Методика анализа мутаций гена CYP21A2 у больных с врожденной гиперплазией коры надпочечников

Тип работы:
Реферат
Предмет:
Медицина


Узнать стоимость

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

УДК 606: 61, 602
МЕТОДИКА АНАЛІЗУ МУТАЦІЙ ГЕНА CYP21A2 У ХВОРИХ НА ВРОДЖЕНУ ГІПЕРПЛАЗІЮ КОРИ НАДНИРКОВИКІВ
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ
E-mail: livshits@imbg. org. ua
Отримано 09. 10. 2013
Розроблено методику аналізу мутацій гена CYP21A2, придатну для пре- і постнатальної ДНК-діагностики різних типів вродженої гіперплазії кори наднирковиків та встановлення гетерозиготного носійства в родинах високого ризику.
Здійснено аналіз протяжної делеції гена CYP21A2 і мутацій 655A/C& gt-G, 999T& gt-A, 1994C& gt-T, 2108C& gt-T, які призводять до вірильної та сільвтрачальної форм вродженої гіперплазії кори наднирковиків, а також мутацій 89C& gt-T і 1683G& gt-T, що спричинюють некласичну форму цього захворювання. Запропонована методика базується на аналізі алель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції та поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів.
Методика пройшла контроль якості на наявних зразках ДНК, що дає підстави запропонувати її для ДНК-діагностики (включаючи пренатальну) в родинах високого ризику, а також для аналізу гетерозиготних носіїв цього захворювання.
З використанням розробленої методики проведено аналіз мутацій семи хворим та їхнім батькам. У результаті виявлено 9 алелів з делецією гена CYP21A2, 4 — з мутацією 655A/C& gt-G та 1- з мутацією 2108C& gt-T.
Ключові слова: вроджена гіперплазія кори наднирковиків, ензим 21-гідроксилаза, ген CYP21A2.
С. Ю. Чернушин Л. А. Лівшиць
Вроджена гіперплазія кори наднирковиків (ВГКН), раніше відома як адреногені-тальний синдром, — група спадкових захворювань, за яких порушується синтез кортизолу наднирковими залозами [1]. До ВГКН призводить дефіцит ензимів 21-гідро-ксилази, 11-бета-гідроксилази, 17-альфа-гідроксилази, стероїдогенного гострофазно-го регуляторного протеїну, 20-, 22-десмола-зи, які залучені до синтезу кортизолу.
Недостатність 21-гідроксилази є причиною більш ніж 90% випадків ВГКН. Це — аутосомно-рецесивне захворювання, до якого призводить наявність мутацій у гені CYP21A2 [2]. На сьогодні ідентифіковано 181 мутацію цього гена [3]. Припускають, що частота носійства мутантного алеля гена CYP21A2 становить 1 на 50 осіб у популяції здорового населення [4, 5].
Згідно з існуючою класифікацією мутації гена CYP21A2 поділяють на чотири групи, виходячи зі встановленої in vitro залишкової активності ензиму 21-гідроксила-зи [4]. До групи «0» включають делецію гена CYP21A2 та мутації 707_714delGAGACTAC,
Ебеї^ег, 1762_1763іпвТ, 1994С& gt-Т, 2108С& gt-Т, що призводять до повної відсутності ензиму, до групи «А» — мутацію 655А/С& gt-С, за якої спостерігають залишкову активність ензиму. До групи «В» відносять мутацію 999Т& gt-А, за якої активність ензиму дорівнює не більше 10% від норми, до групи «С» — мутації 89С& gt-Т, 1683С& gt-Т, 2578С& gt-Т, за яких активність ензиму становить 10−75% від норми. Показано, що саме мутації групи «С» призводять до розвитку некласичної форми ВГКН [6, 7].
Ген СУР21Л2 та псевдоген СУР21Л1Р локалізовані в регіоні ИЬА класу III, що розташований у хромосомній ділянці 6р21.3. Псевдоген СУР21Л1Р містить мутації, які унеможливлюють експресію функціонального ензиму 21-гідроксилази [8].
Слід зазначити, що псевдоген СУР21Л1Р на 98% гомологічний до кодувальної послідовності гена ЄУР21Л2 і на 96% - до неко-дувальної [8].
Метою роботи було розроблення методики аналізу мутацій гена СУР21Л2 (655А/ С& gt-С, 999Т& gt-А, 1994С& gt-Т, 2108С& gt-Т, 89 С& gt-Т,
1683G& gt-T), придатної для пре- і постнаталь-ної ДНК-діагностики різних типів ВГКН, та встановлення гетерозиготного носійства в родинах високого ризику.
Матеріали і методи
Зразки геномної ДНК людини виділяли з лейкоцитів периферійної крові й очищали з використанням стандартної методики фенольно-хлороформної екстракції [9]. Згідно з основними нормами біоетики за використання людини як об'єкта дослідження інформовану згоду на його проведення було одержано від усіх досліджуваних індивідів.
Нами здійснено дизайн і синтез специфічних праймерів і оптимізовано умови по-лімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для аналізу протяжної делеції/конверсії гена CYP21Л2 та мутацій 89C& gt-T, 655A/C& gt-G, 999T& gt-A, 2108C& gt-T — методом алель-спе-цифічної ПЛР, а також мутацій 1683G& gt-T, 1994C& gt-T — методом аналізу поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів.
ПЛР проводили в автоматичному режимі на ампліфікаторі 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, США) з використанням Long PCR Enzyme Mix (Fermentas, Литва).
Реакцію виконували в такому режимі:
• денатурація 94 «С — 7 хв-
• 94 «С — 30 с, 66 «С — 0,4 °С кожен цикл — 30 с, 68 «С — 6 хв 30 с — 10 циклів-
• 94 «С — 30 с, 62 «С — 30 с, 68 «С — 6 хв 30 с + 3 с кожен цикл — 20 циклів-
• фінальна елонгація — 15 хв.
Реакційна суміш об'ємом 15 мкл складалася з: 1X Long PCR Buffer, 4 мМ MgCl2, по
300 мкМ кожного трифосфату, олігонуклео-тиди — 10 мМ, BSA — 2 мкг/мл, 1 од. активності Long PCR Enzyme Mix (Fermentas), бетаїн — 1 М.
Бетаїн додавали до суміші через його властивість підвищувати стабільність полі-мерази, що є актуальним за такого тривалого часу елонгації. Також бетаїн здатен нівелювати різницю в температурах плавлення пар A-T та G-C, що допомагає запобігти передчасній ренатурації ДНК під час відпален-ня праймерів та елонгації [10].
Результати та обговорення
Для здійснення аналізу мутацій досліджуваного гена розроблено схему диференціальної ампліфікації in vitro послідовності гена CYP22 і псевдогена CYP2^1P. Для цього проводили ампліфікацію in vitro за допомогою ПЛР-фрагмента завдовжки 8,5 т. п. н., до складу якого входять:
а) послідовність із 31-го інтрона до 3-кінця гена TNXB-
б) повна послідовність гена CYP22 (рис. 1).
Необхідність дизайну праймера TNXB32 °F, гомологічного саме послідовності 31-го інтрона гена TNXB, зумовлена наявністю в геномі псевдогена ХА, який є високо-гомологічним послідовності від 32-го екзона до 3 '--кінця гена TNXB і міститься у безпосе-
0 10 і 20 1 ЗО 1 40 і 50 БО 1 1 Ifk

С4А CYP21 РАЇ X, А RP 2 С4 В CYP21A2 • TNXB j
CYP21-
Taql Toql
Делеція & quot-ЗО Kb
CYP21 —
Taql
f I •*- TNXB32F
Taql
0 10. 1 20 1 ЗО і

С4А CYPZ1P «і ХА TNXB
Kb
CYP21-
t ft Taql Taql Taql
TNXB32F
Рис 1. Схематичне зображення хромосомної ділянки 6p21.3.
Сірим кольором позначено псевдогени, білим — гени. Пунктиром показано зону дуплікації гена ХА у гені ТЫХБ. Праймери ТМХБ32Е та СУР21−3'- фланкують фрагмент завдовжки 8,5 т. п. н., який включає гени ТЫХБ та СУР21Л2. У разі делеції за наявності генів СУР21Л2, С4Б, ЯР2, ХА фрагмент завдовжки 8,5 т. п. н. охоплюватиме ген ТЫХБ та псевдоген СУР21А1Р
редній близькості до псевдогена CYP21A1P. Саме цим пояснюється така велика протяжність досліджуваного фрагмента.
У разі відсутності делеції гена CYP21A2 одержаний фрагмент 8,5 т. п. н. можна використовувати як матрицю для подальшого аналізу інших мутацій цього гена. Це уможливлює одержання ампліфікованої ДНК-ма-триці, що не містить помилок. Із цією метою було використано набір Long PCR Enzyme Mix (Fermentas, Литва), оскільки він забезпечує у 3 рази вищу точність синтезу, ніж звичайна Taq ДНК-полімераза завдяки вмісту в використаній суміші термостабільної ДНК-полімерази високої точності з 3'--5'-ек-зонуклеазною активністю. Ампліфікацій-ний буфер із цього набору розроблено спеціально для запобігання депуринізації, що додатково зменшує вірогідність виникнення помилок в ампліфікованій послідовності.
Гетерозиготне носійство делеції гена CYP21A2 виключає можливість використання ампліфікованого фрагмента 8,5 т. п. н. як матриці для подальшого аналізу, оскільки в такому разі він міститиме ще й послідовність псевдогена CYP21A1P із гомологічної хромосоми. У цьому випадку для одержання ампліфікованої ДНК-матриці використовували праймери, описані раніше [11].
Для аналізу мутацій 89 C& gt-T, 655 A/C& gt-G, 999 T& gt-A та 2108 C& gt-T розроблено метод алель-специфічної ПЛР із застосуванням системи із 3 праймерів, один з яких є спільним для ампліфікації як нормального так і мутантного варіантів, а два інших гомологічні «дикому» та мутантному алелям за рахунок специфічності 3'--кінцевого нуклеотида. Оскільки у разі мутації 655 A/C& gt-G нормальними є одразу два варіанти — А та
С, ми використовували систему із 4 прай-мерів, із яких 2 праймери гомологічні нормальним варіантам, один — мутантному варіанту і один є спільним для ампліфікації усіх трьох варіантів (рис. 2).
З метою аналізу мутації 1683G& gt-T розроблено метод поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів для ендонукле-ази рестрикції PmlI. Після гідролізу амплі-фікованого фрагмента 633 п. н. ендонукле-азою рестрикції PmlI за наявності заміни 1683G& gt-T зникає єдиний у даній послідовності сайт упізнавання для ендонуклеази, за відсутності заміни 1683G& gt-T утворюються фрагменти 502 п. н. та 133 п. н.
Мутацію 1994C& gt-T аналізували раніше описаним методом [11].
Методику апробовано на контрольних зразках із мутаціями 89 C& gt-T, 655 A/C& gt-G, 999 T& gt-A, 1683G& gt-T, 1994C& gt-T гена CYP212 та делецією гена CYP22, люб’язно наданими професором В. С. Барановим (Інститут акушерства і гінекології ім. Д. О. Отта РАМН, Санкт-Петербург, Росія) та професором О. В. Поляковим (Медико-генетичний науковий центр РАМН, Москва, Росія).
Із застосуванням розробленої методики аналіз мутацій проведено семи хворим на ВГКН та їхнім батькам. У результаті виявлено 9 алелів з делецією гена CYP22, 4 —
з мутацією 655 A/C& gt-G та 1 алель з мутацією 2108C& gt-T.
Після оброблення ампліфікованого фрагмента 8,5 т. п. н. ендонуклеазою рестрикції TaqI амплікон послідовності гена CYP22 виявляють як фрагмент 3,7 т. п. н., амплікон псевдогена CYP21Л1P — 3,2 т. п. н., гена TNXB — 2,4 т. п. н. (рис. 3). Відсутність фрагмента 3,7 т. п. н. свідчить про наявність
Рис. 2. Електрофореграма продуктів ПЛР 2-інтрона гена та 8-екзона гена СУР21Л2 з використанням методу алель-специфічної ПЛР для детекції мутації 655A/C& gt-G та 2108 С& gt-Т в 1,5%-му агарозному гелі:
1 — зразок з генотипом 2108 СТ-
2 — зразок з генотипом 2108 СТ-
3 — зразок з генотипом 2108 СС-
4 — зразок з генотипом 655 СО-
5 — зразок з генотипом 655 АС-
6 — зразок з генотипом 655 АО
3,7 т.п.н. 3,2 т.п.н. 2,4 т.п.н.
1
2
З
4
5
Рис. 3. Електрофореграма гідролізованих продуктів ПЛР ділянки гена СУР21Л2, що утворились після гідролізу специфічною ендонуклеазою рестрикції Таці в 1,2%-му агарозному гелі:
1 — негідролізований фрагмент 8,5 кб-
2 — пробанд з гомозиготною делецією гена СУР21Л2-
3 — плід-носій делеції гена СУР21Л2-
4 — мати-носій делеції гена СУР21Л2-
5 — маркер розміру фрагментів ДНК
(100−10 000 п. н.)
гомозиготної делеції саме гена СУР21Л2, з другого боку — наявність фрагментів 3,7 т. п. н. та 3,2 т. п. н. вказує на наявність цієї делеції в гетерозиготному стані.
Надалі планується розширювати спектр досліджуваних мутацій гена СУР21Л2, що призводять до різних форм захворювання на ВГКН.
Таким чином, розроблено методику аналізу протяжної делеції гена СУР21Л2 та мутацій 655 А/С& gt-О, 999Т& gt-А, 1994С& gt-Т, 2108С& gt-Т цього гена, які спричинюють вірильну і сіль-
втрачаючу форми ВГКН, а також мутацій 89 С& gt-Т та 1683О& gt-Т, які призводять до не-класичної форми ВГКН.
Методика пройшла контроль якості на зразках ДНК з мутаціями 89 С& gt-Т, 655 А/С& gt-О, 999 Т& gt-А, 16 830 Т, 1994С& gt-Т гена СУР21Л2 та делецією гена СУР21Л2, що дає підстави запропонувати її для ДНК-діагностики (включаючи пренатальну) в родинах високого ризику ВГКН, а також для аналізу гетерозиготних носіїв цього захворювання.
REFERENCES
1. Merke D. P., Bornstein S. R. Congenital adrenal hyperplasia. Lancet. 2005, V. 365, 2125−2136.
2. Levine L. S. Congenital adrenal hyperplasia. Pediatr. Rev. 2000, V. 21, 159−170.
3. Ingelman-Sundberg M., Daly A.K., Nebert D.W., Sim S.C. The Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Database. Available at http: //www. cypalleles. ki. se/
4. Baumgartner-ParzerS. M, Nowotny P., Heinze G. Waldhausl W, Vierhapper H. Carrier frequency of congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency) in a middle European population. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2005, V. 90, 775−778.
5. New M. I. Extensive clinical experience: non-classical 21-hydroxylase deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2006, V. 91, 4205−4214.
6. Speiser P. W., White P. Congenital adrenal hyperplasia, New Eng. J. Med. 2003, V. 349, 776−788.
7. Charmandari E., Eisenhofer G., Mehlinger S. L., Carlson A., Wesley R, Keil M. F., Chrousos G. P., New M. I., Merke D. P. Adrenomedullary function may predict phenotype and genotype in classic 21-hydroxylase deficiency. J. Clin. Endocr. Metab. 2002, V. 87, 3031−3037.
8. Haider S., Islam B., D’Atri V., Sgobba M., Poojari C., Sun L., Yuen T., Zaidi M., New M. I. Structure-phenotype correlations of human CYP21A2 mutations in congenital adrenal hyperplasia. Proc. Natl. Acad. Sci. 2013, V. 110, 2605−2610.
9. Maniatis T., Fritsch E F., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. 1982, 265.
10. Vasudevamurthy M. K., Lever M., George P. M., Morison K. R. Betaine structure and the presence of hydroxyl groups alters the effects on DNA melting temperatures. Biopolymers. 2009, V. 91,85−94.
11. StikkelbroeckN. M., HoefslootL. H., de Wijs I. J., Otten B. J., Hermus A. R., Sistermans E. A.
МЕТОДИКА АНАЛИЗА МУТАЦИЙ ГЕНА CYP21A2 У БОЛЬНЫХ С ВРОЖДЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИЕЙ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ
С. Ю. Чернушин Л. А. Лившиц
Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев
E-mail: livshits@imbg. org. ua
Разработана методика анализа мутаций гена СУР21А2, пригодная для пре- и постна-тальной ДНК-диагностики различных типов врожденной гиперплазии коры надпочечников и установления гетерозиготного носитель-ства в семьях высокого риска.
Осуществлен анализ протяженной делеции гена СУР21А2 и мутаций 655А/С& gt-0, 999Т& gt-А, 1994С& gt-Т, 2108С& gt-Т, которые приводят к ви-рильной и сольтеряющей формам врожденной гиперплазии коры надпочечников, а также мутациям 89С & gt- Т и 16 830 & gt- Т, обусловливающим неклассическую форму этого заболевания. Предложенная методика базируется на анализе аллель-специфической полимеразной цепной реакции и полиморфизма длины рестрикционных фрагментов.
Методика прошла контроль качества на имеющихся образцах ДНК, что дает основание предложить ее для ДНК-диагностики (включая пренатальную) в семьях высокого риска, а также для анализа гетерозиготных носителей данного заболевания.
С использованием разработанной методики проведен анализ мутаций семи больным и их родителям. В результате выявлено 9 аллелей с делецией гена СУР21А2, 4 — с мутацией 655Л/С& gt-0 и 1 — с мутацией 2108С& gt-Т.
Ключевые слова: врожденная гиперплазия коры надпочечников, энзим 21-гидроксилаза, ген СУР21А2.
CYP21 Gene Mutation Analysis in 198 Patients with 21-Hydroxylase Deficiency in The Netherlands: Six Novel Mutations and a Specific Cluster of Four Mutations. J. Clin. Endocrinol. Metabol. 2003, V. 88, 83 852−3859.
ANALYSIS CYP21A2 GENE MUTATIONS TECHNIQUE IN PATIENTS WITH CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA
S. Yu. Chernushyn, L. A. Livshits
Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
E-mail: livshits@imbg. org. ua
The technique of CYP21A2 gene mutation analysis, which can be applicable for pre-and postnatal diagnosis of congenital adrenal hyperplasia various types was developed.
The analysis of extended CYP21A2 gene deletions and mutations 655A/C& gt-G, 999T& gt-A, 1994C& gt-T, 2108C& gt-T, which lead to congenital adrenal hyperplasia simple virilysing and salt wasting forms, and mutations 89C& gt- T and 1683G& gt- T, which lead to non-classical forms of the illness was proposed. This technique is based on analysis of the allele specific polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism.
The technique has passed quality control on available DNA samples. Thus this may be suggested for DNA diagnostics (including prenatal) in high-risk families and for analysis of heterozygous carriers illness. Using the developed technique nine alleles with CYP21A2 gene deletion, 4 alleles with 655A/C& gt-G mutation and 1 allele with 2108C& gt- T mutation were detected in seven patients and their parents.
Key words: congenital adrenal hyperplasia, enzyme 21-hydroxylase, CYP21A2 gene.

ПоказатьСвернуть
Заполнить форму текущей работой