage display library // J. Immunol., 2000- 164: 6221−6229.
6. Chassagne S., Laffly E., Drouet E., Hйrodin F., Lefranc M. -P., Thullier P. A high-affinity macaque antibody Fab with human-like framework regions obtained from a small phage display immune library // Mol. Immunol., 2004- 41: 539−546.
7. Dykman L.A., Staroverov S.A., Bogatyrev V.A., Shchyogolev S. Yu. Gold nanoparticles as an antigen carrier and an adjuvant. — New York.: Nova Science Publishers, 2010.
8. Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions // Nature Phys. Sci., 1973: 241: 20−22.
9. Gao C., Mao S., Ronca F., Zhuang S., Quaranta V., Wirsching P., Janda K.D. De novo identification of tumor-specific internalizing human antibody-receptor pairs by phage-display methods // J. Immunol. Meth., 2003- 274: 185−197.
10. He X.Y., Luo Y.A., Zhang X.G., Liu Y.D., Wang Z.Y., Luo F.Z., Zhang J.P., Wang Q., Yan S.M., Wang Y.J., Ma L.F., Guo J., Dong Y.J., Huang X.Y., Zhuang Y.H. Clinical evaluation of the recombinant 38 kDa protein of Mycobacterium tuberculosis // Scand. J. Infect. Dis., 2008- 40: 121−126.
11. Jacobsson K., Rosander A., Bjerketorp J., Frykberg L. Shotgun phage display — selection for bacterial receptins or other exported proteins // Biol. Proced. Online., 2003- 5: 123−135.
12. Kuwabara S. Amino acid sequence of tuberculin active protein from Mycobacterium tuberculosis // J. Biol. Chem., 1975- 250: 2543−2568.
13. Lalvani A. Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new tools to tackle an old enemy // Chest., 2007- 131: 1898−1906.
14. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. Fhage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains // Nature, 1990- 348: 552−554.
15. Oldenburg S.J., Averitt R.D., Westcott S.L., Halas N. Nanoengineering of optical resonances // Chem. Phys. Lett., 1998- 288: 243−247.
16. Ozekinci T., Ozbek E., Celik Y. Comparison of tuberculin skin test and a specific T-cell-based test, T-Spot. TB, for the diagnosis of latent tuberculosis infection // J. Int. Med. Res., 2007- 35: 696−703.
17. Petrenko V.A., Vodyanoy V.J. Phage display for detection of biological threat agents // J. Microbiol. Meth., 2003- 53: 253−262.
SUMMARY
S.A. Staroverov, I.V. Vidyasheva, A.S. Fomin, O.A. Vasilenko, M.L. Malinin, K.P. Gabalov, V.A. Bogatyrev, L.A. Dykman. Development of immunogold diagnostic systems for identification of the causative agent of tuberculosis in
situ. Comparison of two techniques for obtaining of diagnostic antibodies to tuberculin was made: miniantibody biopanning of phage library and immunization of rabbits by conjugates of tuberculin and colloidal gold. As for exposing the agent in the developed diagnostic systems used the conjugates of colloidal gold and gold nanoshells with species-specific antirabbit and antiphage antibodies. Miniantibodies obtained by both methods were equally identified both soluble (tuberculin) as corpuscular (bacteria of vaccine strain Mycobacterium bovis, BCG) antigens in the solidphase immunoassay. Antibodies which were obtained by using of the phage libraries showed a higher selectivity for immunodot-analysis. The use of indirect labeling technique allows the reliable identification of M. bovis at the transmission light and electron microscopy.
Первый профессиональный портал зооиндустрии! рШ
Новостные ленты м Обзор профессиональной прессы
Интернет-представительства н Сервисы тематической
компаний и ассоциаций отрасли рассылки новостей
Каталог зоо- и ветеринарных компаний
Успей зарегистрироваться !!!
32

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой