Механизмы изменения сократительной функции поперечно#полосатых мышц мыши in vitro при белковой сенсибилизации.
Участие АТФ

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 53. 083. 32:612. 741:616−056. 3:616. 74−02−092. 9
Торшин В. И. 1, Теплов А.Ю.2 1 Российский университет дружбы народов 2Казанский государственный медицинский университет E-mail: vtorshin@mail. ru
МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЯ СОКРАТИТЕЛЬНОМ ФУНКЦИИ ПОПЕРЕЧНО-ПОЛОСАТЫХ МЫШЦ МЫШИ IN VITRO ПРИ БЕЛКОВОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ. УЧАСТИЕ АТФ
Изучалось участие АТФ в механизмах влияния белковой сенсибилизации (БС) на сократительную функцию и неквантовую секрецию ацетилхолина в зоне концевой пластинки (Н-эффект) изолированных скелетных мышц голени (m. soleus и m. extensor digitorum longus (m. EDL)) и полосок m. diaphragma мыши. У m. soleus и m. diaphragma динамика вектора силы мышечного сокращения коррелирует с изменениями Н-эффекта во всех изучаемых экспериментальных моделях. Однако степень этих изменений у сенсибилизированных животных менее выражена. Предположено, что АТФ является участником механизмов изменения функциональных свойств m. soleus и m. diaphragma при БС и отражает развитие механизмов резистентности в этих мышцах к внешним нагрузкам. Причины изменения силы сокращения m. EDL при БС не связаны с АТФ-опосредован-ными механизмами возбуждения мышцы.
Ключевые слова: сократительные свойства, неквантовая секреция ацетилхолина, m. diaphragma, m. soleus, m. extensor digitorum longus, мышь, белковая сенсибилизация, АТФ.
Развитие бронхиальной астмы сопровождается изменением функционального состояния дыхательных мышц, и, в первую очередь диафрагмы. Белковая сенсибилизация (БС) мышей — экспериментальная модель, которая широко распространена в практике исследования патогенеза аллергических заболеваний [9]. Диафрагма является «смешанной» мышцей и состоит как из «быстрых», так и «медленных» мышечных волокон (МВ) [5]. Ранее нами было показано, что при БС сократительные свойства полоски диафрагмы и «быстрой» и «медленной» скелетной мышцы (СМ) голени мыши in vitro [9] претерпевают существенные, разнонаправленные изменения. Причем, основная роль в механизмиах этих изменений отводится холиноопосредованным процессам возбуждения постсинаптической мембраны.
Ранее была показана способность экзогенной АТФ обратимо изменять сократительную функцию и величину неквантовой секреции аце-тилхолина вышеперечисленных мышц несенси-билизированных мышей [4]. В качестве кофактора синаптической передачи АТФ влияет на процессы возбуждения МВ. Кроме того, АТФ участвует в механизмах генерации иммунного ответа [7].
Цель работы
Изучение роли экзогенной АТФ в механизмах изменения сократительной функции изолированных поперечно-полосатых мышц мыши при БС: «медленной» — камбаловидной (m. soleus), «смешанной» — диафрагмальной (m. diaphragma) и «быстрой» — длинного разгибателя пальцев (m. extensor digitorum longus — m. EDL).
Проведено комплексное исследование. У ин-тактных и сенсибилизированных мышей сравнивались результаты влияния экзогенной АТ Ф на: 1) показатели сократительного ответа мышц, вызываемого агонистом — холиномиметиком карбахоли-ном (КХ) и 2) величину неквантовой секреции ацетилхолина (АХ) в зоне концевой пластинки.
Материалы и методы
Эксперименты проводились на белых мышах, обоего пола, массой тела 17−22 г. Животные сенсибилизировались овальбумином (ОА) с гелем гидроокиси алюминия (2 мкг сухого вещества геля + 150 мкг ОА в 0,5 мл физиологического раствора, «Sigma», USA) парентерально, дважды [3]. Вторая инъекция — через 14 дней после первой. В эксперимент животные забирались на пике сенсибилизации — на 7−10 день после второй сенсибилизирующей инъекции. Механомиографические исследования проводились на препарате изолированной мышцы в условиях изометрии, которая достигалась растяжением СМ в течение 20 минут с силой 0,5 г при постоянной перфузии раствором Кребса и температурном режиме — 20−21єС. Сокращение регистрировалось фотоэлектрическим преобразователем [2]. Агонист — КХ исследовался в субмаксимальных концентрациях, которые составляли для: m. soleus — 5×10−4М, m. diaphragma -2×10−4М, m. EDL — 7×10−4М. Оценивалась сила (Рос) сокращения мышцы на КХ.
Для изучения состояния постсинаптической мембраны МВ в области концевой пластинки, с помощью стеклянных микроэлектродов (сопротивлением 8−12 МЩ, заполненных 2,5 М KCl) измеряли неквантовую секрецию Ах [9]. Для опре-
деления ее величины сначала армином («Татхим-фармпрепараты», Россия) устранялось действие ацетилхолинэстеразы, после чего на мышцу в течении 8−12 минут апплицировался блокатор Н-холинорецепторов d-тубокурарин (ТБК — 10−5М). Разница значений мембранного потенциала (МП) до и после аппликации ТБК соответствует величине неквантовой секреции АХ (Н-эффект).
Влияние на мышцы АТФ («Boehringer Mannheim Gmbh», Germany) оценивалось сравнением показателей сокращения до и после 5 минутной перфузии их раствором, содержащим АТФ в заданной молярной концентрации (1×10−4М) — время действия ее на мышцу определялось длительностью перфузии.
Полученные результаты подвергались статистической обработке (BIOSTATISTICA, S.A. Glantz, McGraw Hill).
Результаты исследования
У m. soleus несенсибилизированной мыши инкубация с АТФ увеличивает Рос со 180,5±6,8 до 224,3±12,9 мг (р& lt-0,01). В условиях БС инкубация с АТФ увеличивает Рос m. soleus с 235,67±19,55 до 264,33±21,09 мг (р& lt-0,01). Изучение неквантовой секреции Ах m. soleus несенсибилизированной мыши показало, что инкубация с АТ Ф снижала значение Н-эффекта с 5,0±0,7 до 1,0±0,5 мВ (р& lt-0,05). При Б С инкубация с АТФ снижала значение Н-эффекта с 3,1±0,6 до 2,1±0,5 мВ (р& lt-0,05).
У m. diaphragma несенсибилизированной мыши инкубация с АТФ увеличивает Рос с 335,2±93,47 до 425,2±100,9 мг (р& lt-0,05).В условиях БС инкубация с АТФ увеличивает Рос с 469,83±86,78 до 540,67±80,34 мг (р& lt-0,05). Н-эф-фект у m. diaphragma несенсибилизированной мыши при инкубации с АТФ снижался с 5,2±0,4 до 1,5±0,5 мВ (р& lt-0,001). При Б С инкубация с АТФ снижала значение Н-эффекта с 4,4±0,5 до 2,4±0,6 мВ (р& lt-0,001).
У m. EDL несенсибилизированной мыши инкубация с АТФ снижает Рос, с 75,2±5,43 до 52,4±5,8 мг (р& lt-0,01). В условиях БС инкубация с АТФ приводила к снижению Рос m. EDL с 59,5±3,3 до 44,5±3,3 мг (р& lt-0,01). Н-эффект m. EDL несенсибилизированной мыши при инкубации с АТФ практически не изменялся: 5,1±0,4 мВ до инкубации и 4,8±0,5 мВ (р& gt-0,05) после инкубации. В условиях БС инкубация с АТФ так же практически не изменяла этот показатель: 5,8±0,5 мВ до инкубации и 5,3±0,5 мВ (р& gt-0,05) после инкубации.
Обсуждение
Показано, что БС изменяет сократительную функцию всех изученных нами мышц мыши. При-
чем, характер изменений для «быстрой» мышцы с одной стороны, «смешанной» и «медленной» с другой существенно различается. Причины этого кроются как в исходных различиях их морфофункционального статуса [5,6], так и в механизмах, обеспечивающих эти изменения в процессе аллергической перестройки организма. Необходимо отметить, что у мышей нет поперечно-полосатых мышц, состоящих только из «медленных» МВ. M. soleus содержит 50−60% «медленных» МВ, m. EDL на 97−100% состоит из «быстрых» [6]. M. diaphragma с 88,6% быстрого миозина [5] занимает между ними промежуточное положение.
При Б С сила сокращения «быстрой» мышцы на КХ снижается, «медленной» и «смешанной» возрастает. Разнонаправленность этих изменений свидетельствует, что обнаруженные различия отражают, в первую очередь, состояние поверхностной мембраны [1] и холиноопосредованные процессы ее возбуждения. Сопоставление динамики силы с изменением уровня неквантовой секреции Ах в зоне концевой пластинки (Н-эффекта) подтверждают это предположение. При Б С вектор изменения силы коррелирует с изменением Н-эффекта. Логично предположить, что у «смешанной» и «медленной» мышц увеличение силы сокращения на Кх является следствием увеличения чувствительности постсинапса к холиномиметику, отражением чего является снижение Н-эффекта (Рисунок 1, 2). Снижение неквантовой секреции Ах в зоне синапса вызывает снижение интенсивности механизмов десенситизации холинорецепторов (ХР) постси-наптической мембраны. Соответственно, у «быстрой» мышцы наблюдается обратная картина. Снижение силы сокращения на КХ является следствием уменьшения чувствительности ее постсинапса к холиномиметику, что проявляется в увеличении Н-эффекта (Рисунок 3).
Причины обнаруженной вариабельности функциональных свойств изучаемых мышц при БС заключаются, возможно, в механизмах выделения кофакторов синаптической передачи. Исходя из данных Tsai TL et al. [10], показавших роль АТФ в генерации иммунного ответа мы предположили возможное участие пуринов в процессах изменения функции поперечно-полосатых мышц при БС. Это подсказало нам идею изучения, в рамках выбранных экспериментальных моделей динамики функциональных свойств изучаемых мышц (полоски m. Diaphragma, m. Soleus и m. EDL) сенсибилизированных и интактных мышей до и после инкубации их с АТФ.
Наши исследования, подтвердившие полученные ранее результаты [4] показали, что АТФ повышает силу сокращения на КХ у полоски
т. Б1арЬга^а и ш. 8о1еи8 и снижает этот показатель у ш. ББЬ. Уровень неквантовой секреции АХ у m. Diaphragma и т. 8о1еи8 снижается, у ш. ББЬ не изменяется. У m. Diaphragma и т. 8о1еи8 вектор динамики силы и величины Н-эффекта при влиянии АТФ совпадал с таковыми при БС, что позволило предположить нам последовательность событий, когда увеличение силы сокращения является следствием возрастания чувствительности постсинапса к холиномиметику (Рисунок 1, 2). В условиях сенсибилизации влияние АТФ на динамику вышеперечисленных свойств и у m. Diaphragma, и у ш^оЬ^ демонстрирует ту же направленность, что указывает на отсутствие принципиальных различий в механизмах влияния пуринов на «медленную» и «смешанную» мышцы
интактных и сенсибилизированных мышей (Рисунок 1, 2).
Однако, если АТФ увеличивала силу сокращения m. Diaphragma интактных животных на 26,8%, то у сенсибилизированных — лишь на 15,1%. Н-эффект у этой мышцы несенсибилизированных мышей после влияния АТФ снижался до 28,8% от исходного, у сенсибилизированных же лишь до 54,5%. Менее выраженная динамика функциональных свойств m. Diaphragma, вызванная АТФ у сенсибилизированных мышей в сравнении с контролем позволяет нам предполагать ее участие в механизмах функциональных изменений дыхательных мышц при БС.
У «медленной» мышцы динамика функциональных свойств имеет сходную картину. Если
а) б)
интактные мыши
а) б)
сенсибилизированные мыши
Рисунок 1. Функциональные характеристики изолированной m. soleus интактных (n=8) и сенсибилизированных (n=6) мышей до (контроль) и после (опыт) влияния АТФ: а) сила сокращения, вызванного Кх (5×10−4 М) б) величина Н эффекта (n=150)
_ контроль
1
а)
б)
интактные мыши
а) б)
сенсибилизированные мыши
Рисунок 2. Функциональные характеристики изолированной полоски диафрагмы интактной (п=10) и сенсибилизированной (п=7) мыши до (контроль) и после (опыт) влияния АТФ: а) сила сокращения, вызванного Кх (2×10−4 М) б) величина Н эффекта (п=150)
а) б)
интактные мыши
а) б)
сенсибилизированные мыши
Рисунок 3. Функциональные характеристики изолированной ш. ББЬ интактной (п=8) и сенсибилизированной (п=6) мыши до (контроль) и после (опыт) влияния АТФ: а) сила сокращения, вызванного Кх (7×10−4 М)
б) величина Н эффекта (п=150)
сила сокращения ш. 8о1еи8 интактных животных после влияния АТФ возрастала на 24,3%, то у сенсибилизированных — лишь на 12,2%. Н-эффект ш. 8о1еи8 несенсибилизированных мышей после влияния АТФ снижался до 20% от исходного, у сенсибилизированных же лишь до 67,7%. Менее выраженная динамика функциональных свойств ш. 8о1еи8, вызванная АТФ у сенсибилизированных мышей в сравнении с контролем так же позволяет нам предполагать ее участие в механизмах функциональных изменений «медленных» мышц при БС (Рисунок 1).
У ш. БББ интактных животных снижение силы сокращения после влияния АТФ (до 72,6%) практически не отличалась от таковой у сенсибилизированных (до 74,8%). Н-эффект ш. БББ после влияния АТФ достоверно не менялся ни у ин-тактных ни у сенсибилизированных мышей. Отсутствие различий в изменении силы сокращения и уровня неквантовой секреции АХ после влияния АТФ у обеих групп животных свидетельствует о неучастии пуринов в механизмах изменения сократительной функции «быстрой» мышцы мыши, вызванных БС (Рисунок 3).
Возможные пути влияния АТ Ф в наших экспериментальных моделях весьма разнообразны и включают в себя прямое действие пуринов на контрак-тильные структуры, секрецию медиатора, системы внутриклеточных посредников [4] и работу АТФ-
зависимых калиевых каналов [10]. Кроме того, можно предположить участие АТФ на некоторых этапах генерации иммунного ответа. В частности, в литературе показано, что АТФ, увеличивая продукции интерлейкина-1 способна усиливать специфическое звено иммунитета [7]. Внеклеточная АТФ при генерации иммунного ответа помогает образованию активной каспазы-1, что в свою очередь обеспечивает секрецию биологически активных форм интерлейкина-1. Гиперэкспрессия рецептора Р2Х7 приводит к секреции зрелого интерлейкина-1Я [8].
Выводы.
При белковой сенсибилизации снижается динамика функциональных свойств диафрагмы мыши, вызванная экзогенной АТФ. Это свидетельствует о развитии механизмов резистентности дыхательных мышц к внешним нагрузкам, возникающих при обструктивных формах нарушения внешнего дыхания аллергической природы.
Наличие сходных изменений у «медленной» ш. 8о1еи8 мыши и их отсутствие у «быстрой» Ш. БББ позволяет предположить, что обнаруженные механизмы компенсации основной дыхательной мышцы при бронхиальной астме определяются изменениями в «медленных» мышечных волокнах. В изменении сократительной функции «быстрой» мышцы при БС можно ожидать участие иных, не связанных с АТФ механизмов.
-------------------------- 12. 10. 2011
Список литературы:
1. Адо А. Д., Стомахина Н. В., Тулуевская Л. М. и др. Белковые спектры и фосфолипидный состав мембран, обогащенных холинорецепторами из скелетных мышц крыс в условиях сенсибилизации // Бюлл. эксп. биол. Медицины.- 1984.- Т. 99. -№ 7.- с. 84−86.
2. Ахметзянов Р. Х., Филиппов Е. Б. Измерение силовых характеристик мышечных волокон с помощью фотоэлектрического преобразователя // Физиол. ж. СССР, — 1986.- т. 72.- № 3.- с. 387−390.
3. Гущин И. С., Зебрева А. И., Богуш Н. Л. и др. Экспериментальная модель для разработки и оценки способов контроля немедленной аллергии // Патол. физиол. и эксперимент. Терапия.- 1986.- № 4.- с. 18−23.
4. Фархутдинов А. М., Теплов А. Ю. Механизмы влияния экзогенной АТФ на сократительную функцию изолированных поперечно-полосатых мышц мыши // Вестник Санкт-Петербургского университета.- Сер11.- вып.2.- 2010.- с. 238−244.
5. Blank S., Chen V, Ianuzzo CD. Biochemical characteristics of mammalian diaphragms // Respir. Physiol.- 1988.- V. 74.- № 1. -P. 115−125.
6. Florendo J.A., Reger J.F., Law P.K. Electrophysiologic differences between mouse extensor digitorum longus and soleus // Exp. Neurol.- 1983.- Nov. 82(2).- с. 404−412.
7. Mariathasan S., Monack M. Inflammasome adaptors and sensors: intracellular regulators of infection and inflammation // Nat. Rev. Immunol.- 2007.- V.7.- p. 31−40.
8. Solle M, Labasi J., Perregaux D. et al. Altered cytokine production in mice lacking P2X (7) receptors // J. Biol. Chem.- 2001. -v. 276.- p. 125−132.
9. Teplov A., Grishin S, Mukhamedyarov M, et al. Ovalbumin-induced sensitization affects non-quantal acetylcholine release from motor nerve terminals and alters contractility of skeletal muscles in mice // Exp. Physiol.- 2009.- Feb. 94(2).- p. 264−268.
10. Tsai TL, Chang SY, Ho CY. et al. Role of ATP in the ROS-mediated laryngeal airway hyperreactivity induced by laryngeal acid-pepsin insult in anesthetized rats // J. Appl. Physiol.- 2009.- May. 106(5).- p. 1584−92.
Сведения об авторах: Торшин Владимир Иванович, заведующий кафедрой нормальной физиологии Российского университета дружбы народов, профессор, д.б.н., профессор 117 198, Россия, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, тел. (495)4345266, e-mail: vtorshin@mail. ru Теплов Александр Юрьевич, доцент кафедры патофизиологии Казанского государственного медицинского университета, к.б.н., доцент 420 012, Россия, г. Казань, ул. Бутлерова д. 49, тел. (843)2345950, e-mail: AlikTeplov@mail. ru
UDC 53. 083. 32:612. 741:616−056. 3:616. 74−02−092. 9
Torshin V.I. 1, Teplov A.Y. 2
1Peoples' Friendship University of Russia
2Kazan State Medical University
CHANGE MECHANISM OF CONTRACTILE FUNCTION OF STRIATED MUSCLE MOUSE IN VITRO BY PROTEIN SENSITIZATION. INVOLVEMENT OF ATP
We investigated the involvement of ATP in the mechanism of the effect of protein sensitization (PS) on contractile function and non-quantum secretion of acetylcholine in the area of end-plate (H-effect) of isolated skeletal muscles of leg (m. soleus and m. extensor digitorum longus (m. EDL)) and stripes m. diaphragma mouse. In m. soleus and m. diaphragma dynamics of the force vector of muscle contraction is correlated with changes in the H-effect in all the studied experimental models. However, the extent of these changes in sensitized animals is less pronounced. It has been suggested that ATP is a party change in the mechanisms of functional properties m. soleus and m. diaphragma in PS and reflects the development of resistance mechanisms in these muscles to external loads. The reasons for the changes in contraction force m. EDL PS not related to ATP-mediated excitation mechanism of the muscle.
Key words: contractile properties, nonquantum secretion of acetylcholine, m. diaphragma, m. soleus, m. extensor digitorum longus, mouse, protein sensitization, ATP

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой