Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантной n-ацетилтрансферазы-2 человека

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Биомедицина • № 2, 2015, С. 47−52
Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантнойацетилтрансферазы-2 человека
М. С. Дуля, Е. Д. Шевченко, Н.В. Петрова
ФГБУН"Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России", Московская область Контактная информация: Дуля Максим Сергеевич, mdulya@gmail. com
В статье представлена разработка методологии и оптимизация условий получения рекомбинантной 1Ч-ацетилтрансферазы-2 человека (hNAT2), найдены оптимальные параметры наработки фермента в растворимой форме и в достаточном количестве для in vitro биоаналитических экспериментов. Приводятся данные о дизайне генетической конструкции для эффективной экспрессии рекомбинант-ного фермента Ы-ацетилтрансферазы-2 человека, методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях подтверждается молекулярная масса белка (34−35 кДа), указывается количественное содержание фермента (3,14 мг/мл).
Ключевые слова: Ы-ацетилтрансфераза-2 (NAT2), фермент, гель-электрофорез, человек.
Введение
Биотрансформация ксенобиотиков и лекарственных средств в подавляющем большинстве случаев осуществляется под контролем ферментов. Ферменты, участвующие в метаболизме ксенобиотиков, локализованы главным образом в печени, хотя немаловажную роль могут играть ферменты кишечника, лёгких, почек, кожи и других тканей.
Внимание нашего исследования посвящено условиям экспрессии ферментов второй фазы биотрансформации -М-ацетилтрансфераз. Ацетилирование эволюционно является одним из ранних механизмов адаптации, т.к. эта реакция необходима для синтеза жирных кислот, стероидов, функционирования цикла Кребса, метаболизма ксенобиотиков (лекарственных препаратов, бытовых и промышленных ядов). Процессы фер-
ментативного ацетилирования арилги-дразинов и ариламинов — как у прокариот, так и у эукариот — осуществляются с помощью NAT.
У человека известно три гена NAT, один из которых является псевдогеном. Два экспрессирующихся гена NAT1 и NAT2 расположены на одной хромосоме и кодируют N-ацетилтрансфера-зу-1 (NAT1) иацетилтрансферазу-2 (NAT2), которые имеют 81% идентичности, и оба проявляют генетический полиморфизм. В настоящее время известно четыре изоформы NAT: NATI, NAT2, NAT3, NAT4 соответственно. У изоформ NAT1 wNAT2 было обнаружено большое разнообразие аллельных вариантов [1]. Данные об аллельном полиморфизме генов NAT1 и NAT2 позволили выделить в человеческой популяции носителей мутаций, обладающих фенотипом мед-
ленных и быстрых ацетнляторов [2]. Соотношение «быстрых» и «медленных» ацетиляторов значительно варьирует в популяциях с различным этническим и географическим происхождением.
Также установлена ассоциация полиморфизма гена ЫЛТ2 с различными заболеваниями и различной чувствительностью к лекарственным препаратам [4]. Так, например, наличие «медленного» фенотипа ацетилирования является фактором риска развития рака молочной железы и рака мочевого пузыря. Кроме того, генетический полиморфизм ЫЛТ2 может определять токсикологическое и фармакологическое действие лекарственных препаратов, которые подвергаются М-ацетилированию посредством данного фермента [3]. Например, «медленные» ацетиляторы характеризуются более продолжительным фармакологическим эффектом и, в то же время, обнаруживают повышенную чувствительность к некоторым лекарственным препаратам и побочным иммунотокси-ческим эффектам ариламинов и гидразинов.
Процессы ацетилирования М-ацетил-трансферазами сосредоточены главным образом в печени, но также этот фермент обнаруживают в легких, толстом кишечнике, почках, мочевом пузыре и даже в головном мозге.
Оба фермента играют важную роль в нейтрализации ксенобиотиков, катализируя перенос ацетильной группы с ацетил-кофермента, А (ацетил СоА) на концевой атом азота арилгидразинов и ариламин-содержащих лекарственных препаратов и канцерогенов. Типичными примерами лекарственных средств, подвергающихся катаболизму М-ацетил-трансферазами, являются сульфанила-
миды, противотуберкулёзные средства, транквилизаторы, психостимуляторы и многие другие. Число новых субстратов NAT постоянно растёт. Единственным известным на сегодняшний день эндогенным субстратом NAT1 является п-аминобензоилглутамат — продукт катаболизма фолиевой кислоты.
Активность ферментов NAT может быть управляема субстратоспецифич-ными агентами (селективно для NAT1 и NAT2) в каскадах реакций ацетилирования субстратов, приводящих к ацетилированным промежуточным ин-термедиатам и конечным метаболитам. Ингибирующее действие на фермент определяется фермент-субстратной реакцией и зависит от аффинности связывания с активным центром фермента ковалентными или нековалентными взаимодействиями.
Считается, что NAT2 обладает меньшей специфичностью и метаболизирует более широкий круг веществ, чем и привлекает наше внимание.
Подробное изучение субстратной специфичности и лекарственной биоактивации, как и другие исследования, требуют большого количества очищенного NAT. Первоначально этот фермент получали из животных источников, но из человеческих и животных тканей получать NAT2 в достаточном объёме невозможно.
Целью исследования стала разработка методологии и оптимизация условий получения рекомбинантного NAT2 человека в растворимом биологически активном виде в достаточном количестве для дальнейших исследований.
Материалы и методы
В работе по получению рекомби-
Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантной №ацетилтрансферазы-2 человека
нантного белкаацетилтрансферазы-2 человека (hNAT2) были использованы следующие методы:
• молекулярное клонирование фрагмента гена NAT2-
• моделирование и конструирование экспрессионого вектора-
• трансформация компетентных клеток, отбор клонов-
• выращивание культуры в селективных условиях-
• выделение и очистка целевого белка.
В качестве реципиентных клеток использовали бактерии Е. Coli компании «NewEnglandBioLabs». Генотип штамма: fhuA2 A (arg-lacZ)U169 phoAglnV44 980A (lacZ)M15 gyrA96 recAl relAl
endAl thi-1 hsdR17. Штамм с чувствительностью к ампициллину, канамици-ну, стрептомицину, спектиномицину, тетрациклину, хлорамфениколу и ни-трофурантиону.
Для экспрессии hNAT2 в бактериальной культуре была сконструирована экс-прессионнаяплазмида (рис. 1).
ПлазмидарЕТ-30 (b) hNAT2 сконструирована с целью выделения нативного белка NAT2 совместно со всем пулом бактериальных белков Е. Coli и последующего очищения с помощью гель-хроматографии. Для этого вектор NAT2 клонировали в полилинкер по сайтам рестрикции Kpnl и BamHI под контроль экспрессии лактозного оперона. Также плазмида несёт селективный маркер-ген устойчивости к канамицину.
Рис. 1. Кольцевая карта плазмиды рЕТ-30 (b), содержащая цельноразмерный ген hNAT2, 887 п.о. (фиолетовый цвет). Показаны основные рестриктазы, для которых имеются сайты узнавания на плазмиде.
Работа выполнена совместно с ЗАО «Евроген».
Следующим этапом работы явилась трансформация клеток экспрессионной плазмидой. Для этого использовали метод нагрева-оттаивания. Бактериальные клетки (100 мкл) в смеси с рекомби-нантной плазмидой (5 мкг/мл) подвергали непродолжительному нагреву на водяной бане при 42 °C в течение 1 мин, затем последующему выдерживанию во льду в течение 5 мин и инкубированию при 37 °C в течение 1 ч с добавлением питательной среды SOC до конечного объёма 1 мл.
После стадии восстановления клетки разводят в 100 раз средой SOC и высеивают либо на твёрдую среду, содержащую антибиотик, агарозу и индуктор экспрессии, либо в жидкую среду, также содержащую антибиотик и индуктор экспрессии. Бактериальные клетки культивируют при температуре 37 °C.
Выбор индуктора и его оптимальная концентрация была найдена в следующем эксперименте. В культуры трансформированных клеток были добавлены
два индуктора IPTG и лактоза в разных концентрациях (рис. 2), культивирование проходило 16 ч, после чего была замерена оптическая плотность (OD600) во всех образцах (Multiscan GO, Thermo Scientific).
По результату эксперимента в качестве индуктора было решено использовать IPTG с концентрацией 0,1 mM.
Бактериальные клетки культивировали при 37 °C и непрерывном перемешивании до OD=0,8−1. Затем бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 3700 об/мин в течение 10 мин, удаляли супернатант и ресуспендировали осадок в буфере TBS (6,06 гТрис и 8,76 rNaCl). Процедуру повторяли 3 раза, с каждым разом уменьшая объём отмывочного буфера. Пробирки с клетками помещали в ледяную баню и обрабатывали ультразвуком в течение 3 мин. Затем центрифугировали образцы на максимальной скорости при 4 °C, супернатант отбирали и замораживали.
Далее из клеточного лизата выделяли плазмидную ДНК и белковую
Я IPTG
I LAC
mM
Рис. 2. Зависимость оптической плотности бактериальных клеток в жидкой питательной среде от концентрации индуктора (лактозы и 1РТО).
Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантной N-ацетилтрансферазы^ человека
фракцию. Выделение плазмидной ДНК проводили двумя независимыми способами: методом щелочной экстракции и с помощью набора «ДНК-Сорб» («АмплиСенс»). Для выделения бактериальных плазмид методом щелочной экстракции готовили растворы буферов для ресуспендирования и лизиса. Второй метод выделения бактериальной плазмиды был осуществлён с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб» («АмплиСенс») в соответствии с протоколом производителя.
Измерение концентрации суммарной ДНК проводили на флуориметре Quibit 3,0 LifeTechnologies в соответствии с протоколом производителя. После процедуры выделения плазмидной ДНК концентрация ДНК в образцах, выделенных по протоколу щелочной экстракции, составила 19 680 нг/мл и 53 600 нг/мл по протоколу набора «ДНК-Сорб».
Для оценки уровня экспрессии гена hNAT2 и локализации белка из лизи-рованных клеток выделяли белковую фракцию. Для этого лизат центрифугировали при 4000 об/мин для отделения растворимой фракции от фракции, содержащей белок в тельцах включений, и подвергали очистке на мембранном катридже 30 кДа.
Для визуализации качественного и количественного состава белковой фракции образцы наносили на 12% гель для белкового электрофореза в системе ДСД-ПААГ (Mini-Protean Tetra, «BioRad»).
Оценку количественного состава белковых фракций на геле проводили с помощью программы ImageLab («BioRad») в соответствии с интенсивностью представленных полос белковых компонентов на электрофореграмме.
Результаты исследований
Электрофореграммы разделения белкового пула представлены на рис. Зи4.
Рис. 3. Анализ продукции белка hNAT2 методом электрофореза в полиакриламид-ном геле. Детекция в камере Gel/ChemiDoc («Bio-Rad»). 1-я дорожка — маркеры молекулярных масс- 2-я, 3-я дорожки — неочищенная на мембране растворимая фракция белков после лизирования бактериальных клеток Е. Coli.
Рис. 4. Анализ продукции белка hNAT2 методом электрофореза в полиакриламидном геле. Детекция в камере Gel/ChemiDoc («BioRad»). 1-я дорожка — очищенная на мембране 10 кДа фракция белка клеток Е. coli- 2-я, 3-я дорожки — без нагрузки образцами- 4-я дорожка — маркеры молекулярных масс.
Область молекулярной массы целевого белка hNAT2 имеет выраженную интенсивность флуоресценции и выделена в области 34−35 кДа.
Из 6,29 г бактериальной культуры удалось выделить белковую фракцию с концентрацией 3,14 мг/мл общего белка.
Анализ белковой фракции hNAT2 электрофорезом в полиакриламидном геле показал, что очищенная фракция была неоднородна по составу и содержала набор белков с молекулярной массой -45 кДа, -20 кДа, -17 кДа, -10 кДа.
Выводы
В ходе исследования по разработке методологии и оптимизации условий получения рекомбинантного NAT2 человека найдены оптимальные параметры наработки фермента в растворимой форме и достаточном количестве для биоаналитических in vitro экспериментов.
Данные результаты позволят использовать рекомбинантный фермент hNAT2 в серии постановок для оценки сравнительной ферментативной активности in vitro, а также проводить сравнительную оценку активности видоспецифичных
выделенных ферментов NAT-семейства лабораторных животных (мыши, крысы, мини-свиньи) с активностью полученного рекомбинантным способом фермента NAT2 человека.
Предварительно очищенная методами препаративной гель-проникающей и металл-аффинной хроматографии белковая фракция hNAT2 позволит проводить скрининговую оценку молекул-кандидатов в последующих исследованиях регуляции активности NAT2 человека (ингибиторов, активаторов).
Список литературы
1. Каркищенко H.H., Петрова Н. В., Слобо-денюк В. В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Natl и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных // Биомедицина. 2014. № 2. С. 4−16.
2. Кукес В. Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты. — М.: Реафарм. 2004. 144 с.
3. Grant D.M., Blum М., Meyers U.A. Polymorphisms of N-acetyltransferase genes // Xenobiotica. 1992. № 22. P. 1073−1081.
4. Hein D.W. Molecular genetics and function of NAT1 and NAT2: role in aromatic amine metabolism and carcinogenesis // Mutation Research. 2002. № 506−507. P. 65−77.
Development of methodology for production of a soluble form of recombinant human N-acetyltransferase-2
M.S. Dulya, E.D. Shevchenko, N.V. Petrova
The paper presents the development of a methodology and optimization of recombinant N-acetyltransferase-2 of human (hNAT2), found the optimal parameters of use of the enzyme in a soluble form and in sufficient quantity for the in vitro bioanalytical experiments. Presents data on the design of genetic constructs for efficient expression of recombinant enzyme human N-acetyltransferase 2, by the method of SDS-PAGE electrophoresis confirmed the molecular weight of the protein (34−35 kDa), indicated quantitative content ofenzyme (3. 14 mg/ml).
Key words: N-acetyltransferase-2 (NAT2), enzyme, method of SDS-PAGE electrophoresis, human.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой