Разработка методики количественного определения флавоноидов в траве пиретрума девичьего и её валидация

Тип работы:
Реферат
Предмет:
История. Исторические науки


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 615. 32
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ ПИРЕТРУМА ДЕВИЧЬЕГО И ЕЁ ВАЛИДАЦИЯ
Д.А. КОНОВАЛОВ
Д.С. КОНОВАЛОВА Разработана методика количественного определения фла-
воноидов в траве пиретрума девичьего и дана ее валидация.
Пятигорская государственная Ключевые слова: пиретрум девичий, флавоноиды, диффе-
фармацевтическая академия ренциальная спектрофотометрия, валидация.
e-mail: konovalov_da@pochta. ru
Пиретрум девичий (Pyrethrumparthenium (L). Smith, сем. Asteraceae) — это популярное в последнее время за рубежом растение. Оно используется для профилактики и лечения мигрени. Основными биологически активными веществами травы пиретрума девичьего являются сесквитер-пеновые лактоны и флавоноиды. Именно с данными классами природных соединений и связывают противовоспалительную, антимигренозную, противораковую, анальгетическую, фунгицидную и другие виды биологической активности, которые проявляет трава пиретрума девичьего [1, 2].
Отечественное сырье с научной точки зрения изучено мало, хотя в народной медицине растение применяется для лечения головных болей, артрита, ревматизма и других заболеваний, связанных с воспалительным процессом [2].
Целью работы является разработка методики дифференциальной спектрофотометрии позволяющей проводить оценку качества сырья пиретрума девичьего по содержанию флавоноидов.
Материалы и методы. Сырье пиретрума девичьего заготавливалось нами с 2009 по 2011 год с дикорастущих популяций, произрастающих на территории Кавказских Минеральных Вод.
Разработанная нами методика определения флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии основана на способности флавоноидов образовывать комплексы с алюминия (III) хлоридом. При этомнаблюдается батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов от 330−350 к 390−410 нм в видимую область спектра.
В качестве стандарта использовали раствор стандартного образца (СО) рутина в 95% спирте этиловом.
Методика количественного определения: аналитическую пробу сырья измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм. Около 1,0 (точная навеска) измельченной травы помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 70% спирта этилового и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе.
После охлаждения полученное извлечение фильтруют через беззольный бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят 70% спиртом этиловым до метки. Далее
3 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 5 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом, через 5 минут добавляют 0,2 мл раствора кислоты уксусной разведенной (33%). Объем раствора доводят до метки спиртом этиловым 95% и оставляют на 40 минут. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм, используя кювету с толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 3 мл извлечения и 0,2 мл раствора кислоты уксусной разведенной (33%), доведенный спиртом этиловым до метки в колбе вместимостью 25 мл.
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора комплекса СО рутина с алюминия хлоридом. Для этого в мерную колбу на 25 мл помещают 3 мл раствора СО рутина, прибавляют
5 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте этиловом, через 5 минут добавляют 0,2 мл раствора кислоты уксусной разведенной. Объем раствора доводят до метки спиртом этиловым 95%, оставляют на 40 минут и измеряют оптическую плотность при длине волны 410 нм.
В качестве раствора сравнения использовали раствор СО рутина, приготовленный в тех же условиях, только без добавления алюминия хлорида.
Расчет содержания суммы флавоноидов в траве пиретрума девичьего проводят в точках максимума оптического поглощения испытуемого извлечения и раствора СО рутина, обработанных алюминия хлоридом.
Содержание суммы флавоноидов в процентах в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
х = Ах Х т& lt-т х 100 ч х 100%, гДе
Аст х тх х (100 — Ш) х — содержание суммы флавоноидов, в процентах-
Ах — оптическая плотность извлечения, обработанного алюминия хлоридом- Аст — оптическая плотность раствора комплекса СО рутина с алюминия хлоридом- тх — масса сырья, г- теп- масса СО рутина, г-
Ш — потеря в массе при высушивании сырья, в процентах (9,1%).
Результаты и их обсуждение. Статистическая обработка полученных результатов (п=6, Р=0,95) представлена в табл. 1.
Содержание суммы флавоноидов в траве пиретрума девичьего в фазу конца бутонизации-начала цветения составляет 2,29±0,07%. Кроме того нами проводилось определение содержания флавоноидов в образцах травы пиретрума девичьего, заготовленных в разные годы (табл. 2). Как видно из табл. 2, относительная погрешность определения (е) не превышает 5%.
Таблица 1
Результаты определения суммы флавоноидов в траве пиретрума девичьего в фазу конца бутонизации-начала цветения
№ п/п Навеска Оптическая плотность X. "- 1 (X — х) (X — X)2 Метрологические характеристики
0* 0,0500 0,559 — - -
1 1,0179 0,244 2,36 0,07 0,0049
2 1,0912 0,248 2,24 0,05 0,0025
3 0,9546 0,216 2,23 0,06 0,0036 Ях =0,069
4 0,9986 0,238 2,35 0,06 0,0036 Sx: =0,028
5 1,1035 0,263 2,34 0,05 0,0025 Дх =0,07 е=3,06%
6 1,0065 0,226 2,21 0,08 0,0064
Среднее значение, X 2,29
Сумма значений, ^ (х. — х)2 0,0235
Примечание: * - СО рутина- ** - содержание (%) в пересчете на абсолютно-сухое сырье.
Таблица 2
Количественное определение флавоноидов в траве пиретрума девичьего, заготовленной в разные годы
Год заготовки Навеска сырья, г Оптическая плотность, А Содержание флавоноидов, (%) XI Метрологические характеристики
2009 0,9735- 0,9463- 0,8519- 1,0486- 1,0368- 1,0094 0,248- 0,247- 0,207- 0,275- 0,268- 0,243 2,42- 2,47- 2,30- 2,49- 2,48- 2,29 х =2,41- Ях =0,091- Sx =0,037 Ах =0,09- е =3,73%
2010 1,0572- 0,9964- 1,0187- 1,0253- 1,1045- 0,9628 0,268- 0,247 0,236- 0,251- 0,265- 0,234 2,45- 2,40- 2,23- 2,37- 2,32- 2,35 х =2,35- Ях =0,075- Sx =0,031 Ах =0,08- е =3,40%
2011 1,0179- 1,0912- 0,9546- 0,9986- 1,1035- 1,0065 0,244- 0,248- 0,216- 0,238- 0,263- 0,226 2,36- 2,24- 2,23- 2,35- 2,34- 2,21 х =2,29- Ях =0,069- Sx =0,028 Ах =0,07- е =3,06%
Примечание: * - содержание (%) в пересчете на абсолютно-сухое сырье.
Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов пиретрума девичьего.
Для подтверждения пригодности методики по контролю качества сырья пиретрума девичьего проводили ее валидационную оценку по параметрам линейность и точность (прецизионность на уровне повторяемости методики и правильность методом добавок).
Для разработки оптимальной методики была установлена область линейной зависимости оптической плотности от концентрации анализируемого вещества (суммы флавоноидов). Определение линейности проводили на 6 уровнях концентраций анализируемого извлечения (табл. 3, рис. 1). Растворы готовили путем разбавления аликвоты и увеличения аликвоты для измерения количественного содержания суммы флавоноидов травы пиретрума девичьего.
Таблица 3
Определение линейности зависимости оптической плотности от концентрации анализируемых веществ
С 0,0078 0,0113 0,017 0,0227 0,0283 0,0341
А 0,08 0,142 0,22 0,291 0,367 0,436
где С — концентрация суммы флавоноидов, г/мл- А — оптическая плотность.
Рис. 1. Зависимость оптической плотности от концентрации флавоноидов в извлечении из травы пиретрума девичьего
На рис. 1 видно, что почти все экспериментальные точки (за исключением первой), лежат на линии тренда. Следовательно, область линейной зависимости наблюдается при концентрациях 0,0113−0,0341 г/мл. Вычисление коэффициента корреляции проводили с помощью программы М1сговоА: Ехсе1 2002. Величина коэффициента корреляции составила 0,99, что считается удовлетворительной корреляцией.
Определение прецизионности методики (на уровне повторяемости) проводили на одном образце сырья на шести параллельных измерениях. Результаты определений представлены в табл. 4.
Результаты установления прецизионности на уровне повторяемости (сходимости) валидируемой методики
Таблица 4
№ опыта Навеска сырья, г Оптическая плотность, А X. * 1 (X. — X) (X1 — X)2 Метрологические характеристики
0. 0,0500 0,603 — - - Sx = 0,058 SX = 0,024 Дх = 0,066 е = 3,13% RSD =2,75%
1. 0,9863 0,226 2,09 0,02 0,0004
2. 1,0911 0,258 2,15 0,04 0,0016
3. 0,9658 0,214 2,02 0,09 0,0081
4. 1,1042 0,265 2,19 0,08 0,0064
5. 0,9947 0,230 2,11 0 0
6. 1,0234 0,234 2,09 0,02 0,0004
Среднее значение X 2,11
Сумма значений ^ (X. — X)2 0,0169
Примечание: * - содержание (%) в пересчете на абсолютно-сухое сырье.
Относительное стандартное отклонение равно 2,75%, это говорит о том, что методика позволяет получить удовлетворительные по сходимости результаты.
Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин в растворах, полученных путем добавления стандартного образца (СО рутина) к навеске сырья. Результаты определений представлены в табл. 5.
Таблица 5
Определение правильности методики (результаты опытов с добавками)
№ п/п Навеска сырья, г Добавка рутина, г А* Содержание** (%) R, % Метрологические характеристики
Расчетное Полученное
1. 1,0062 0 0,246 2,36 — - R^= 101,40 Sx = 2,70 S- = 1,02 x '- Дх = 2,50 e = 2,47% RSD =2,66%
2. 1,0143 0,0051 0,292 2,87 2,78 96,86
3- 0,9851 0,0112 0,350 3,49 3,43 98,28
4- 0,9864 0,0171 0,433 4,08 4,24 103,92
5- 0,9877 0,0275 0,538 5,12 5,27 102,93
6. 1,1095 0,0294 0,626 5,30 5,46 103,01
7- 1,0238 0,0365 0,655 6,02 6,18 102,66
8. 0,9891 0,0379 0,642 6,12 6,29 102,11
Примечание: * - оптическая плотность 0,05% раствора СО рутина 0,569-
** - содержание суммы флавоноидов в абсолютно сухом сырье- А — значение оптической плотности образцов сырья- Я — открываемость.
Критерий приемлемости — средний процент открываемое™, скорректированный на 100%, и его средняя величина должна находиться в пределах 97−103% (согласно рекомендациям американской ассоциацией аналитической химии (АОАС) при содержании анализируемого вещества больше 1%). В разработанной методике средний процент открываемости составил 101,40%, а относительное стандартное отклонение не превышает 3%, что соответствует величине RSD, оптимальной для данного метода анализа.
Выводы. Разработанная методика позволяет определить содержание суммы флавоноидов в траве пиретрума девичьего в присутствии других соединений, проста в исполнении и не требует дорогостоящей аппаратуры. А проведенная валидационная оценка методики свидетельствует о её пригодности для контроля качества сырья пиретрума девичьего.
Литература
1. Knight, D.W. Feverfew: chemistry and biological activity / Knight D.W. // Nat. Prod. Rep. Vol. 12, N 3. — P. 271−276.
2. Anti-inflammatory activity of parthenolide-depleted Feverfew (Tanacetum parthenium) [et al.] // Inflammopharmacology. — 2009. — Vol. 17, N 1. — P. 42−49.
3. Коновалова, Д. С. Сесквитерпеновые лактоны пиретрума девичьего как биологически вещества (обзор) / Д. С. Коновалова, Д. А. Коновалов // Экология человека. — 2008. — № 3. — С. 3−7.
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF QUANTITATIVE METHOD OF DETERMINATION OF FLAVONOIDS IN PYRETHRUM PARTHENIUM HERB
The technique of quantitative definition of flavonoids in Pyrethrum parthenium herb is developed and given it'-s vaidation.
Key words: Pyrethrum parthenium, flavonoids, spectrophotometry, validation.
— 1995- -/ Sur R. активные
D.A. KONOVALOV D.S. KONOVALOVA
Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy
e-mail: konovalov_da@pochta. ru

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой