Изучение механизмов взаимодействия компонентов фотосинтетической цепи транспорта электрона методами компьютерного моделирования

Тип работы:
Диссертация
Предмет:
Биофизика
Страниц:
108


Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Актуальность проблемы

Изучение механизмов взаимодействия белков и мульти-белковых комплексов, участвующих в реакциях первичных процессов фотосинтеза, и механизмов их регуляции представляет большой интерес для современной биологии. Для исследования этих процессов используют методы направленного мутагенеза, исследуют протекание реакций в присутствии различных ингибиторов и солей, при различной ионной силе, рН раствора, температуре, строят математические модели.

Исследования с помощью направленного мутагенеза дороги и требуют больших затрат времени. Поэтому большой интерес представляют модели, описывающие взаимодействия белков. С одной стороны, расчеты на модели не должны занимать много времени, с другой — достаточно реалистично описывать происходящие процессы.

В реакциях первичных процессов фотосинтеза участвуют мембранные комплексы фотосинтетических реакционных центров — фотосистемы 1 (PSI) и фотосистемы 2 (PSII), цитохромный b6f комплекс и подвижные белки переносчики — пластоцианин и ферредоксин у высших растений и их аналоги у цианобактерий и некоторых водорослей — цитохром с6 (cyt с6) и флаводоксин. Небольшие гидрофобные молекулы пластохинона осуществляют транспорт электрона в мембране.

В кинетических моделях первичных процессов фотосинтеза (Ризниченко 1991- Stirbet, Govindjee et al. 1998- Лебедева, Беляева и др. 2000- Лебедева, Беляева и др. 2002) перенос электрона внутри мембранных комплексов описывается с помощью вероятностей состояний комплексов, а стадии транспорта электрона подвижными переносчиками — с помощью закона действующих масс. Эти модели не могут учесть геометрию люминального пространства, в котором происходит транспорт электронов пластоцианином от цитохромного b6f комплекса к PSI. Многочастичные модели процессов фотосинтеза (Коваленко, Абатурова и др. 2007), учитывающие особенности диффузионного пространства для подвижных переносчиков и неоднородность распределения комплексов в мембране, хорошо описывают эффекты, связанные с геометрией. Они базируется на экспериментальных кинетических данных и данных о характере распределения комплексов в мембране. Однако эти модели не учитывают электростатические взаимодействия белков и их сложную поверхность. Есть работы по броуновской динамике взаимодействия фотосинтетических белков (Pearson & Gross 1998- Rienzo, Gabdoulline et al. 2001- Gross & Pearson 2003- Haddadian & Gross 2005), учитывающие реальную форму белков и электростатические взаимодействия. Однако в этих работах моделируется взаимодействие только пары белков, не рассматриваются ансамбли взаимодействующих «макромолекул и не учитывается форма реакционного объема.

В данной работе метод многочастичного прямого моделирования t объединен с методом броуновской динамики и применен к описанию взаимодействия белков в фотосинтетических процессах. Разработанная нами модель учитывает сложную геометрию люминального пространства, электростатические взаимодействия белков и их форму, а также позволяет получать кинетические кривые связывания белков. В модели используются современные данные о структуре фотосинтетических белков. Возможность построения такой модели появилась в последние годы благодаря получению данных о структуре исследуемых белков и развитию вычислительных ресурсов компьютеров. Метод может быть применен для моделирования взаимодействия белков различной природы.

Цели и задачи работы

Целью работы является изучение с помощью многочастичного компьютерного моделирования роли электростатических взаимодействий, формы фотосинтетических электрон-транспортных белков и геометрии люминального пространства в формировании кинетики связывания белков. Были поставлены следующие задачи:

1. Разработать метод многочастичного компьютерного моделирования для описания взаимодействия фотосинтетических электрон-транспортных белков с учетом электростатических сил и сложной формы белков.

2. Построить модели взаимодействия в растворе следующих фотосинтетических белков: пластоцианина и цитохрома/ пластоцианина и комплекса PSI, флаводоксина и комплекса PSI.

3. Оценить параметры прямых многочастичных моделей (вероятности и расстояния связывания) с использованием экспериментальных данных по взаимодействию белков в растворе.

4. Построить модель взаимодействия пластоцианина-цитохрома / в люмене тилакоида.

5. Изучить влияние электростатических взаимодействий и геометрии на кинетические характеристики процессов. Сравнить полученные эффекты с экспериментальными данными.

Научная новизна

Впервые построена многочастичная компьютерная модель броуновской динамики фотосинтетических белков, учитывающая электростатические взаимодействия, сложную форму белков и геометрию люминального пространства. Разработан метод аппроксимации поверхности белков набором сфер. Проведена идентификация параметров отдельных стадий процессов по экспериментальным данным.

На модели показана важная роль электростатических взаимодействий в связывании пластоцианина с цитохромом/ пластоцианина с фотосистемой 1, фотосистемы 1 с флаводоксином. На модели впервые показано, что изменение размеров люминального пространства дает возможность регуляции скорости связывания пластоцианина с цитохромом f и фотосистемой 1.

Практическая значимость

Результаты исследования существенно углубляют современные знания о роли электростатических взаимодействий и геометрических ограничений реакционного пространства в связывании подвижных белков переносчиков с мультибелковыми фотосинтетическими мембранными комплексами. Построенная модель позволяет изучать влияние мутаций белков на эффективность процессов фотосинтеза, что имеет большое практическое значение для оптимизации экспериментального поиска мутантов для повышения эффективности выхода фотосинтеза. Данная модель может быть использована для изучения взаимодействия белков различной природы, как в растворе, так и в реакционном объеме сложной формы и с гетерогенным распределением реагентов. Модель будет использована при проведении практикумов по биофизике (темы — & laquo-Биологические мембраны& raquo- и & laquo-Математическое моделирование биологических процессов& raquo-).

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: 13-той -15-той Международных конференциях & laquo-Математика. Компьютер. Образование& raquo-, Дубна, 2006, 2008, Пущино, 2007- Международной конференции «Photosynthesis in the Post-Genomic Era: Structure and Function of Photosystems», Пущино, 2006- Международном семинаре «Trends in Transient Interactions between Biological Macromolecules», Севилья, Испания, 2007- 16-ом Международном симпозиуме «Flavins and Flavoproteins», Хака, Испания, 2008- семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 2 — в журнале, рекомендованном ВАК для соискателей ученых степеней, 1 — в зарубежном рецензируемом журнале, 4 — в сборниках научных трудов международных конференций и 9 тезисов — в сборниках тезисов докладов международных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, содержащих описание методов и результатов работы, выводов, приложения, списка литературы из 148 наименований. Объем диссертации 143 страницы, 42 рисунка и 7 таблиц.

выводы

1. Построена многочастичная компьютерная модель броуновской динамики фотосинтетических белков, учитывающая электростатические взаимодействия, сложную форму белков и геометрию люминального пространства. Модель адекватно описывает экспериментальные данные по влиянию ионной силы раствора на константы связывания белков.

2. На модели показана важная роль электростатических взаимодействий в связывании пластоцианина с цитохромом/ пластоцианина с фотосистемой 1, флаводоксина с фотосистемой 1. Для пластоцианина, выделенного из различных мутантных форм шпината, выявлена роль аминокислотных остатков Glu43, Glu59 и Glu60 в процессе взаимодействия белков.

3. Показано, что для формирования немонотонной зависимости константы связывания пластоцианина и флаводоксина с фотосистемой 1 от ионной силы в модели достаточно учета только электростатических, взаимодействий.

4. На модели получена немонотонная зависимость константы связывания пластоцианина и цитохрома/в люмене тилакоида от расстояния между мембранами (с максимумом при 8−10 нм), что согласуется с экспериментальными данными. Изменение размеров люминального пространства обеспечивает возможность регуляции взаимодействия пластоцианина и цитохрома/

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанные нами прямые многочастичные модели связывания белков представляют новый подход к изучению кинетики образования комплексов в ансамблях взаимодействующих молекул. В результате моделирования получаются кинетические кривые, которые можно сравнивать напрямую с экспериментальными. В моделях учтены электростатические взаимодействия, геометрические особенности молекул и реакционного объема. Моделируется одновременное взаимодействие большого количества молекул с учетом геометрических особенностей реакционного объема.

На модели можно изучать влияние соотношения концентраций реагентов на кинетику связывания белков, изучать влияние ионной силы, формы молекул и распределения зарядов на молекулах, рН, температуры, геометрических свойств системы на кинетические характеристики взаимодействия белков.

Мы промоделировали взаимодействие Рс с cyt f, Рс с PSI и Fid с PSI в растворе. Наши модели описывают влияние мутаций для взаимодействия Рс с cyt/и Рс с PSI и ионной силы для взаимодействия Рс с cyt/ Рс с PSI и Fid с PSI. На модели связывания Рс с cyt/ в люмене тилакоида изучено влияние расстояния между мембранами и характера расположения молекул в пространстве на кинетику связывания белков.

Мы оценили параметры модели (расстояния связывания и вероятность связывания) для трех пар белков. В случае реакции Рс и cyt/ мы подобрали пять расстояний связывания. Оцененные расстояния связывания между поверхностными аминокислотными остатками варьировались от 18 до 25 А. Расстояние между редокс центрами — атомами Си и Fe — было больше и равнялось 40 А. Это связано с тем, что атомы Си и Fe расположены не на поверхности молекул Рс и cyt/ а на некотором удалении, поэтому и в экспериментальном комплексе (Ubbink, Ejdebeck et al. 1998) расстояние между ними не 2−5 А, а 11 А.

Большие расстояния связывания в модели по сравнению с расстояниями в экспериментальном комплексе связаны с особенностями модели. В модели не. учитывается конформационная подвижность молекул, поэтому, когда в модели молекулы подходят на близкие расстояния, их поведение отличается от поведения в эксперименте — выступающие и мешающие более близкому сближению части молекул не могут сместиться. Также в модели не учтены гидрофобные взаимодействия и водородные связи, стабилизирующие плотно сблизившиеся молекулы в комплексе. Кроме этого в модели связывания Рс и cyt/ использовалась грубая аппроксимация их поверхностей набором сфер, что препятствовало плотному сближению молекул.

Если в модели мы задаем расстояния связывания меньше подобранных, константа связывания сначала уменьшается, а потом падает до нуля из-за невозможности образования комплексов. Уменьшение константы связывания может быть компенсировано увеличением вероятности связывания. При этом модель становится менее чувствительной к электростатическим взаимодействиям и перестает описывать влияние мутаций на константу связывания белков.

В моделях связывания Fid с PSI и Рс с PSI использовалась более точная аппроксимация поверхностей с помощью программы. Поэтому расстояния связывания в моделях получились меньше — 22 А между находящимися не на поверхности молекул редокс центрами флаводоксина (ФМН) и фотосистемы 1 (железо-серным кластером Fb) и 6 А между Asp44 пластоцианина и Lys23 субъединицы F фотосистемы 1. То, что для описания экспериментальных данных оказалось достаточным задание только одного расстояния связывания, может быть связано с более подробным описанием поверхности набором сфер, особенностями потенциала и формы PSI, обеспечивающими однозначную ориентацию молекул Fid и Рс при их сближении, меньшее количество экспериментальных данных, которым должны были удовлетворять модели. В случае реакции Рс и cyt/ это были константы связывания при ионной силе 100 мМ для дикого типа Рс и семи мутантных его форм- в случае Fid и PSI — это зависимость константы связывания от ионной силы для диких типов белков- в случае Рс и PSI — это константы связывания при ионной силе 100 мМ для дикого типа Рс и двух мутантных его форм. Выяснение связи между особенностями строения белков и оптимальным задаванием параметров модели требует дополнительного исследования.

Несмотря на то, что наши модели не слишком подробно описывают поведение молекул вблизи, (на расстояниях меньше 5 А), они адекватно описывают электростатические взаимодействия и диффузию молекул на больших расстояниях и пригодны для изучения влияния электростатических взаимодействий и формы реакционного объема и молекул на процесс их связывания.

Целями нашего дальнейшего исследования является моделирование не только связывания белков в комплекс, но и распада комплекса, моделирование двухфазной кинетики восстановления реакционного центра PSI пластоцианином после вспышки света, моделирование транспорта электрона пластоцианином от Cyt b6f комплекса к PSI в люмене тилакоида с учетом наличия других мембранных комплексов и особенностей распределения комплексов в мембране тилакоида, учет электростатического поля мембраны и гидрофобных взаимодействий. Развитие нашей модели для предсказания ориентации белков в комплексе. Сравнительный анализ характеристик образования комплекса для разных белков позволит сделать выводы о специфических механизмах выполнения отдельными белками их биологических функций.

ПоказатьСвернуть

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ. Общая характеристика работы.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Электронный транспорт в мембране тилакоида. Структурные и функциональные аспекты.

1.1.1. Пространственная организация хлоропласта и тилакоидной мембраны.

1.1.2. Цитохромный bef комплекс.

Цитохром f.

Цитохром Ь& lt-$.

Железосерный белок Риске.

1.1.3. Фотосистема 1.

Структура фотосистемы 1.

Субъединицы фотосистемы 1 и их функции.

Светособирающий комплекс 1.

1.1.4. Пластоцианин.

Структура.

Диффузия в люмене тилакоида.

1.1.5. Флаводоксин.

1.1.6. Структуры фотосинтетических белок-белковых комплексов.

Комплекс пластоцианина и цитохрома f.

Комплекс пластоцианина и фотосистемы 1.

Комплекс фотосистемы 1 и флаводоксина.

1.2. Экспериментальные данные по кинетике транспорта электрона.

1.2.1. Кинетика реакции пластоцианина и цитохрома/в растворе.

1.2.2. Кинетика реакции пластоцианина и фотосистемы 1 в растворе

1.2.3. Кинетика реакций пластоцианина с цитохромом/и фотосистемой 1 в люмене тилакоида.

1.2.4. Кинетика реакции фотосистемы 1 и флаводоксина в растворе. 46 1.3. Математические модели транспорта электронов при фотосинтезе

1.3.1. Кинетические модели.

Модели цитохромного b$f комплекса.

Модели фотосистемы 1.

Модели полной цепи электронного транспорта.

1.3.2. Пространственно-распределенные модели электронного транспорта.

1.3.3. Модели броуновской динамики.

Основы метода броуновской динамики.

Описание взаимодействия пластоцианина и цитохролш f.

Модель взаимодействия цитохрома с и цитохром с-оксидазы с учетом мембраны.

1.3.3. Применение метода молекулярной динамики при моделировании связывания белков.

Список литературы

1. Albertsson P. -A. A quantitative model of the domain structure of the photosynthetic membrane // TRENDS in Plant Science 2001V. 6. -1. 8, — P. 349−354.

2. Antosiewicz J., Gilson M. K., Lee I. H., McCammon J. A. Acetylcholinesterase: Diffusional Encounter Rate Constants for Dumbbell Models of Ligand // Biophysical Journal.- 1995. -V. 68,-P. 62−68.

3. Arvidsson P. -O., Sundby C. A model for the topology of the chloroplast thylakoid membrane //Aust. J. Plant Physiol.- 1999.- V. 26.- P. 687−694.

4. Baake E., Schloder J. P. Modeling the fast fluorescence rise of photosynthesis. // Bull. Math. Biol.- 1992.- V. 54, — P. 999−1021.

5. Barth P., Guillouard I., Setif P., Lagoutte B. Essential role of a single arginine of photosystem I in stabilizing the electron transfer complex with ferredoxin // J Biol Chem — 2000 — V. 275. -1. 10. -P. 7030−7036.

6. Ben-Shem A., Frolow F., Nelson N. Crystal structure of plant photosystem I // Nature. -2003. -V. 426. -P. 630−635. «'

7. Berrnan H. M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T. N., Weissig H., Shmdyalov I. N., Bourne P. E. The Protein Data Bank // Nucl. Acids Res.- 2000 V. 28.- I. 1.- P. 235−242.

8. Borodich A., Rojdestvenski I., Cottam M. Lateral Heterogeneity of Photosystems in Thylakoid Membranes Studied by Brownian Dynamics Simulations // Biophysical Journal. -2003.- V. 85. -P. 774−789.

9. Bottin H., Mathis P. Interaction of plastocyanin with the photosystem I reaction center: a kinetic study by flash absorption spectroscopy // Biochemistry.- 1985 — V. 24. -1. 23.- P. 6453−6460.

10. Chung S. -H., Hoyles M., Allen Т., Kuyucak S. Study of Ionic Currents across a Model Membrane Channel Using Brownian Dynamics // Biophysical Journal 1998 — V. 75-P. 793−809.

11. Crowley P., Hunter D., Sato K., McFarlane W., Dennison C. The parsley plastocyanin-turnip cytochrome f complex: a structurally distorted but kinetically functional acidic patch. // Biochem. J.- 2004.- V. 378.- P. 45−51.

12. Cruz J. A., Salbilla B. A., Kanazava A., Kramer D. M. Inhibition of plastocyanin to P700+ electron transfer in Chlamydomonas reinhardtii by hyperosmotic stress // Plant Physiol. -2001. -V. 127,-P. 1167−1179.

Заполнить форму текущей работой