Оценка методов амплификации нуклеиновых кислот, применяемых для выявления Neisseria gonorrhoeae в России

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

60
оригинальные исследования
© Е. В. Шипицына1, Е. А. Золотоверхая 1, А. М. Савичева 1, Е. В. Соколовский2, А. А. Максимова 2, А. С. Бенькович 2,
A. А. Крысанова 1, С. О. Хьелмеволл 3,
B. Скоген 4, M. Домейка 5, M. Унемо 6
ОЦЕНКА МЕТОДОВ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ NEISSERIA GONORRHOEAE В РОССИИ
УДК: 616. 973−07
1 Лаборатория микробиологии, ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, Санкт-Петербург, Россия
2 Кафедра кожных и венерических болезней с клиникой, Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия
3 Отделение микробиологии и инфекционного контроля, Университетский госпиталь Северной Норвегии, Тромсё, Норвегия
4 Отделение медицины, Университетский госпиталь Северной Норвегии, Тромсё, Норвегия
5 Отделение медицинских наук, Уппсальский университет, Уппсала, Швеция и ВосточноЕвропейский комитет здравоохранения Швеции, Стокгольм, Швеция
6 Национальная референс-лаборатория по патогенным нейссериям, Отделение клинической микробиологии, Университетский госпиталь Оребро, Оребро, Швеция
¦ Целью данного исследования было оценить диагностические характеристики методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), применяемых в нашей стране для выявления Neisseria gonorrhoeae. Пять тестов на основе полимеразной цепной реакции (ПНР) и один тест, основанный на технологии NASBA (nucleic acid sequence-based amplification — амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот), разработанные тремя российскими компаниями, оценивались при исследовании соскобов из цервикального канала и проб мочи от женщин (n=319), соскобов из уретры и проб мочи от мужчин (n=127), а также материалов, полученных со слизистой задней стенки глотки и прямой кишки от дополнительной группы женщин
с подозрением на гонорею (n=50). Распространенность N. gonorrhoeae составила 2,7 и 16% среди пациентов, у которых были получены уроге-нитальные и экстрагенитальные пробы соответственно. Чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов российских тестов для разных образцов составили 66,7−100%, 100%, 100% и 99,4−100% соответственно.
¦ Ключевые слова: Neisseria gonorrhoeae- методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) — псевдоген porA- чувствительность- специфично сть.
Введение
В большинстве стран золотым стандартом диагностики гонококковой инфекции остается культуральный метод, который характеризуется высокой специфичностью. Однако чувствительность метода в большой степени зависит от качества взятия образца, транспортировки проб и условий культивирования. Методы выявления Neisseria gonorrhoeae, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), имеют целый ряд преимуществ перед традиционными методами диагностики (культуральным и микроскопическим), таких как более высокая чувствительность, возможность использования образцов, полученных неинвазивным путем, быстрота, а также автоматизация процесса диагностики. Тем не менее МАНК, используемые для диагностики гонококковой инфекции, имеют некоторые существенные ограничения, например, более высокую стоимость, риск контаминации и ингибирования, в большинстве случаев неоптимальную специфичность и, что наиболее важно, отсутствие возможности полу-
чения данных об антибиотикорезистентности микроорганизма [15, 18, 29].
В предыдущих исследованиях было показано, что лабораторная диагностика гонореи в Санкт-Петербурге не может считаться оптимальной, что в целом отражает сложившуюся ситуацию во многих регионах России [8, 19, 22]. Выявление N. gonorrhoeae в большинстве случаев основывается на микроскопическом исследовании мазков, окрашенных по Граму, и лишь немногие лаборатории используют культураль-ный метод. При этом культуральная диагностика характеризуется очень низкой чувствительностью, отсутствием селективных питательных сред и методов видовой идентификации, а также редким использованием тестов для определения антибиотикорезистентности. В последние годы в России в муниципальных, федеральных и частных лабораториях для выявления N. gonorrhoeae широко внедряются МАНК. В настоящее время в целом в Российской Федерации не рекомендовано использовать МАНК как единственный метод диагностики гонококковой инфекции
[18] и применение МАНК для выявления N. gonorrhoeae до сих пор не регламентировано ни одним приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации. Однако МАНК могут использоваться для скрининга в популяциях высокого риска, а также при отсутствии возможности правильного взятия образцов, транспортировки и проведения культурального исследования.
Для диагностики гонореи предложено несколько международных коммерческих тест-систем на основе МАНК, которые способны одновременно выявлять Chlamydia trachomatis. К числу таких тестов относятся Cobas Amplicor/ TaqMan CT/NG (Roche Diagnostics), Abbott m2000rt CT/NG (Abbott Laboratories), BD ProbeTec ET CT/NG (Becton Dickinson) и AMP-NG и Aptima Combo 2 (Gen-Probe). Кроме того, в литературе описан целый ряд так называемых in-house («домашних») тест-систем на основе МАНК, в основном ПЦР, основанных на определении различных генов N. gonorrhoeae [1, 2, 3, 5, 11, 15, 29]. В нашей стране в рутинной диагностике гонококковой инфекции используются только тесты, разработанные и произведенные в России в связи с существенно более высокой стоимостью международных тестов. Однако до настоящего времени полноценной оценки тестов российского производства не проводилось.
Целью данного исследования явилась оценка диагностических характеристик шести тест-систем на основе МАНК, широко используемых в настоящее время для выявления N. gonorrhoeae в России. В качестве референс-метода использовали ПЦР в реальном времени, мишенью в которой является псевдоген N. gonorrhoeae porA. Данный метод валидирован с использованием большого количества лабораторных и клинических штаммов N. gonorrhoeae [2, 6].
Материалы и методы
Оцениваемые МАНК
Оценивались следующие МАНК: ПЦР с элек-трофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании ДНК-технология, Москва (ПЦР-эф-Дт и ПЦР-рв-Дт), ПЦР с элек-трофорезной детекцией компании Литех, Москва (ПЦР-эф-Л), ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в ЦНИИ эпидемиологии, Москва (ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-рв-ИЭ), и тест, основанный на технологии NASBA в реальном времени (bioMerieux, Boxtel, Нидерланды), с мишень-специфическими олиго-нуклеотидами, разработанными в ЦНИИ эпидемиологии (таблица 1).
Исследуемая популяция
Для участия в исследовании были приглашены пациенты трех молодежных центров Санкт-Петербурга, имевшие симптомы урогениталь-ной инфекции (выделения из мочеполовых органов, дизурию и т. п.) и не принимавшие антибиотики в течение четырех недель до участия в исследовании. С ноября 2006 по январь 2007 гг. в исследование было включено 446 пациентов (319 женщин и 127 мужчин). Материалами для исследования служили соскобы из церви-кального канала и моча у женщин и соскобы из уретры и моча у мужчин. От двух женщин были получены только цервикальные образцы. Кроме того, от дополнительной группы, состоящей из 50 женщин с подозрением на гонококковую инфекцию (клинические симптомы и/или обнаружение грамотрицательных диплококков при микроскопии препарата, окрашенного по Граму, и/или гонококковая инфекция у партнера), были получены материалы со слизистой задней стенки глотки и прямой кишки. Таким образом, всего было исследовано 990 проб (319 соскобов из цервикального канала, 317 проб мочи от женщин, 127 соскобов из уретры от мужчин, 127 проб мочи от мужчин, 50 мазков со слизистой задней стенки глотки и 50 мазков со слизистой прямой кишки).
Все участники исследования заполнили анкеты относительно их возраста, пола и наличия симптомов заболевания. Средний возраст женщин составил 20,7 лет (диапазон от 15 до 30 лет), средний возраст мужчин — 20,8 лет (диапазон от 15 до 27 лет).
Настоящее исследование было одобрено этическим комитетом ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН, Санкт-Петербург, Россия.
Взятие образцов и пробоподготовка
Сбор образцов, выделение ДНК, анализ и интерпретация результатов проводились согласно инструкциям производителей. Соскобы из цер-викального канала и уретры для исследования тест-системами ПЦР-эф-Дт, ПЦР-рв-Дт и ПЦР-эф-Л собирали с помощью дакроновых тампонов и помещали в 200 мкл реагента ДНК-экспресс (Литех). Соскобы из цервикального канала и уретры для исследования тест-системами ПЦР-эф-ИЭ, ПЦР-рв-ИЭ, NASBA и референс-ПЦР собирали также с помощью дакроновых тампонов и помещали в 1 мл 2^Р среды (сахарозо-фосфатный буфер). Образцы мочи собирались в контейнеры объемом 25 мл и затем транспортировались при температуре окружающей среды в течение 1−4 часов в лабораторию микробиоло-
Характеристики тестов, основанных на амплификации нуклеиновых кислот, разработанных и используемых в России для диагностики гонококковой инфекции
Характеристика Метод1
ПЦР-эф-Дт ПЦР-рв-Дт ПЦР-эф-Л ПЦР-эф-ИЭ ПЦР-рв-ИЭ NASBA
Генетическая мишень Псевдоген рогА Псевдоген рогА Ген сррВ Ген сррВ/тея цитозин ДНК метилтранс феразы3 Ген 16S рРНК 16S рРНК
Технология выделения нуклеиновых кислот ДНК-экпресс (Литех) ДНК-экпресс (Литех) ДНК-экпресс (Литех) ДНК-сорбА (ЦНИИ эпидемиологии) ДНК-сорбА (ЦНИИ эпидемиологии) NucliSens Isolation Reagents (bioMerieux)
Внутренний контроль Включен в реакционную смесь Включен в реакционную смесь Включен в реакционную смесь Добавляется до выделения ДНК Добавляется до выделения ДНК Добавляется до выделения ДНК
Объем реакции (объем ДНК/РНК) 35 (5) мкл 35 (5) мкл 25 (5) мкл 25 (10) мкл 25 (10) мкл 20 (5) мкл
Прибор для амплификации Терцик (ДНК-технология) iQ iCycler (BioRad, США) Терцик (ДНК-технология) Терцик (ДНК-технология) RotorGene (Corbett Research, Австралия) NucliSens EasyQ (bioMerieux)
Программа амплификации Пауза: 94 °С/90 с Пауза: 80°С/60 с Пауза: 93 °С/30 с Пауза: 95°С/5 мин Пауза: 95° С/5 мин Пауза: 4ГС/90 мин2
5 циклов: 94°С/20 с 64 ° С/5 с 72 ° С/5 с Пауза: 94 ° С/90 с 35 циклов: 93°С/10 с 60°С/10 с 72°С/10 с 42 цикла: 95°С/10 с 65°С/10 с 72°С/10 с 10 циклов: 95°С/20 с 65°С/20 с 72° С/20 с
5 циклов: 94°С/30 с 64° С/45 с
40 циклов: 94 ° С/5 с 64 ° С/5 с 72 ° С/5 с 2 цикла: 80°С/30 с2 Пауза: 72 °С/60 с Пауза: 72 ° С/60 с 35 циклов: 95°С/20 с 60°С/30 с2 72 ° С /15 с
45 циклов: 94°С/10 с 64° С/45 с2
Флюорофоры (МАНК в реальном времени)4 FAM/HEX FAM/. TOE FAM/. TOE
Предел детекции в ПЦР (число копий ДНК на реакцию) 1−3 1−3 3−6 1−3 1
1 ПЦР-эф-Дт и ПЦР-рв-Дт, ПЦР с элекгрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании ДНК-технология, Москва- ПЦР-эф-Л, ПЦР с элекгрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании Литех, Москва- ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-рв-ИЭ, ПЦР с элекгрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные ЦНИИ эпидемиологии, Москва. 2 Этапы детекции флюоресценции. 3 В ПЦР-эф-ИЭ используются две мишени, т. е. сррВ ген и ген цитозин ДНК метилтрансферазы- образец считается положительным только в случае положительных результатов в обеих реакциях. 4 Зонд специфический для N. gonorrhoeae / Зонд специфический для внутреннего контроля.
гии ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН. После тщательного перемешивания на вортексе из каждого образца, содержащего материал из цервикального канала, и каждого образца мочи были отобраны аликвоты объемом 500 мкл, которые в замороженном виде пересылались в Отделение микробиологии и инфекционного контроля Университетского госпиталя Северной Норвегии (Тромсё, Норвегия) для анализа с помощью референс-ПЦР. Референс ПЦР также применяли для анализа проб мочи от женщин и соскобов из уретры, для которых были получены дискордантные результаты.
Выделение нуклеиновых кислот
ДНК-экспресс
Для ПЦР-эф-Дт, ПЦР-рв-Дт и ПЦР-эф-Л ДНК
выделяли с использованием технологии ДНК-экспресс (Литех), основанной на термокоагуля-ционном кондиционировании ДНК. Пробирки, содержащие генитальные мазки в реагенте ДНК-экспресс, перемешивали на вортексе в течение 15 секунд, инкубировали при 98 ° С в течение 10 минут и затем центрифугировали при 13 000 х g в течение 15 секунд. Супернатант использовали для постановки ПЦР.
Образец мочи (10 мл) центрифугировали при 3000 х g в течение 15 мин, отбирали супернатант, и 500 мкл осадка переносили в пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл. Затем центрифугировали концентрированный образец мочи при 13 000 х g 15 с, супернатант удаляли, добавляли 200 мкл ДНК-экспресс реагента, после чего образцы обрабатывали согласно процедуре, описанной выше для генитальных образцов.
ДНК-сорбА
Для методов ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-рв-ИЭ ДНК
была выделена с использованием сорбентного метода ДНК-сорбА (ЦНИИ эпидемиологии). Пробы перемешивали на вортексе и затем 100 мкл каждого образца смешивали с 300 мкл лизирующего буфера и 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО). После этого смесь инкубировали при 65 ° С в течение 5 мин, несколько секунд центрифугировали, затем добавляли 20 мкл силикагеля в каждый образец и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин, встряхивая каждые 2 мин. После этого образцы центрифугировали при 12 000 х g, осадок промывали дважды в 1 мл 70%-го этанола и сушили при 65 °C в течение 10 мин. ДНК элюировали ТЕ буфером (Tris-EDTA) и использовали для постановки ПЦР.
Образцы мочи (1 мл) центрифугировали при 12 000 х g 15 мин, супернатант удаляли, и из 100 мкл осадка выделяли ДНК согласно процедуре, описанной выше.
Выделение нуклеиновых кислот для NASBA
Выделение нуклеиновых кислот из клинических проб проводили с применением набора NucliSens® Isolation Reagents (BioMerieux) в соответствии с инструкцией производителя. Образцы встряхивали на вортексе, затем 100 мкл каждого образца смешивали с 900 мкл лизирующего буфера и 10 мкл ВКО. Смесь еще раз встряхивали и центрифугировали несколько секунд, после чего добавляли 50 мкл силики и инкубировали еще 10 мин, встряхивая каждые 2 мин. Осадок промывали один раз в 1 мл промывочного буфера, дважды в 1 мл 70%-го этанола и, последний раз, в 1 мл ацетона. После подсушивания при 56 ° C в течение 10 мин нуклеиновые кислоты элюирова-ли в 50 мкл элюирующего буфера и использовали для постановки с помощью метода NASBA.
Образцы мочи (1 мл) центрифугировали при 12 000 х g 15 мин, супернатант удаляли, а 100 мкл осадка подвергали процессу выделения ДНК, описанному выше.
Выделение ДНК для референс-ПЦР
ДНК выделяли из 200 мкл пробы в роботизированной системе MagNA Pure LC с использованием реагентов MagNA Pure LC DNA Isolation kit III (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Германия) согласно инструкции производителя. Выделенную ДНК хранили при 4 °C и использовали течение 1 дня.
МАНК
Российские тесты на основе ПЦР
Основные характеристики исследуемых МАНК представлены в таблице 1. В каждую реакцию были включены положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец, включенные в состав тест-систем.
Продукты амплификации анализировали путем электрофореза в 1,5%-м агарозном геле с добавлением бромистого этидия. В каждый электрофорез был включен маркер молекулярного веса Gene Ruler DNA Molecular Weight Marker (Fermentas, Kaunas, Литва) для определения размеров ампликонов.
В реакциях ПЦР-эф-Дт, ПЦР-рв-Дт и ПЦР-эф-Л ВКО входит в состав реакционной смеси. В случае ингибирования образцы обрабатывались согласно инструкциям производителей: 100 мкл образца добавляли в новую пробирку с ДНК-экспрессом, после чего реакционную смесь перемешивали на вортексе в течение 15 с, инкубировали при 98 ° C в течение 10 мин, центрифугировали при 13 000 х g в течение 15 с и использовали су-пернатант в новой постановке ПЦР.
В реакциях ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-рв-ИЭ ВКО добавляется до выделения ДНК, что позволяет кон-
Таблица 2
Несовпадающие результаты тестов для выявления Neisseria gonorrhoeae
ПЦР-эф-Дт1 ПЦР-рв-Дт1 ПЦР-эф-Л1 ПЦР-эф-ИЭ1 ПЦР-рв-ИЭ1 NASBA1 ПЦР в реальном времени с псевдогеном porA Количество образцов
Цервикальные образцы (n = 319) + + - + + + + 1
Пробы мочи от женщин (n = 317) + + - + + + + 1
— - - + + + + 1
1 ПЦР-эф-Дт и ПЦР-рв-Дт, ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании ДНК-технология, Москва- ПЦР-эф-Л, ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании Литех, Москва- ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-рв-ИЭ, ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные ЦНИИ эпидемиологии, Москва- NASBA разработана ЦНИИ эпидемиологии, Москва, Россия. + - положительный---отрицательный.
тролировать не только наличие ингибиторов, но и качество выделения ДНК. Если ВКО не амплифи-цировался, исследовали новую порцию исследуемого образца после 10-кратного разведения 2-SP буфером.
NASBA в реальном времени
Анализ клинических проб методом NASBA проводили с применением тест-системы Neisseria gonorrhoeae NASBA-Real-time (ЦНИИ эпидемиологии), состоящей из базового набора Nucli-Sens® Basic Kit (BioMerieux) и мишеньспе-цифических олигонуклеотидов (ЦНИИ эпидемиологии), в соответствии с инструкцией производителя. Общий объем реакционной смеси составлял 20 мкл: 5 мкл препарата нуклеиновых кислот, 5 мкл смеси ферментов и 10 мкл ампли-фикационной смеси. Смесь ферментов, состоящую из Т7 РНК-полимеразы, обратной транс-криптазы вируса миелобластоза птиц, РНКазы H и альбумина бычьей сыворотки, добавляли к реакционной смеси в ходе 2-минутной инкубации при 41 ° С, которую проводили после высокотемпературной денатурации мишени РНК (2 мин при 65 ° С). Реакцию NASBA с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени проводили в течение 90 мин при 41 ° C в анализаторе NucliSens® EasyQ Analyser (BioMerieux). Интерпретация результатов осуществлялась согласно инструкции по применению тест-системы. В качестве критерия определения клинического образца как положительного или отрицательного использовалось пороговое значение флюоресценции, установленное при анализе выборки отрицательных образцов.
Референс-ПЦР
ПЦР проводили в соответствии с описанной ранее процедурой [2].
Интерпретация результатов
Все положительные образцы тестировали в дублях. Проба считалась положительной, если поло-
жительный результат оцениваемой тест-системы подтверждался референс-методом, или в случаях, когда референс метод давал отрицательный результат, а все тест-системы российского производства давали положительный результат. Однако последнего варианта в данном исследовании не наблюдалось.
Определение пределов детекции ПЦР российского производства
Пределы детекции ПЦР российского производства определяли с использованием Neisseria gonorrhoeae Quantitated Bacterial DNA Control (Advanced Biotechnologies, Колумбия, США) в серии двух- и десятикратных разведений- все разведения тестировали как минимум дважды.
Результаты
При анализе урогенитальных образцов ДНК/РНК гонококка была обнаружена у семи женщин (2,2%) и пятерых мужчин (3,9%). Все оцениваемые МАНК показали высокий уровень совпадения результатов друг с другом и с референс-методом. У женщин совпадение результатов для цервикальных проб и проб мочи составило 99,7 и 99,4%, соответственно. Пять ложноотрицательных результатов (три разные пробы) были получены при использовании МАНК российского производства, а именно — один положительный цервикальный образец и один положительный образец мочи были пропущены при исследовании ПЦР-эф-Л и еще один положительный образец мочи был пропущен при исследовании ПЦР-эф-Л, ПЦР-эф-Дт и ПЦР-рв-Дт (таблица 2).
У мужчин совпадение результатов всех тестов равнялось 100%. Более того, среди экстрагени-тальных образцов, полученных от дополнительной группы женщин (n = 50), также наблюдалось 100% совпадение результатов МАНК российского производства и референс-метода. У восьми женщин из этой группы (16%) была обнару-
Таблица 3
Диагностические характеристики тестов, разработанных и используемых в России для диагностики гонококковой инфекции
Материал Тест1 Чувствительность (%) Специфичность (%) ПЗПР (%) ПЗОР (%)
Женщины
Соскобы из цервикального канала (п = 319) ПЦР-эф-Дт ПЦР-рв-Дт ПЦР-эф-ИЭ ПЦР-рв-ИЭ ЫАБВА ПЦР-эф-Л 100 83,3 100 100 100 100 100 100
Моча (п = 317) ПЦР-эф-ИЭ ПЦР-рв-ИЭ ЫАБВА 100 100 100 100
ПЦР-эф-Дт 83,3 100 100 99,7
ПЦР-рв-Дт 83,3 100 100 99,7
ПЦР-эф-Л 66,7 100 100 99,4
Мазки из задней стенки глотки (п = 50) и прямой кишки (п=50) ПЦР-эф-Дт ПЦР-рв-Дт ПЦР-эф-Л ПЦР-эф-ИЭ ПЦР-рв-ИЭ ЫАБВА 100 100 100 100
Мужчины
Соскобы из уретры (п = 127) ПЦР-эф-Дт ПЦР-рв-Дт ПЦР-эф-Л ПЦР-эф-ИЭ ПЦР-рв-ИЭ ЫАБВА 100 100 100 100
Моча (п = 127) ПЦР-эф-Дт ПЦР-рв-Дт ПЦР-эф-Л ПЦР-эф-ИЭ ПЦР-рв-ИЭ ЫАБВА 100 100 100 100
1 ПЦР-эф-Дт и ПЦР-рв-Дт, ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании ДНК-технология, Москва- ПЦР-эф-Л, ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании Литех, Москва- ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-рв-ИЭ, ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные ЦНИИ эпидемиологии, Москва- ЫАБВА разработана ЦНИИ эпидемиологии, Москва, Россия.
жена ДНК гонококков: у трех женщин в обоих образцах (со слизистой задней стенки глотки и прямой кишки), у четырех — только в прямой кишке и еще у одной пациентки — только в задней стенке глотки.
Чувствительность российских тестов варьировала от 66,7 до 100% в зависимости от типа образца (таблица 3). При исследовании клинических материалов, полученных у женщин, самая высокая чувствительность была у тестов ПЦР-эф-ИЭ, ПЦР-рв-ИЭ и NASBA (100% для цервикальных проб и проб мочи). Чувствительность ПЦР-эф-Дт, ПЦР-рв-Дт и ПЦР-эф-Л составила 100, 83,3, 100 и 83,3, 83,3, 66,7% для цервикальных образцов и мочи, со-
ответственно. Прогностическая значимость отрицательных результатов варьировала от 99,4 до 100% (таблица 3).
При исследовании клинических материалов, полученных у мужчин, все МАНК российского производства имели 100% чувствительность. Специфичность и прогностическая значимость положительных результатов всех российских тестов равнялась 100% (таблица 3).
Ингибирование амплификации наблюдалось в 18 урогенитальных пробах, полученных от восьми женщин и семерых мужчин (таблица 4). Ни один из экстрагенитальных образцов не ингибировался ни в одной из реакций МАНК (таблица 4).
Таблица 4
Частота ингибирования амплификации в тестах, производимых и используемых в России для выявления Neisseria gonorrhoeae
Метод выделения нуклеиновой кислоты Метод исследования1 Количество ингибированных образцов (/)
Женщины Мужчины Экстрагенитальные образцы (женщины)
Клинические материалы
Соскобы из цервикального канала (n = 319) Моча (n=317) Соскобы из уретры (n = 127) Моча (n = 127) Мазки из задней стенки глотки (n = 50) Мазки из прямой кишки (n = 50)
ДНК-ЭКСПРЕСС ПЦР-эф-Дт S (2,5 /) 1 (0,3 /) 7 (5,5 /) 2 (1,6 /) 0 0
ПЦР-рв-Дт 1 (0,3 /) 0 2 (1,6 /) 0 0 0
ПЦР-эф-Л S (2,5 /) 1 (0,3 /) 7 (5,5 /) 2 (1,6 /) 0 0
ДНК-сорбА ПЦР-эф-ИЭ 0 0 0 0 0 0
ПЦР-рв-ИЭ 0 0 0 0 0 0
NucliSens Isolation Reagents NASBA 1 (0,3 /) 0 0 0 0 0
1 ПЦР-эф-Дт и ПЦР-рв-Дт, ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании ДНК-технология, Москва- ПЦР-эф-Л, ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные в компании Литех, Москва- ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-рв-ИЭ, ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, разработанные ЦНИИ эпидемиологии, Москва- NASBA разработана Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии, Москва, Россия.
Самый высокий уровень ингибирования (2%, или 18 из 890 образцов), особенно заметный в образцах, полученных из уретры (5,5%), наблюдали при проведении ПЦР с электрофорезной детекцией компаний ДНК-технология и Литех, которые для выделения ДНК используют технологию ДНК-экспресс. Тем не менее ингибирование регистрировали редко при использовании тест-систем ПЦР-рв-Дт, в которых для выделения ДНК также используется технология ДНК-экспресс. Наконец, ингибирование регистрировали крайне редко при использовании сорбентных методов выделения ДНК, ДНК-сорбА, и NASBA, использующую NucliSens Isolation Reagents (таблица 4). Все образцы, содержащие ингибиторы амплификации, тестировали повторно после выделения ДНК из новой порции образца, разведенного в 10 раз. Все пробы, в которых наблюдалось ингибирование реакции, после повторного тестирования были отрицательными.
При использовании референс-метода ингиби-рования амплификации не наблюдалось.
Пределы детекции ПЦР-эф-Дт, ПЦР-рв-Дт, ПЦР-эф-Л, ПЦР-эф-ИЭ и ПЦР-рв-ИЭ составили 1−3, 1−3, 3−6, 1−3 и 1 геномную копию на реакцию соответственно (таблица 1).
Обсуждение
Данное исследование является первым исследованием по всесторонней оценке МАНК, разработанных и применяемых в нашей стране для выявления N. gonorrhoeae. В целом все шесть МАНК российского производства показали высокий уро-
вень совпадения результатов друг с другом и с референс-методом (99,4−100%), относительно высокую чувствительность (66,7−100%), идеальную специфичность (100%) при использовании как урогенитальных (полученных инвазивным и неин-вазивным путем), так и экстрагенитальных образцов, а также низкие пределы детекции (1−6 копий ДНК на реакцию). Тем не менее общее количество образцов и число положительных образцов в данном исследовании были относительно низкими, поэтому результаты должны интерпретироваться с некоторой осторожностью.
В последние десять лет МАНК обеспечили значительный прогресс в лабораторной диагностике инфекций, вызываемых N. gonorrhoeae. Однако высокая степень гомологии нуклеотид-ных последовательностей и частый генетический обмен между гонококками и другими видами рода Neisseria, а также высокий уровень генетического полиморфизма разных штаммов N. gonorrhoeae являются причиной неоптимальной чувствительности, специфичности большинства МАНК как коммерческих, так и in-house [7, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 24, 29]. Следовательно, при разработке эффективного МАНК для диагностики гонококковой инфекции выбор генетической мишени является вопросом первостепенной важности. Описаны методы, использующие в качестве мишени крип-тическую плазмиду (cppB ген) [16], opa гены [11], orf1 ген [5], ген цитозин ДНК метилтрансферазы [21] и ген 16S рРНК [16]. Надо отметить, что широко используемый ген cppB может присутствовать
у других видов Neisseria и вместе с тем отсутствовать у некоторых штаммов N. gonorrhoeae, которые могут составлять до 10% популяции гонококков в некоторых географических областях [10, 13, 24]. Более того, перекрестные реакции с некоторыми штаммами других видов Neisseria описаны практически для всех МАНК, используемых для выявления N. gonorrhoeae [2, 12, 13, 15, 16, 18, 24, 25, 29]. В данном исследовании в качестве ре-ференс метода был использован международный, аналитически и клинически валидированный метод ПЦР в реальном времени с псевдогеном porA в качестве мишени, имеющий на данный момент 100% специфичность [2, 6]. Многочисленные предшествующие исследования показали, что псевдоген porA является чрезвычайно консервативным, отсутствует у нейссерий-комменсалов, значительно отличается у N. meningitidis и, соответственно, представляется подходящей мишенью для выявления N. gonorrhoeae [1, 2, 3, 6, 14, 15, 17, 27, 29]. Недостатком данной мишени является то, что этот ген представлен в клетке в количестве одной копии, что теоретически может повлиять на чувствительность метода.
Псевдоген porA используется в качестве мишени в двух ПЦР тест-системах российского производства, а именно, в ПЦР-тестах обоих форматов детекции компании ДНК-технология. Две другие тест-системы российского производства используют в качестве мишени ген cppB (ПЦР-эф-Л и ПЦР-эф-ИЭ), при этом в ПЦР-эф-ИЭ дополнительно используется ген цитозин ДНК метилтрансферазы и положительными считаются только образцы, положительные по обеим мишеням. Такой подход увеличивает специфичность теста, хотя надо иметь в виду, что существуют штаммы N. gonorrhoeae, не имеющие криптической плазмиды, а также другие виды нейссерий, которые могут давать перекрестную реакцию с обеими мишенями. К тому же некоторые области взятия материала, особенно глотка, являются обычным местом колонизации генетически сходных нейссерий-комменсалов и/или N. meningitidis, поэтому необходимо использовать только тест-системы с высокой специфичностью [2, 3, 6, 13, 15, 24, 29]. При условии использования таких тест-систем можно выявить большее количество достоверно положительных образцов, чем при использовании культурального метода [6].
В данном исследовании все МАНК российского производства имели 100% специфичность при исследовании как урогенитальных, так и экстрагенитальных проб. Тем не менее из-за проблем со специфичностью, которые могут привести к очень низкой прогностической
значимости положительных результатов, особенно в популяции с низким уровнем распространенности заболевания, и в связи с высокой социальной значимостью ложноположитель-ных результатов при диагностике гонококковой инфекции рекомендовано проводить подтверждение путем повторного тестирования всех положительных образцов с применением другого МАНК, использующего в качестве мишени другой ген [1, 15, 29]. Однако данный подход могут применять не все лаборатории по причине его трудоемкости и дороговизны, поэтому во многих ситуациях повторное выделение ДНК из первичного образца и его тестирование при помощи высокоспецифичного МАНК может быть достаточно для подтверждения в рутинной диагностике [6]. В идеале МАНК для диагностики наиболее распространенных инфекционных агентов должны выявлять сразу несколько мишеней, что обеспечит диагностические тесты высокой чувствительностью, специфичностью и предотвратит появление ложноотрицательных результатов, обусловленных различными типами мутаций, что недавно привело к неожиданной ситуации с диагностикой C. trachomatis в Швеции [23]. Для N. gonorrhoeae интересным вариантом представляется тест с одновременным определением двух генетических мишеней, однокопийного генаporA и мультикопийных генов Opa белков, который менее подвержен влиянию генетического полиморфизма и имеет более высокую чувствительность и специфичность, т. е. фактически дает возможность одновременно подтверждать положительный результат [1].
В своем исследовании мы показали, что образцы мочи как у женщин, так и у мужчин являются, по меньшей мере, не менее информативным материалом, чем соскобы из церви-кального канала у женщин и уретры у мужчин, что согласуется с данными других авторов [4, 9, 20]. К тому же одновременный анализ двух образцов привел к увеличению выявления N. gonorrhoeae на 14,3% у женщин и на 20% у мужчин, что также соответствует предыдущим исследованиям [26].
Основываясь на последних систематических обзорах, посвященных характеристикам коммерческих МАНК для диагностики инфекций, вызываемых N. gonorrhoeae [25], чувствительность и специфичность отечественных тестов сопоставимы с большинством из них. Многочисленные исследования показали, что МАНК могут быть высокоэффективными при скрининге на C. trachomatis и N. gonorrhoeae в основном за счет высокой чувствительности
и специфичности, а также возможности исследования образцов, полученных неинвазивным путем, что часто является предпочтительным для пациентов. Более того, в зависимости от распространенности инфекции в исследуемой популяции, МАНК дают возможность применения экономически эффективных стратегий в эпидемиологических исследованиях с использованием техники пулирования [28].
Все российские тесты, оцененные в данном исследовании, имеют внутренние контроли. Частота ингибирования амплификации существенно варьировала в зависимости от типа образца, метода выделения ДНК/РНК и применяемого МАНК. Частота ингибирования была несколько выше для образцов из уретры (0−5,5%) по сравнению с цервикальными образцами (0−2,5%) и образцов мочи (0−1,6%), что в целом соответствует ранее опубликованным данным [20]. Материалы со слизистой задней стенки глотки и прямой кишки не указаны в инструкциях российских производителей в качестве клинических материалов для диагностики инфекций, вызываемых N. gonorrhoeae, тем не менее мы не наблюдали ингибирования ни в одном из экстрагенитальных образцов, что, однако, может быть объяснено их небольшим количеством.
Частота ингибирования амплификации была значительно ниже в тестах, использующих сорбентные методы выделения нуклеиновых кислот. Кроме того, в тестах, разработанных в ЦНИИ эпидемиологии (ПЦР с электрофорезной детекцией и ПЦР в реальном времени, а также NASBA в реальном времени), внутренний контроль добавляется перед выделением нуклеиновых кислот, что позволяет контролировать не только ингибирование амплификации, но и эффективность выделения ДНК/РНК. Однако недостатком сорбентных методов выделения ДНК по сравнению с технологией ДНК-экспресс является их относительная длительность и трудоемкость. Кроме того, с увеличением количества этапов выделения ДНК увеличивается риск перекрестной контаминации.
Таким образом, все оцениваемые МАНК российского производства имели высокую чувствительность и специфичность при исследовании как урогенитальных, так и экстрагени-тальных проб. Однако необходимо провести дальнейшие исследования с большим количеством пациентов как с симптомами, так и без симптомов урогенитальной инфекции. Кроме того, представляется целесообразным сравнение российских тест-систем с другими высокочувствительными и специфичными междуна-
роднопризнанными МАНК, такими как Aptima Combo 2 (Gen-Probe). Это, в конечном итоге, может сформировать предпосылки для получения достоверных данных о распространенности гонококковой инфекции в нашей стране и, возможно, в других странах Восточной Европы, которые используют данные МАНК. Кроме того, мы надеемся, что данное и последующие исследования послужат основой для разработки рекомендаций по применению МАНК в диагностике гонококковой инфекции на территории Российской Федерации.
Благодарности
Мы благодарим персонал молодежных центров, в особенности Марину Федоровну Ипполитову, Татьяну Евгеньевну Трубецкую и Ольгу Юрьевну Ландину, за сбор образцов и данных о пациентах. Данное исследование проведено при поддержке Восточно-Европейского комитета по проблемам сексуального и репродуктивного здоровья (Eastern European Network for Sexual and Reproductive Health).
Литература
1. A duplex Neisseria gonorrhoeae real-time polymerase chain reaction assay targeting the gonococcal porA pseudogene and multicopy opa genes / Gorie N. [et al.] // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. — 2008. — Vol. 61. — P. 6−12.
2 A fast real-time polymerase chain reaction method for sensitive and specific detection of the Neisseria gonorrhoeae porA pseudogene / Hjelmevoll S. O. [et al.] // J. Mol. Diagn. — 2006. — Vol. 8. — P. 574−581.
3 A new confirmatory Neisseria gonorrhoeae real-time PCR assay targeting the porA pseudogene / Whiley D. M. [et al.] // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. — 2004. — Vol. 23. — P. 705−710.
4 Ability of new APTIMA CT and APTIMA GC assays to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in male urine and urethral swabs / Chernesky M. A. [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 2005. — Vol. 43. — P. 127−131.
5 Chaudhry U., Saluja D. Detection of Neisseria gonorrhoeae by PCR using orf1 gene as target // Sex. Transm. Infect. -
2002. — Vol. 78. — P. 72.
6 Clinical validation of a real-time polymerase chain reaction detection of Neisseria gonorrhoeae porA pseudogene versus culture technique / Hjelmevoll S. O. [et al.] // Sex. Transm. Dis. — 2008. — Vol. 35. — P. 517−520.
7 Comparison of methods for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae using commercially available nucleic acid amplification tests and a liquid pap smear medium / Koumans E. H. [et al.] // J. Clin. Microbiol. -
2003. — Vol. 41. — P. 1507−1511.
8 Comparison of microscopy, culture and in-house PCR and NASBA assays for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in Russia / Shipitsyna E. [et al.] // APMIS. — 2008. — Vol. 116. — P. 133−138.
9 Comparison of the Gen-Probe APTIMA Combo 2 assay to the AMPLICOR CT/NG assay for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in urine samples from Australian men and women / Lowe P. [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 2006. — Vol. 44. — P. 2619−2621.
10 Cryptic-plasmid-free gonococci may contribute to failure of cppB gene-based assays to confirm results of BD ProbeTEC PCR for identification of Neisseria gonorrhoeae / Tapsall J. W. [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 2005. — Vol. 43. — P. 2036−2037.
11 Evaluation of opa-based real-time PCR for detection of Neisseria gonorrhoeae / Tabrizi S. N. [et al.] // Sex. Transm. Dis. — 2005. — Vol. 32. — P. 199−202.
12 Evaluation of real time polymerase chain reaction assays for confirmation of Neisseria gonorrhoeae in clinical samples tested positive in the Roche Cobas Amplicor assay / Tabrizi S. N. [et al.] // Sex. Transm. Infect. — 2004. — Vol. 80. — P. 68−71.
13 Evaluation of the specificities of five DNA amplification methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae / Palmer H. M. [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 2003. — Vol. 41. — P. 835−837.
14 Evidence that the gonococcal porA pseudogene is present in a broad range of Neisseria gonorrhoeae strains- suitability as a diagnostic target / Whiley D. M. [et al.] // Pathology. -
2006. — Vol. 38. — P. 445−448.
15 Exploring & quot-best practice& quot- for nucleic acid detection of Neisseria gonorrhoeae / Whiley D. M. [et al.] // Sex. Health. — 2008. — Vol. 5. — P. 17−23.
16 FarrellD. J. Evaluation of AMPLICOR Neisseria gonorrhoeae PCR using cppB nested PCR and 16S rRNA PCR // J. Clin Microbiol. — 1999. — Vol. 37. — P. 386−390.
17 Feavers I. M., MaidenM. C. A gonococcal porA pseudogene: implications for understanding the evolution and pathogenicity of Neisseria gonorrhoeae // Mol. Microbiol. — 1998. — Vol. 30. — P. 647−656.
18 Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in East-European countries. Part 2. Culture, non-culture methods, determination of antibiotic resistance, and quality assurance / Savicheva A. [et al.] // Acta Medica. Lituanica. -
2007. — Vol. 14. — P. 123−134.
19 Laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in St. Petersburg, Russia: inventory, performance characteristics and recommended optimizations / Unemo M. [et al.] // Sex. Transm. Infect. — 2006. — Vol. 82. — P. 41−44.
20 Multicenter evaluation of the BDProbeTec ET system for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in urine specimens, female endocervical swabs, and male urethral swabs / Van Der Pol B. [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 2001. — Vol. 39. — P. 1008−1016.
21 Multiplex PCR for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genitourinary specimens / Mahony J. B. [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 1995. — Vol. 33. — P. 3049−3053.
22 Neisseria gonorrhoeae population in Arkhangelsk, Russia: phenotypic and genotypic heterogeneity / Unemo M. [et al.] // Clin. Microbiol. Infect. — 2007. — Vol. 13. — P. 873−878.
23 Ripa T., Nilsson P. A variant of Chlamydia trachomatis with de-letion in cryptic plasmid: implications for use of PCR diagnostic tests // Euro. Surveill. — 2006. — Vol. 11, N 11. — E061109.2.
24 Smith D. W., Tapsall J. W., Lum G. Guidelines for the use and interpretation of nucleic acid detection tests for Neisseria gonorrhoeae in Australia: a position paper on behalf of the Public Health Laboratory Network // Commun. Dis. Intell. — 2005. — Vol. 29. — P. 358−365.
25 Systematic review: noninvasive testing for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae / Cook R. L. [et al.] // Ann. Intern. Med. — 2005. — Vol. 142. — P. 914−925.
26 The effect of urine testing in evaluations of the sensitivity of the Gen-Probe Aptima Combo 2 assay on endocervical swabs for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae: the infected patient standard reduces sensitivity of single site evaluation / Moncada J. [et al.] // Sex. Transm. Dis. — 2004. — Vol. 31. — P. 273−277.
27 Unemo M., Norlen O., Fredlund H. The porA pseudogene of Neisseria gonorrhoeae — low level of genetic polymorphism and a few, mainly identical, inactivating mutations // APMIS. — 2005. — Vol. 113. — P. 410−419.
28 Utility of pooled urine specimens for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in men attending public sexually transmitted infection clinics in Mumbai, India, by PCR / Lindan C. [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 2005. — Vol. 43. — P. 1674−1677.
29 Whiley D. M., Tapsall J. W, Sloots T.P. Nucleic acid amplification testing for Neisseria gonorrhoeae: an ongoing challenge // J. Mol. Diagn. — 2006. — Vol. 8. — P. 3−15.
Статья представлена С. А. Сельковым, ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта,
Санкт-Петербург
EVALUATION OF NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TESTS USED FOR DIAGNOSIS OF NEISSERIA GONORRHOEAE IN RUSSIA
Shipitsyna E. V., Zolotoverkhaya E. A., Savicheva A. M., Sokolovsky E. V., Maximova A. A., Benkovich A. S., Hjelmevoll S. O., Krysanova A. A., Skogen V., Domeika M., Unemo M.
¦ Summary: The aim of the study was to evaluate the performance characteristics of six Russian NAATs for Neisseria gonorrhoeae diagnostics. Five PCR assays and one real-time nucleic acid sequence based amplification (NASBA) assay, developed by three Russian companies, were evaluated on urogenital samples, i. e. cervical and first voided urine (FVU) samples from females (n = 319), urethral and FVU samples from males (n = 127), and extragenital samples, i.e. rectal and pharyngeal samples, from 50 additional female patients with suspicion of gonorrhoea. The prevalence of N. gonorrhoeae was 2,7% and 16% among the patients providing urogenital and extragenital samples, re-
spectively. The sensitivities, specificities, positive predictive values and negative predictive values of the Russian tests in different specimens were 66,7−100%, 100%, 100%, and 99,4−100%, respectively.
¦ Key words: Neisseria gonorrhoeae- nucleic acid amplification tests (NAATs) — porA pseudogene PCR- sensitivity- specificity
¦ Адреса авторов для переписки-
Шипицына Елена Васильевна — старший научный сотрудник лаборатории микробиологии ГУ НИИАГ им. Д. О. Отта РАМН E-mail: shipitsyna@inbox. ru
Золотоверхая Екатерина Андреевна — научный сотрудник лаборатории микробиологии ГУ НИИАГ им. Д. О. Отта РАМН Савичева Алевтина Михайловна — заведующий лаборатории микробиологии. E-mail: savitcheva@mail. ru
Крысанова Анна Александровна — научный сотрудник лаборатории микробиологии)
ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН. 199 034 Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3 E-mail: savitcheva@mail. ru
Соколовский Евгений Владиславович — д. м. н., профессор, заведующий кафедрой.
Максимова Анна Александровна — аспирант кафедры кожных и венерических болезней с клиникой.
Бенькович Артем Семенович — аспирант кафедры кожных и венерических болезней с клиникой.
Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. академика И. П. Павлова, кафедра дерматовенерологии с клиникой. 197 022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6/8. E-mail: rector@spmu. rssi. ru
Скоген Вегард — врач-венеролог, доктор наук. Отделение медицины, Университетский госпиталь Северной Норвегии (N-9038 Тромсё, Норвегия)
Хьелмеволл Стиг Ове — исследователь.
Отделение микробиологии и инфекционного контроля, Университетский госпиталь Северной Норвегии (N-9038 Тромсё, Норвегия) Унемо Ыагнус — исследователь, доктор наук, профессор. Национальная референс лаборатория по патогенным нейссериям, Отделение клинической микробиологии, Университетский госпиталь Оребро (SE-701 85 Оребро, Швеция)
Домейка Ыарюс — старший исследователь, доктор наук) Отделение медицинских наук, Уппсальский университет (Box 552, 751 22 Уппсала, Швеция)
Shipitsyna Elena Vasilievna — senior researcher. E-mail: shipitsyna@inbox. ru
Zolotoverkhaya Ekaterina Andreevna — researcher.
Savicheva Alevtina Mihailovna — Professor, MD, Head of Laboratory of Microbiology.
E-mail: savitcheva@mail. ru
Krysanova Anna Aleksandrovna — researcher of the microbiology laboratory.
D.O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology 3 Mendeleyevskaya Line, 199 034 St. Petersburg, Russia E-mail: savitcheva@mail. ru
Sokolovsky Evgeniy Vladislavovich — doctor of medical science, professor, managing chair.
Maximova Anna Aleksandrovna — resident of the department of skin and venereal diseases.
Benkovich Artem Semenovich — resident of the department of skin and venereal diseases.
St. -Petersburg State Medical University named after akad. I. P. Pavlova, chair dermatovenerologii with clinic. E-mail: rector@spmu. rssi. ru
Skogen Vegard — venereologist, PhD.
Department of Medicine, University Hospital of North Norway and University of Troms0 (N-9038 Troms0, Norway)
Hjelmevoll Stig Ove — researcher
Department of Microbiology and Infection Control, University Hospital of North Norway (N-9038 Troms0, Norway)
Unemo Magnus — researcher, PhD, associate professor National Reference Laboratory for Pathogenic Neisseria, Department of Clinical Microbiology, Orebro University Hospital, SE-701 85 Orebro, Sweden
Domeika Marius -senior researcher, PhD.
Department of Medical Sciences, Uppsala University, Uppsala (Box 552, 751 22 Uppsala, Sweden)

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой