Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком

Тип работы:
Диссертация
Предмет:
Биофизика
Страниц:
90


Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Актуальность проблемы

В процессах функционирования ДНК в живой клетке существенную роль играют взаимодействия ДНК с белковыми комплексами и другими лигандами. Эти взаимодействия, как правило, реализуются по принципу & laquo-узнавания»- молекулами -лигандами определенных сайтов молекулы ДНК.

Среди множества видов ДНК — белкового узнавания выделяют два принципиально различных типа — это так называемое & laquo-прямое»- и & laquo-непрямое»- узнавание. В случае & laquo-прямого»- узнавания белок распознает определенную последовательность пар оснований ДНК, образуя с их функциональными группами сеть контактов, присущую только данной последовательности нуклеотидов и соответствующую геометрии белковой молекулы. В случае же & laquo-непрямого»- узнавания избирательность связывания белковой молекулы с ДНК определяется локальными и зависящими от нуклеотидной последовательности конформационно-динамическими характеристиками ДНК — такими как гибкость, термодинамическая стабильность двойной спирали, её геометрия, подвижность определенных молекулярных групп и т. п. Таким образом, зависимость локальных конформационно-динамических свойств от последовательности пар оснований в ДНК играет важнейшую роль при функционировании молекулы ДНК в клетке. Поэтому, изучение контекстно-зависимых конформационных и динамических свойств молекулы ДНК является одной из важнейших задач молекулярной биофизики.

Существует ряд экспериментальных подходов к изучению структурных свойств молекулы ДНК. Для исследования влияния последовательности нуклеотидов на конформацию ДНК применяются методы рентгеноструктурного анализа, ЯМР, и ИК -спектроскопии. Экспериментальные данные о гибкости молекулы ДНК получают при помощи анализа её подвижности в геле и исследуя расщепление ДНК неспецифичными эндонуклеазами, а изменения геометрии малой бороздки двойной спирали вдоль ДНК изучают методами химического расщепления молекулы гидроксильными радикалами и другими химическими агентами.

При помощи перечисленных экспериментальных методик достаточно сложно извлечь информацию о динамических характеристиках изучаемых фрагментов ДНК. Здесь на помощь приходят методы молекулярного моделирования: молекулярная динамика, метод Монте-Карло, а также квантово-химические расчеты.

В Институте молекулярной биологии РАН в настоящее время развивается новый экспериментальный метод, позволяющий изучать конформационно-динамические свойства двойной спирали ДНК. Метод основан на анализе картин расщепления фрагментов ДНК под действием ультразвука высокой интенсивности. Контекстная специфичность расщепления, то есть зависимость профилей ультразвукового расщепления фрагментов ДНК от их нуклеотидной последовательности, позволяет изучать влияние последовательности пар оснований в ДНК на ее структурные свойства в масштабах от нескольких десятков до сотен нуклеотидов.

Явление контекстной специфичности разрывов ДНК под действием ультразвука представляет несомненный научный интерес как дополнительный источник информации о контекстно-зависимых характеристиках ДНК. Тем не менее, физика этого явления практически не изучена, что вызывает серьезные трудности при попытке интерпретации полученных результатов.

Анализ и моделирование расщепления ДНК ультразвуком, которым посвящена данная работа, необходимы, для более глубокого исследования физики этого процесса с целью дальнейшего применения и развития основанной на этом явлении методики изучения конформационно-динамических свойств ДНК.

Цели и задачи диссертационной работы

Целью данного исследования являлось выявление основных закономерностей процесса расщепления ДНК под действием ультразвука, разработка физических моделей, адекватно описывающих характерные особенности этого явления и применение полученных данных по расщеплению ДНК для анализа функциональных участков ДНК человека. Для достижения этих целей решались следующие основные задачи:

— установить характерные особенности расщепления ДНК ультразвуком-

— провести анализ контекстной специфичности расщепления-

— разработать модель, описывающую процесс расщепления фрагментов ДНК-

— сравнить полученные теоретические результаты с экспериментальными-

— разработать модель, качественно описывающую явление контекстной специфичности расщепления ДНК ультразвуком.

— исследовать особенности теоретических профилей ультразвукового расщепления, построенных для промоторных последовательностей ДНК человека.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

— получены относительные частоты ультразвукового расщепления фрагментов ДНК в ди- и тетрануклеотидном приближении-

— выявлено увеличение степени ультразвукового расщепления фосфодиэфирной связи, следующей за дезоксицитидином (в направлении от 5' к 3' концу фрагмента ДНК) —

— предложен подход к моделированию процесса расщепления ДНК под действием кавитационных эффектов, который позволяет описать характерные особенности наблюдаемого расщепления-

— разработана модель, позволяющая качественно описать явление контекстной специфичности ультразвукового расщепления-

— продемонстрирована возможность применения полученных относительных частот ультразвукового расщепления для анализа промоторных участков ДНК человека.

Апробация результатов диссертационной работы

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 5 статей в рецензируемых научных журналах ВАК России:

Биофизика& raquo-, & laquo-Журнал Структурной Химии& raquo-, «Journal of Biomolecular Structure & Dynamics», «In collection: NATO Science for Peace and Security Series В: Physics and Biophysics, Nanomaterials for Application in Medicine and Biology», «Biophysical Journal».

Основные результаты исследований, представленные в диссертационной работе, докладывались на следующих международных и российских конференциях: 13-ой международной конференции & laquo-Математика, компьютер, образование& raquo- (Дубна, 2006), 15-ой международной конференции & laquo-Математика, компьютер, образование& raquo- (Дубна, 2008), 17 -ой международной конференции & laquo-Математика, компьютер, образование& raquo- (Дубна, 2010) и 15-ом Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Петрозаводск, 2010), The second Saint-Petersburg International Conference on NanoBio Technologies, (NanoBio' 08, Саша-Петербург, Россия, 2008), 7th EBSA European Biophysics Congress, (EBSA, Генуя, Италия, 2009), Solvation and Ionic Effects in Biomolecules: Theory to Experiment, (Цахкадзор, Армения, 2010).

Список опубликованных статей по теме диссертации приведен в конце настоящего автореферата.

Научная новизна и практическая значимость работы

Все представленные выше результаты получены впервые. Предложенный подход к моделированию расщепления ДНК под действием ультразвука высокой интенсивности позволяет описать характерные особенности ультразвукового расщепления ДНК. Выявленная корреляция относительных частот ультразвукового расщепления с имеющимися в литературе данными о конформационной подвижности дезоксирибозы позволяет построить модель, качественно описывающую явление контекстной специфичности расщепления ДНК. В соответствии с предложенной моделью, различие в относительных степенях ультразвукового расщепления является следствием отличия конформационной динамики дезоксирибозных групп сахарофосфатного остова ДНК. Таким образом, относительные частоты ультразвукового расщепления, по всей видимости, позволяют описывать влияние нуклеотидной последовательности ДНК на подвижность определенных участков сахарофосфатного остова. Полученные результаты могут быть использованы для выявления функциональных сайтов ДНК при анализе геномных последовательностей.

Личный вклад автора

Все результаты оригинальных теоретических исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии. Экспериментальные результаты были получены в лаборатории ДНК-белковых взаимодействий Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН к.х.н. С. Л. Гроховским.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав и заключения. Каждая глава снабжена краткой аннотацией, состоит из нескольких разделов и заключения. В конце работы приведен библиографический список используемой литературы и список публикаций автора по теме диссертации. Полный объем диссертационной работы составляет 90 страниц, включая 30 рисунков.

Основные результаты и выводы

1. Получены средние относительные частоты ультразвукового расщепления ДНК, описывающие зависимость вероятности расщепления сахарофосфатного остова от последовательности нуклеотидных пар в рамках ди- и тетрануклеотидного приближений.

2. Характер изменения частоты расщепления фосфодиэфирных связей от их положения в цепи фрагмента, а также специфика зависимости общего уровня расщепления ДНК от физико-химических параметров облучаемого раствора свидетельствуют о механохимической природе наблюдаемых разрывов в фрагментах ДНК под действием ультразвука.

3. Развит подход к моделированию расщепления фрагментов ДНК под действием кавитационных эффектов в облучаемом растворе, на основе которого показано, что возникающие вблизи кавитационных пузырьков высокие градиенты скорости течения

О I жидкости (порядка 10 с& quot-) способны приводить к разрыву фрагментов ДНК длиной в несколько сотен нуклеотидных пар.

4. Предложена модель, качественно описывающая явление контекстной специфичности расщепления ДНК ультразвуком. В соответствии с разработанной моделью, наблюдаемое увеличение частоты расщепления фосфодиэфирной связи, примыкающей к дезоксицитидину, связано с особенностью конформационной динамики дизоксирибозы этого нуклеотида.

5. При помощи полученных статистических данных по ультразвуковому расщеплению ДНК показано, что в промоторных областях генов МУС- кластера человека, имеет место тенденция к уменьшению ультразвукового расщепления по сравнению с кодирующими областями.

Показать Свернуть

Содержание

Глава 1. Литературный обзор.

1.1 Подходы к изучению контекстно-зависимых физико-химических свойств ДНК.

1.2 Физика упругих растяжений ДНК.

1.3 Расщепление полимеров под действием ультразвука.

Глава 2. Ультразвуковое расщепление ДНК: обработка и анализ экспериментальных данных.

2.1 Описание эксперимента и процедуры обработки экспериментальных данных.

2.2 Характерные свойства ультразвукового расщепления ДНК.

2.3 Статистический анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком.

Глава 3. Моделирование расщепления фрагментов ДНК под действием акустической кавитации.

3.1 Моделирование динамики кавитационного пузырька.

3.2 Моделирование взаимодействия фрагмента ДНК с кавитационным течением.

3.3 Моделирование кинетики расщепления фрагментов ДНК под действием акустической кавитации.

3.4 Обсуждение.

Глава 4. Подходы к интерпретации специфичности расщепления ДНК ультразвуком.

4.1 Особенности конформационной динамики В- формы ДНК.

4.2 Влияние конформационной подвижности дезоксирибозы на эффективность ультразвукового расщепления ДНК.

4.3 Обсуждение.

Глава 5. Исследование особенностей ультразвукового расщепления функциональных областей ДНК.

5.1. Особенности ультразвукового расщепления ДНК Х-фага.

5.2 Применение данных по специфичности ультразвукового расщепления ДНК для анализа промоторных областей генома человека.

Список литературы

1. Arora M., Ohl C.D., Lohse D. Effect of nuclei concentration on cavitation cluster dynamics. // J Acoust Soc Am. 2007. V. 121(6). P. 3432−6.

2. Ashkin A., Dziedzic J.M., Bjorkholm J.E., Chu S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. // Optics Lett. 1986. V. 11 .P. 288−290.

3. Bajic KB., Tan S.L., Suzuki Y" Sugano S., Tan S.L., Suzuki Y., Sugano S., Suzuki Y., Sugano S., Sugano S. Promoter prediction analysis on the whole human genome // Nat. Biotechnol. 2004. V. 22. P. 1467−1473.

4. Basedow A. M. and Ebert. E.B. Ultrasonic degradation of polymers in solution. // Advances in Polymers Science. A. Abe, A. -C. Albertsson, ., J. Genzer, editors. Springer, Berlin/Heidelberg. 1977. V. 22. P. 83−148.

5. Becker N.B., Wolff L., Everaers R. Indirect readout: detection of optimized subsequences and calculation of relative binding affinities using different DNA elastic potentials // Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34. P. 5638−5649.

6. Bensimon D., Simon A.J., Croquette V., Bensimon A. Stretching DNA with a receding meniscus: experiments and models. Phys Rev Lett. 1995. V. 74. P. 4754−4757.

7. Binnig G, Quale CG, Gerber C. Atomic force microscope. // Phys Rev Lett. 1986. V. 56. P. 930−933.

8. Bremen C.E. Cavitation and bubble dynamics. // Oxford University Press. 1995.

9. Brukner I., Jurukovski V., SavicA. Sequence-dependent structural variations ofDNA revealed by DNase I. // Nucleic Acids Research. 1990.V. 18(4). P. 891−894.

10. Brukner I., Sanchez R., Suck D., Pongor S. Sequence-dependent DNA bending as revealed by DNase I: Bending Parameters for trinucleotides. // EMBO Journal. 1995.V. 14. P. 18 121 818.

11. Bustamante C., Marko J.F., Siggia E.D., Smith S. Entropie elasticity of ambda-phage DNA. // Science. 1994. V. 265. P. 1599−1601.

12. Cao XQ, Zeng J, Yan H. Structural property of regulatory elements in human promoters // Phys Rev E StatNonlin Soft Matter Phys. 2008. Vol. 77(4 Pt I). P. 41 908.

13. Cluzel P, Lebrun A, Heller C, Lavery R, Viovy J-L, Chatenay D, Caron F. DNA: an extensible molecule. // Science. 1996. V. 271. P. 792−794.

14. Cordier C., Marcourt L., Dodin G. Conformational variation ~of the central CG site in d (ATGACGTCAT)2 and d (GAAAACGTTTTC)2. An NMR, molecular modelling and 3D-homology investigation. // Eur. J. Biochem. 1999.V. 261.P. 722−733.

15. Das R" Laederach A., Altman R.B. SAFA: semi-automated footprinting analysis software for high-throughput quantification of nucleic acid footprinting experiments. RNA. 2005. V. 11. P. 344−354.

16. Dineen D.G., Wilm A., Cunningham P., Higgins D.G. High DNA melting temperature predicts transcription start site location in human and mouse // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37(22). P. 7360−7.

17. Doi M. and Edwards S.F. The Theory of Polymer Dynamics // Clarendon Press, Oxford. 1986.

18. Duchardt E" Nilsson L. and Schleucher J. Cytosine ribose flexibility in DNA: a combined NMR 13C spin relaxation and molecular dynamics simulation study. // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. 4211−4219.

19. Faiger H, Ivanchenko M" Cohen I., Haran T.E., Ivanchenko M., Cohen I., Haran T.E., Cohen L, Haran T.E., Haran T.E. TBP flanking sequences: Asymmetry of binding, long-range effects and consensus sequences // Nucleic Acids Res, 2006. Vol. 34. P. 104−119.

20. Fernandes M.X., Ortega A., Lopez Martinez M.C., Garcia de la Torre J. Calculation of hydrodynamic properties of small nucleic acids from their atomic structure. //Nucleic Acids Res. 2002. V. 30(8).P. 1782−8

21. Florquin K, Saeys Y Degroeve S, Rouze P, Van de Peer Y Large-scale structural analysis of the core promoter in mammalian and plant genomes // Nucleic Acids Res. 2005. Vol. 33(13). P. 4255−64.

22. FlynnH.G. Physics of acoustic cavitation in liquids. // In: Physical acoustics. 1964. V. l-B.p. 51.

23. Foloppe N. and MacKerell A.D. Jr. Contribution of the phosphodiester backbone and glicosil linkage intrinsic torsional energetic to DNA structure and dynamics. // J. Phys. Chem. 1999. V. 103.P. 10 955−10 964.

24. Foloppe N. and MacKerell A. D. Jr. Intrinsic conformational properties of deoxyribonucleosides: implicated role for cytosine in the equilibrium among the A, B, and Z forms of DNA. // Biophys. J. 1999. V. 76. P. 3206−3218.

25. Gooberman G. Ultrasonic degradation of polystyrene. Part.l. A proposed mechanism for degradation. // J Polymer Sci. V. 42. P. 25

26. Goni JR, Perez A, Torrents D, Orozco M. Determining promoter location based on DNA structure first-principles calculations. // Genome Biol. 2007. V. 8(12). R263.

27. Gore J., Bryant Z, Nollmann M., Le M. U., Cozzarelli N.R., Bustamante C. DNA overwinds when stretched. //Nature. 2006. V. 442(7104). P. 836−9.

28. Grandbois M., Beyer M., Rief M., Clausen-Schaumann II., Gaub HE. How strong is a covalcnt bond?// Science. 1999. V. 283. P. 1727−1730.

29. Greenbaum J. A., Pang Bo, and Tullius T. D. Construction of a genome-scale structural map at single-nucleotide resolution // Genome Res. 2007. Vol. 17., P. 947−953

30. Grokhovsky S.L., Il’icheva I.A., Nechipurenko D.Y., Golovkin M.V., Panchenko L. A, Polozov R.V. and Nechipurenko D.Y. Sequence-Specific Ultrasonic Cleavage of DNA. // Biophysical Journal. 2011.V. 100.P. 117−125.

31. Grosberg A.Y., Khokhlov A.R. Statistical Physics of Macromolecules. // Woodbury, New York: American Institute of Physics. 1994.

32. Hakim H. B., Lindsay S. M. and Powell J. The speed of sound in DNA. // Biopolymers. 1984.V. 23.P. 1185−1192.

33. Hansma H.G. Properties of biomolecules measured from atomicforce microscope images: a review. //J Struct Biol. 1997. V. 119. P. 99−108.

34. Heddi B., Foloppe N.,., Hartmann B. Quantification of DNA BI/BII backbone states in solution. Implications for DNA overall structure and recognition. // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 9170−9177.

35. Olson, W. K., A. A. Gorin, ., V. B. Zhurkin. DNA sequence dependent deformability deduced from protein-DNA crystal complexes. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. 95: 1 116 311 168.

36. Packer M.J., Dauncey M.P., Hunter C.A. Sequence-dependent DNA Structure: Tetranucleotide Conformational Maps. // Journal of Molecular Biology. V. 295 (1). 2000. P. 85−103.

37. Parker S.C., Hansen L" Abaan H.O., Tullius T.D., Margidies E.H. Local DNA topography correlates with functional noncoding regions of the human genome II Science. 2009. Vol. 324(5925). P. 389−92.

38. PedersenA.G., Baldi P., Chauvin Y., BrunakS. DNA Structure in Human RNA Polymerase II Promoters // J. Mol. Biol. 1998. Vol. 281. P. 663−673. 87

39. Rohs R., West S.M., Liu P., Honig B. Nuance in the double-helix and its role in protein-DNA recognition//Curr. Opin. inStruct. Biol. 2009. Vol. 19. P. 171−177.

40. Schmidt S. W., Beyer M.K. and Clausen-Schamnann H. Dynamic strength of the silicon-carbon bond observed over three decades of force-loading rates. // J. Am. Chem. Soc. 2008. V. 130. P. 3664−3668.

41. Schramm, L., Hernandez, N. Recruitment of RNA polymerase III to its target promoters. Genes Dev. 2002. V. 16. P. 2593−2620.

42. Smith S.B., Finzi L" Bustamante C. Direct mechanical measurement of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. //Science. 1992.V. 258.P. 1122−1126.

43. Smith S.B., Cui Y., Bustamante C. Overstretching B-DNA: the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. // Science. 1996.V. 271.P. 795−799.

44. Solovyev V., Kosarev P., Seledsov I., Vorobyev D., Kosarev P., Seledsov I., Vorobyev D., Seledsov I., Vorobyev D., Vorobyev D. Automatic annotation of eukaryotic genes, pseudogenes and promoters // Genome Biol. 2006. Vol. 7. P. 11−12.

45. Sonnenburg S.O., ZienA., Ratsch G., Zien A., Rdtsch G., Ratsch G. ARTS: Accurate recognition of transcription starts in human // Bioinformatics. 2006. Vol. 22. P. 472−480.

46. Svoboda K, Block S.M. Biological applications of optical forces. //Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1994. V. 23. P. 247−285.

47. Thomas J. R. Sonic degradation of high polymers in solution. Hi. Phys. Chem. 1959. V. 63. P. 1725.

48. Wang G., Zhang W., Zhang W. A steganalysis-based approach to comprehensive identification and characterization of functional regulatory elements // Genome Biol. 2006. Vol. 7. R49. doi: 10. 1186/gb-2006−7-6-r49.

49. Wang M.D., YinH., LandickR, GellesJ., Block S.M. Stretching DNAwith optical tweezers. // Biophys. J. 1997. V. 72. P. 1335−1346.

50. Wu Z" Delaglio K, Tjandra N" Zhurkin V.B., BaxA. Overall structure and sugar dynamics of a

51. DNA dodecamer from homo- and heteronuclear dipolar couplings and 31P chemical shiftanisotropy. // J Biomol NMR. 2003. V. 26(4). P. 297−315.

52. Бутягин П. Ю., Кинетика и природа механохимических реакций. // Успехи химии. 1971. т. 40. с. 1935−1959.

53. Гроховский С. Л. Специфичность расщепления ДНК ультразвуком // Мол. биология. 2006. т. 40, с. 317−325.

54. Маргулис М. А. Основы звукохимии. Химические реакцим в акустических полях. // Высшая школа. Москва. 1984.

55. Эльпинер И. Е. Биофизика ультразвука. // Серия: Физика жизненных процессов. М. Наука 197

56. Публикации по теме диссертации

57. Нечипуренко Ю. Д., Полозов Р. В., Нечипуренко Д. Ю., Ильичева И. А., Воробьев Е. А., Гроховский С. Л. и Гурский Г. В. Математические модели регуляции экспрессии генов: механические возмущения структуры ДНК. // Математика.

58. Компьютер. Образование: Сб. научных трудов. Том.2 / Под ред. Г. Ю. Ризниченко.

59. М. -Ижевск: НИЦ & quot-Регулярная и хаотическая динамика& quot-. 2006, С. 392−402.

60. Гроховский C. JI., Ильичева И. А., Нечипуренко Д. Ю., Панченко Л. А., Полозов Р. В., Нечипуренко Ю. Д. Локальные неоднородности структуры и динамики двухспиральной ДНК: исследование при помощи ультразвука. Биофизика. 2008, Т. 53, С. 417−425.

61. Ю. Д. Нечипуренко, М. В. Головкин, Д. Ю. Нечипуренко, И. А. Ильичева, Л. А. Панченко, Полозов Р. В., Гроховский С. Л. Характерные особенности расщепления ДНК ультразвуком. Ж. Структурной химии. 2009, Т. 50, № 5, С. 1040 1047.

62. A. Il’icheva, D. Yu. Nechipurenko, S. L. Grokhovsky Ultrasonic Cleavage of Nicked DNA J. of Biomolecular Structure & Dynamics. 2009, 27, № 3, P. 391−397.

63. Головкин M.B., Нечипуренко Д. Ю., Ильичева И. А., Панченко Л. А., Полозов Р. В., Гроховский С. Л. Нечипуренко Ю.Д. Математические методы анализа электрофоретических картин расщепления ДНК. Компьютерные исследования и моделирование. 2009, Т. 1, № 3, С. 287−295.

64. Автор также благодарен своим родителям, бабушке и деду за доброту, понимание и заботу. I

Заполнить форму текущей работой