NADH: убихинон-оксидоредуктаза митохондрий: аламетицин как инструмент для изучения внутримитохондриальных ферментов и топография реакционноспособных SH-групп комплекса I

Тип работы:
Диссертация
Предмет:
Биохимия
Страниц:
97


Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Изучение ферментов внутренней мембраны и матрикса интактных митохондрий сильно осложнено существованием барьеров проницаемости для добавленных извне реагентов (субстратов, ингибиторов, возможных регуляторов). Рассмотрим в качестве примера более или менее распространенный прием оценки ферментативной активности Комплекса I дыхательной цепи по скорости потребления кислорода митохондриями в присутствии субстрата, окисляющегося NAD-зависимой дегидрогеназой цикла Кребса. Измеряемая скорость реакции определяется, по крайней мере, 4 ферментами: специфическим переносчиком субстрата из внешней среды в матрикс, NAD-зависимой дегидрогеназой, Комплексом I и убихинол-оксидазным участком дыхательной цепи. Вклад активности каждого из этих ферментов в измеряемую скорость дыхания чаще всего неизвестен и потребление кислорода в такой системе может служить только качественной оценкой активности Комплекса I, также как и трех других ферментов. Аналогичная ситуация возникает и при измерении активностей других внутримитохондриальных ферментов: Комплекса II (сукцинат: убихинон-оксидоредуктазы), F0FrATPa3bi, дегидрогеназ цикла Кребса. Применительно к ферментам внутренней мембраны митохондрий указанную трудность обычно преодолевают, используя один из следующих методических приемов. Обработка митохондрий ультразвуком приводит к образованию & laquo-вывернутых»- («inside-out») фрагментов внутренней мембраны митохондрий (так называемые субмитохонлриальные частицы — СМЧ), где активные центры Комплекса I, II и F0FrATPa3bi оказываются доступны для добавленных субстратов. Мембраны можно также разрушить многократным замораживанием и оттаиванием интактных митохондрий. Наконец, использование поверхностно-активных веществ (детергентов) позволяет солюбилизировать мембраны и получить высокоочищенные гомогенно-дисперсные препараты, для которых проблема проницаемости не существует. Перечисленные приемы позволили сформировать современные представления о структуре и каталитических свойствах компонентов сопрягающей мембраны митохондрий. Следует, однако, иметь в виду, что каталитические и регуляторные свойства этих ферментов в интактных митохондриях могут отличаться от тех, которые хорошо изучены с использованием препарата & laquo-вывернутых»- СМЧ или очищенных препаратов (вследствие изменения естественного фосфолипидного окружения, потери белков и/или низкомолекулярных компонентов матрикса, специфического, или неспецифического влияния детергентов). В связи с этим представляется актуальным найти способ измерения активности внутримитохондриальных ферментов в интактных митохондриях.

В течение многих лет наша группа занимается изучением каталитических и регуляторных свойств митохондриальной ЫАОН: убихинон-оксидоредуктазы (Комплекс I дыхательной цепи). Один из результатов наших исследований -обнаружение и характеристика необычного свойства фермента: его существование в двух медленно взаимопревращающихся формах (А — активная, О — деактивированная формы фермента). Молекулярный механизм этого превращения (А< ->0-переход) неизвестен. Переход комплекса в О-форму (каталитически неактивную) сопровождается появлением чувствительности фермента к 8Н-реагентам. Можно предположить, что реакционноспособная БН-группа (АЯ)-8Н) является мишенью для регуляторного воздействия на фермент природных соединений. В связи с этим установление локализации этой 8Н-группы Комплекса I в интактных митохондриях (матрикс или межмембранное пространство) — актуальная задача исследования фермента.

Настоящая работа имела две цели: 1) разработать простой способ измерения активности и характеристики свойств Комплекса I в интактных митохондриях- 2) установить локализацию и выяснить реакционноспособность ЭН-группы одной из форм Комплекса I.

Для достижения первой цели мы изучили влияние порообразующего антибиотика аламетицина на активности внутримитохондриальных ферментов и показали, что его использование позволяет количественно изучать активность Комплекса I в интактных митохондриях [СоБ^тБкауа, 2003].

Используя аламетицин в качестве инструмента, мы показали, что реакционноспособная БН-группа Комплекса I локализована на матриксной стороне внутренней мембраны митохондрий [ОоБитБкауа, 2006].

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Способы измерения активности ферментов в интактных митохондриях

Разделение процессов клеточного метаболизма по разным органеллам -прогрессивная черта эукариотических организмов. Митохондрии, где происходит окислительное фосфорилирование, представляют собой пример одного из таких достаточно специализированных клеточных образований.

Митохондриальный матрикс окружен двумя мембранами — наружной и внутренней. В наружной мембране имеются поры, способные пропускать соединения с молекулярной массой < 10 кДа. Поэтому считают, что состав низкомолекулярных соединений в цитозоле и межмембранном пространстве идентичны. Наружная мембрана окружает многократно превышающую ее по поверхности сильно складчатую внутреннюю мембрану, формирующую осмотический барьер между межмембранным пространством и матриксом. Во внутренней мембране имеются специфические переносчики для множества метаболитов (АТР/АЭР-антипортер, фосфатный, ди- и три-карбоксилатный переносчики и др., всего более 30), тогда как для ЫАЭ (Р)Н внутренняя мембрана практически непроницаема. При измерении активности Комплекса I с использованием глутамата и малата в качестве субстратов дыхания помимо исследуемого фермента в процессе участвуют переносчики субстратов, NAD±зависимая малат-дегидрогеназа, трансаминаза, а также терминальный участок дыхательной цепи. Таким образом, при измерении дыхания митохондрий нельзя быть уверенным, что именно работа Комплекса I является скорость-лимитирующим процессом.

Существуют и другие приемы преодоления непроницаемости внутренней митохондриальной мембраны при измерении активности матриксных и мембранных ферментов: растворение мембран при помощи детергентов, а также разрушение мембранных препаратов под действием осмотического шока, озвучивания или замораживания/оттаивания. Все эти методы делают доступным матриксное содержимое митохондрий, однако, при такой обработке значительно повреждается нативная структура мембран. Следовательно, изменяется локальное окружение ферментов внутренней мембраны митохондрий, что может повлиять на их активность. Помимо этого значительные повреждения структуры мембран могут привести к диссоциации крупных белковых комплексов, особенно примыкающих к мембране или погруженных в нее. Очевидно, что для количественной характеристики ферментов матрикса или внутренней мембраны митохондрий желательно обеспечить свободную проницаемость мембран для субстратов этих ферментов, не разрушая при этом самих мембран. Одним из возможных приемов может быть использование для этой цели каналообразующих веществ.

Аламетищш как инструмент для изучения внутримитохондрштьпых ферментов.

Аламетицин (антибиотик U 22 324) — природный продукт жизнедеятельности гриба Trichoderma viride, впервые выделенный в 1967 г. [Reusser, 1967]. Аламетицин — пептид, состоящий из 20 аминокислот: Ас-Меа-Pro-Mea-Ala-Mea-Ala-GIn-Mea-Val-Mea-Gly-Leu-Mea-Pro-Val-Mea-Mea-Glu-(Pheol)-GlnOH, где Mea — а-метилаланин (=Aib, альфа-аминоизомасляная кислота), Pheol — фенилаланинол (2-амино-3-фенил-1-пропанол) [Martin and Williams, 1976]. Аламетицин относится к семейству пептидов, называемых пептаиболами (peptaibols) из-за большого количества остатков альфа-аминоизомасляной кислоты (Aib) и восстановленного С-конца молекулы (-ол) [Jacob and Cafiso, 1997]. К этому же семейству антибиотиков относятся зервамицин, сузукацилин, трихотоксин и др. [Mathew and Balaram, 1983].

При малых концентрациях аламетицин образует потенциал-зависимые поры в бислойных липидных мембранах. В составе молекулы выделяют а-спиральные участки, которыми богат С-конец молекулы, ответственные за встраивание аламетицина в мембрану. 13 Остатков на N-конце молекулы обеспечивают транспорт ионов и разобщение фосфорилирования в митохондриях [Mathew and Balaram, 1983].

Проводимость канала зависит от концентрации аламетицина, липидного состава мембраны, ее толщины, температуры и величины мембранного потенциала [Vodyanoy et al., 1982]. Каналы, образуемые аламетицином, обладают катионной селективностью, однако пропускают и анионы. Предполагалось, что катионы могут вступать в электро-статические взаимодействия с отрицательным зарядом на С-конце молекулы, что обеспечивает их предпочтительное пропускание. Показано, что замена Glu-18 на Lys приводит к инверсии ион-селективности [Starostin et al., 1999]. Это указывает на участие отрицательного заряда на Glu-18 в катионной селективности аламетицина.

Другими авторами [Kaduk et al., 1998] было показано, что Pro-14 и Gly-11 участвуют в формировании структуры, необходимой для правильной ориентации аламетицина в мембране. Теми же авторами было показано, что Gln-7 стабилизирует а-спиральную структуру за счет образования внутримолекулярных водородных связей.

Различными исследователями были предложены 2 гипотезы о строении аламетицинового канала. Гордон и Хэйдон в 1974 г предположили, что аламетицин образует в мембране поры стандартного диаметра, которые открываются и закрываются статистически. Однако, эта модель впоследствии не получила подтверждения. Большинство накопленных результатов говорит в пользу гипотезы, высказанной примерно в то же время Бауманом и Мюллером и Бохаимом. Их гипотеза строения аламетицинового канала получила название модели & laquo-бочонка»- («barrel stave model»). По этой гипотезе пора, образованная аламетицином, может увеличиваться в диаметре за счет добавления в нее новых молекул аламетицина. Таким образом, канал собирается из молекул аламетицина, как бочонок из дощечек. Каждому состоянию канала соответствует определенное количество мономеров в кольце. Однако остается неясным механизм встраивания аламетицина в мембрану. По одной из версий мономеры аламетицина сначала пронизывают мембрану насквозь, а затем за счет латеральной диффузии собираются в канал. По другой версии мономеры собираются на поверхности мембраны в агрегаты — предпоры, которые в результате конформационных изменений и образуют ионный канал [Ермишкин, Зильберштейн, 1982].

Аламетицин образует в липидном бислое и биологических мембранах олигомерные каналы с несколькими некратными уровнями проводимости. Отдельный канал всегда включается и выключается через уровень с наименьшей проводимостью и совершает & laquo-случайные блуждания по состояниям разной проводимости& raquo- [Ермишкин и др., 1988].

В работе Ханке и Бохаима было показано, что уровень с наименьшей проводимостью канала пропускает мелкие ионы (К+), но не пропускает более крупные (Са+, СГ, Tris+, Hepes") [Hanke and Boheim, 1980]. Канал, обладающий проводимостью следующего уровня, пропускает не только ионы К+, но и ионы Tris+ и Hepes". Авторы полагают, что минимальное количество субъединиц в канале соответствует 3. Каждый последующий мономер аламетицина, встраиваясь, увеличивает величину окружности поры на 0,66 нм [Hanke and Boheim, 1980].

Водяной и соавт. [Vodyanoy et al., 1982] установили, что препараты аламетицина гетерогенны. Например, действие аламетицина фракции 4 на искусственную бимолекулярную липидную мембрану зависит от потенциала на ней. Аламетицин фракции 6 способен образовывать каналы в различных по составу липидных мембранах даже при отсутствии напряжения на них.

Аламетицин был использован различными исследователями для определения активностей ферментов, заключенных в мембранные структуры -митохондрии, эритроциты, тромбоциты, мембраны саркоплазматического ретикулума и эндоплазматического ретикулума мозга. Таким образом были получены данные об активностях латентной (Na+, К+)-АТР-азы, аденилатциклазы, сАМР-зависимой протеинкиназы [Jones et al., 1980] и Са+ -зависимой АТР-азы [Ritov et al., 1992]. На митохондриях было показано, что и аламетицин повышает скорость сукцинат-оксидазной реакции, вероятно, увеличивая проницаемость мембраны для протонов [Ritov et al., 1992].

Ритовым и соавт. [Ritov et al., 1992] было показано, что количество аламетицина, необходимое для формирования канала, сильно зависит от типа мембраны. Так, мембраны эритроцитов кролика, плазматические мембраны тромбоцитов человека и плазматические мембраны микросомальной фракции мозгов крысы становятся проницаемыми для ионов при высоких концентрациях аламетицина — 25−80 мкг/мл. А мембраны эндоплазматического ретикулума мозга крысы, саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика и митохондрий печени крысы теряют свои барьерные функции при гораздо меньших концентрациях аламетицина — 3−7 мкг/мл. Авторы работы предполагают, что различная чувствительность мембран к аламетицину обусловлена значительно большим содержанием холестерина в плазматических мембранах, чем во внутриклеточных.

Препараты Комплекса I и катализируемые ими реакции.

NADH: убихинон- оксидоредуктаза (Комплекс I) — первый из переносящих электроны ферментов в дыхательной цепи митохондрий. Структура [Виноградов, 2001- Гривеникова, Виноградов, 2003], каталитические свойства [Виноградов и др., 1999- Гривеникова, Виноградов, 2003] и гипотетические представления о механизме сопряжения в Комплексе I [Vinogradov, 1993, Виноградов, 2001] достаточно подробно рассмотрены в указанных обзорах. В связи с этим здесь будут кратко описаны только те сведения, которые необходимы для понимания предмета исследования и результатов проделанной работы.

Передача двух электоронов от NADH к хинону сопряжена с транслокацией 4 протонов через мембрану [Wikstrom, 1984- Galkin et al., 1999- Галкин и др., 2001]. В связи с чрезвычайной сложностью строения и функционирования NADH: убихинон-оксидоредуктазы до сих пор остается невыясненным механизм реакций, происходящих внутри этой гигантской молекулярной машины. Изучение Комплекса I осложняется наличием в его составе большого числа субъединиц (по последним данным не менее 45) и кофакторов (FMN, 7−8 железо-серных кластеров, прочносвязанные убихиноны), белок — липидными взаимодействиями, а также многообразием возможных катализируемых реакций. Различными исследовательскими группами были получены препараты изолированного фермента, отличающиеся по субъединичному составу, катализируемым реакциям, а также по чувствительности к ингибиторам. Во многом свойства конкретного препарата фермента определяются наличием или отсутствием сопряженной или разобщенной митохондриальной мембраны, в нативном состоянии играющей важную роль в стабилизации структуры Комплекса I дыхательной цепи.

В 60-х годах прошлого века в лаборатории Хатефи был получен препарат фермента, очистка которого от других компонентов дыхательной цепи проводилась после обработки мембран солями желчных кислот. [Hatefi et al., 1967] Этот препарат загрязнен примесями других белков (Комплексы III и IV дыхательной цепи), однако катализирует NADH: убихинон-оксидоредуктазную реакцию с удельной активностью, свидетельствующей о его очистке по сравнению с исходным препаратом, и был чувствителен к специфическим ингибиторам (ротенон). После обработки перхлоратом натрия такой препарат можно разделить на 3 фракции: HP (Hydrofobic protein), IP (Iron-sulfur protein), и FP (Flavo-protein). [Galante and Hatefi, 1979] Единственным фрагментом, обладающим каталитической активностью, является FP, имеющий в своем составе FMN и два железо-серных кластера. Этот фрагмент способен осуществлять окисление NADH искусственными акцепторами электронов (отличными от растворенного в мембране убихинона — коэнзима Qi0). Вследствие гидрофобности природного убихинона принято считать, что его связывание происходит в липофилыюй части Комплекса I, погруженной в мембрану. Искусственные акцепторы электронов (гексааминорутений (III), феррицианид) могут взаимодействовать с гидрофильной частью фермента и перехватывать электроны на более ранних стадиях их переноса внутри белковой молекулы. По данным нашей лаборатории гексааминорутений является наиболее удобным искусственным акцептором электронов при оценке удельной активности фермента [Sled and Vinogradov, 1992- Gavrikova et al., 1995]. В отличие от реакции с феррицианидом перенос электронов на гексааминорутений не ингибируется избытком субстрата, спектр гексааминорутения не перекрывается со спектром NADH, а неэнзиматическая реакция между субстратом и акцептором практически отсутствует. Вообще перенос электронов от NADH на искусственные акцепторы является характерной реакцией, позволяющей судить о наличии или отсутствии каталитической активности конкретного препарата Комплекса I, так как осуществляется и минимальным набором субъединиц (фрагмент FP), и препаратами фермента в составе сложных белок — липидных комплексов (встроенный в протолипосомы очищенный фермент, препараты субмитохондриальных частиц и нативных митохондрий). Эта реакция не сопровождается транслокацией протонов через мембрану и не чувствительна к ротенону и пиерицидину — ингибиторам, препятствующим взаимодействию Комплекса I и убихинона. В качестве искусственных акцепторов электронов также можно рассматривать гомологи и аналоги природного убихинона (Q0, Qi, Q2, дурохинон, пентил-убихинон, децил-убихинон), цитохром с, кислород. При одноэлектронном восстановлении кислорода Комплексом I происходит образование супероксид-радикала, приводящего к появлению в клетке перекиси водорода и гидроксид-радикала (активные формы кислорода, АФК). В свою очередь АФК могут приводить к различным нарушениям в клетке и развитию некоторых заболеваний, в связи с чем привлекают в последнее время повышенный интерес исследователей. Общепринято, что Комплекс I является главным генератором АФК в митохондриях [Finkel, 2005, и др. ], однако недавно эта точка зрения была подвергнута экспериментально обоснованной критике [Гривенникова, Виноградов, 2005- Grivennikova and Vinogradov, 2006].

Другим удобным для изучения процессов катализа, осуществляемых Комплексом I, является препарат вывернутых субмитохондриальных частиц

СМЧ). В таком препарате фермент находится в окружении, приближенном к нативному, и кроме того его активный центр доступен для добляемых извне соединений. Если СМЧ прочно сопряжены, можно наблюдать как прямой перенос электронов от NADH к убихинону, так и обратный процесс, поддерживаемый наличием трансмембранной разности потенциалов, создаваемой другими компонентами дыхательной цепи (Комплекс V (F0F|-АТРаза) или Комплексы III и IV (сукцинатоксидазная реакция)). При измерении обратного переноса электронов сукцинатдегидрогеназа поставляет убихинол, а в качестве конечного субстрата служат добавленные извне NAD+ или искусственные акцепторы электронов. В системе, где потенциал на мембране создается FoFi-АТРазой, реакция протекает в присутствии ингибиторов конечного участка дыхательной цепи и АТР (так называемое АТР-зависимое восстановление NAD+ сукцинатом). При другой постановке опытов сукцинатоксидазная реакция обеспечивает как образование трансмембранного потенциала, так и восстановление убихинона до убихинола — субстрата для восстановления NAD+ (так называемое аэробное восстановление NAD+, поддерживаемое окислением сукцината) (см. обзор [Виноградов и др., 1999] и ссылки в нем).

Структура фермента

На сегодняшний день Комплекс I — один из самых больших известных мембранных белковых комплексов. Его & laquo-упрощенная»- версия — бактериальный фермент (NDH-1) — состоит из 14 субъединиц и имеет молекулярную массу -550 кДа, тогда как митохондриальный Комплекс I состоит из 45 субъединиц (~1 млн. Да). Гомологи всех субъединиц, а также все кофакторы бактериального фермента присутствуют и в более сложно организованном митохондриальном Комплексе I, структура которого изучена гораздо менее детально. Семь из 14 субъединиц бактериального фермента образуют периферический домен, выступающий в цитоплазму и содержащий в своем составе нековалентно связанный FMN, железо-серные кластеры, а также

NADH-связывающие участки. Остальные 7 субъединиц гидрофобны, образуют 54 трансмембранных a-спирали, и, вероятно, участвуют в процессе транслокации протонов. Аналоги семи гидрофобных бактериальных субъединиц у эукариот (ND1 — ND6 и ND4L) кодируются митохондриальным геномом, тогда как остальные субъединицы — ядерным.

В дополнение к 14 субъединицам, представленным в бактериальном Комплексе I, митохондриальный фермент эукариот содержит еще около 30 & laquo-добавочных»- субъединиц, кодируемых ядерным геномом. Функция большинства из этих субъединиц до сих пор не выяснена. Одна из субъединиц (SDAP) обладает высокой степенью гомологии с ацил-переносящими белками (АСР — Acyl-Carrier Protein) бактерий и хлоропластов и содержит в своем составе фосфопантотеновую кислоту [Runswick et al., 1991- Sackmann et al., 1991]. Существуют данные о том, что белок SDAP (АСР) принимает участие в синтезе жирных кислот de novo в митохондриальном матриксе [Brody and Mickolajczyk, 1988- Mickolajczyk and Brody, 1990- Zensen et al., 1992- Schneider et al., 1995]. Недавно было показано, что большая часть белка SDAP находится в растворимой фракции внутримитохондриальных белков, а не в составе Комплекса I [Cronan et al., 2005]. Однако это не исключает возможности участия (Комплекс 1)-связанной SDAP во внутримитохондриальном синтезе жирных кислот.

Другая & laquo-добавочная»- субъединица — В 16.6 — является продуктом гена, отвечающего за апоптоз (белок GRIM 19 — Gene associated with Retinoid Interferon-induced Mortality). Можно предположить, что эта субъединица осуществляет связь между дыхательной цепью митохондрий и сигнальными путями, ведущими к клеточной гибели [Fearnley et al, 2001]. Еще одна субъединица — В 14.7 — обладает гомологией с белками семейства TIM, участвующими в переносе полипептидов через внутреннюю мембрану митохондрий. Возможно, эта субъединица участвует во встраивании 13 остальных субъединиц Комплекса I, относящихся к группе В (В8, В9, В12, В13, В14, В 14. 5а, В14. 5Ь, В15, В 16. 6, В17, В 17. 2, В18, В22), кодируемых ядерным геномом, и не имеющих в своем составе сигнальных последовательностей, но имеющим модифицированный N-концевой остаток аминокислоты [Carroll et al., 2002].

Впервые информация о пространственном строении Комплекса I из сердца быка была получена при анализе двухмерных мембранных кристаллов [Boekema et al., 1984]. Исследователи получили картину комплексов из 4-х мономеров, организованных в пару димеров. Однако в дальнейшем выяснилось, что эти тетрамерные кристаллы были сформированы лишь фрагментами Комплекса I дыхательной цепи [Leonard et al., 1987]. Позднее анализ двухмерных мембранных кристаллов препарата из Neurospora crassa привел к выявлению характерной L-образной формы фермента (см. рис. 1) [Hofhaus et al., 1991], которая в дальнейшем воспроизводилась в экспериментах с помощью негативного контрастирования и электронной криомикроскопии препарата.

Рис. 1. L-образная форма Комплекса I [Friedrich, 1998]. Черным цветом показан гидрофобный, а серым — гидрофильный домены фермента Escherichia coli. Сеткой обозначено расположение добавочных субъединиц фермента Neurospora crassa. Наибольшее различие между прокариотическим и эукариотическим ферментами наблюдается в мембранной части фермента, хотя некоторые добавочные субъединицы присутствуют и в периферическом домене, особенно на границе между гидрофобной и гидрофильной частью фермента

Каждая из перечисленных методик имеет свои преимущества и недостатки. Например, при анализе изображений, полученных при помощи негативного контрастирования, могут возникать искажения, связанные с неравномерным прокрашиванием и уплощением анализируемых белковых частиц [Friedrich and Bottcher, 2004]. Недавно в группе Фридриха было сделано предположение, что L-образная форма — лишь одна из по меньшей мере двух возможных стабильных конформаций фермента. При низкой ионной силе выделенный препарат фермента из Escherichia coli, а также фермент, реконструированный в липосомы, может принимать форму, напоминающую подкову, где оба домена располагаются & laquo-бок о бок& raquo-, а не под прямым углом. Авторы исследования предполагают, что именно эта, а не L-образная конформация фермента является каталитически активной [Bottcher et al., 2002]. Однако до сих пор большинство исследователей придерживается гипотезы об L-образной структурной организации фермента.

Интересным является тот факт, что митохондриальный и бактериальный ферменты имеют приблизительно одинаковые линейные размеры (см. рис. 1). Бактериальный фермент лишь слегка короче митохондриалыюго, несмотря на то, что его молекулярная масса почти в 2 раза меньше. & laquo-Добавочные»- субъединицы митохондриального Комплекса I равномерно распределены по всей поверхности фермента, как бы окружая каталитическую & laquo-сердцевину»-, имеющую высокую степень гомологии с бактериальным ферментом. На некоторых препаратах Комплекса I митохондрий сердца быка видно сильное сужение в мембранном домене, а на некоторых — наличие узкой перемычки между мембранным и периферическим доменами шириной всего 3 нм. Неизвестно, является ли данная черта отображением реальной картины структурной организации комплекса или всего лишь артефактом, возникающим при выделении и окрашивании препарата. [Guenebaut et al., 1998]

Недавно Сазанов и Хинчлифф расшифровали атомную структуру (с разрешением 3,3 A) периферического домена Комплекса I из Thermus thermophilics, показывающую структурную организацию полипептидных цепей и расположение кофакторов внутри белковой глобулы [Hinchliffe and Sazanov, 2005- Sazanov and Hinchliffe, 2006]. В целом периферический домен Комплекса I из Т. thermophilic представляет собой Y-образную структуру (~140×75A), нижняя часть которой образует область контакта с мембранным доменом. Левая ветвь периферического домена образована субъединицами Nqol и Nqo2 (51 кДа и 24 кДа субъединицы у млекопитающих), правая ветвь -субъединицей Nqo3 (75 кДа субъединица у млекопитающих), а нижняя часть -субъединицами Nqo4, Nqo5, Nqo6 и Nqo9 (49 кДа, 30 кДа, PSST и TYKY соответственно). В средней части Y-образной молекулы исследователи обнаружили еще одну небольшую субъединицу, не известную ранее, — Nqol5, вероятно, стабилизирующую белковую конструкцию в этом узком & laquo-перешейке»-.

Рис. 2. Структура периферического домена Комплекса I из Thermus thermophilus [Sazanov and Hinchliffe, 2006]. (А) Вид сбоку, гидрофобный домен предположительно располагается ниже, в направлении спирали HI. Каждая субъединица окрашена в индивидуальный цвет. Фиолетовыми сферами обозначен FMN, красные сферы — атомы Fe, желтые — S. Возможный участок связывания Q отмечен стрелкой. (В) Расположение редокс-центров внутри молекулы. Основной путь переноса электронов показан голубыми стрелками. Расстояние между центрами кластеров и от края до края (цифры в скобках) указаны в А

Комплексы I бактерий Т. thermophilic, E. coli и некоторых других содержат 2 двухъядерных (Nia и Nib) и 7 тетраядерных Fe-S-кластеров (N2-N5, N6a, N6b и N7). В митохондриальном Комплексе I отсутствует участок связывания тетраядерного кластера N7, таким образом, он содержит 2 двухъядерных и 6 тетраядерных Fe-S-кластеров. Один двухъядерный и 6 тетраядерных кластеров образуют цепь передачи электронов: FMN N3 -" Nib -" N4 -> N5 -> N6a -" N6b -> N2 -> хинон (убихинон у млекопитающих и менахинон у Т. thermophilic). Кластеры Nia и N7 Т. thermophilic (т.е. в митохондриальном Комплексе I — только Nia) находятся на расстоянии > 20A от остальных кластеров, что делает невозможным передачу электронов между ними. Возможно, кластер N7 является эволюционным атавизмом, сохранившимся лишь у некоторых организмов и не играющим значимой роли в функционировании фермента, или же он необходим для правильной укладки субъединицы Nqo3, не содержащей других железо-серных кластеров в своем обширном С-концевом домене. Двухъядерный кластер Nia, по предположению авторов исследования, выполняет роль антиоксиданта для находящегося в непосредственной близости от него FMN. После двухэлекторонного восстановления флавина и передачи одного из электронов в цепь железосерных кластеров кофактор на некоторое время остается в неустойчивом состоянии флавосемихинона, способного продуцировать активные формы кислорода. Возможно, что при стационарном окислении NADH, когда все железо-серные кластеры восстановлены, а скорость реакции лимитирована на уровне передачи электронов на хинон, второй из полученных флавином электронов временно переходит на кластер Nia, чтобы потом опять через FMN попасть на основной путь переноса. Так как флавин доступен для растворителя, а кластер Nia экранирован пептидными цепями, временное хранение электронов на & laquo-запасном»- Fe-S-кластере может снизить количество генерируемых АФК. Значения редокс потенциалов одно-электронного переноса для кофакторов составляют: -300 мВ (РМЫНг/флавосемихинон), -390 мВ (флавосемихинон/окисленный флавин), -250 мВ (кластер N3) и -370 мВ кластер Nla). Таким образом, передача электронов с флавосемихинона на кластер Nla является термодинамически выгодной, тогда как полностью восстановленный FMNH2 может передавать электроны только в основную цепь переноса, то есть на кластер N3 [Sazanov and Hinchliffe, 2006].

До сих пор детальная картина структурной организации митохондриального Комплекса I млекопитающих не получена. Известно только то, что субъединицы 75, 51, 49, 30, 24, 18 и 13 кДа, а также TYKY, PSST, SDAP, В15, В 14. 5а, В14 и В13 принадлежат гидрофильному фрагменту (la), ND1, ND2, ND3 и ND4L, PFFD, KFYI и 39 кДа субъединицы относятся к гидрофобному фрагменту (ly), a ND4, ND5, PDSW, В22, В17, ASHI, В18, SGDH, В15, AGGG, MNLL — также гидрофобному фрагменту (1Р). [Sazanov et al., 2000] Перечисленные фрагменты (la, 1(3 и ly) были получены в лаборатории Уокера после солюбилизации митохондриальных мембран лаурилмальтозидом, последующего хроматографического фракционирования белков, а затем обработки изолированного Комплекса I другим детергентом -N, Ы-диметил-додециламин-Ы-оксидом. Фрагмент la катализирует КАОН: феррицианид-редуктазную реакцию и содержит почти все редокс-центры полноразмерного фермента, тогда как 1р и 1у не обладают каталитическими активностями и представляют собой, вероятно, фрагменты мембранного домена Комплекса I [Finel et al., 1992].

Недавно в нашей лаборатории была предложена гипотеза существования в Комплексе I двух участков связывания пиридиннуклеотидов, F и R, первый из которых имеет повышенное сродство к NADH, а второй — к окисленному NAD+. Таким образом, участок F функционирует, в основном, при прямом переносе электронов, a R — при обратном. Кроме того, с участком R, вероятно, взаимодействуют феррицианид и кислород, тогда как гексааминорутений взаимодействует с Комплексом I с другим редокс-компонентом [Гривенникова, Виноградов, 2005- Grivennikova and Vinogradov, 2006]. Указания на существование двух различных мест связывания пиридиннуклеотидов и частично различающихся путей переноса электронов в прямой и обратной реакции были получены значительно ранее в нескольких независимых исследованиях. Например, известно, что сродство Комплекса I к NAD+ как субстрату обратного переноса электронов значительно выше, чем как к ингибитору прямой реакции. В то же время насыщение фермента субстратом прямой реакции NADH происходит при концентрациях, значительно более низких, чем те, что необходимы для ингибирования обратного переноса [Виноградов и др., 1999]. Также в нашей лаборатории были получены данные об & laquo-одностороннем»- действии некоторых ингибиторов Комплекса I: ADP-рибозы, Тритона Х-100, ротенона и лаурилсульфата. Так, ADP-рибоза [Zharova and Vinogradov, 1997] влияет только на прямой перенос электоронов, ротенон [Grivennikova et al., 1997] и Тритон Х-100 [Ushakova et al., 1999] в большей степени ингибируют прямой, а лаурил-сульфат [Grivennikova et al., 2003] -обратный перенос электоронов в концентрациях, не приводящих к разобщению мембраны или ингибированию сукцинатдегидрогеназы.

Существуют и другие указания на возможность существования двух центров связывания нуклеотидов. Так кинетические исследования ЫАОН: ацетилпиридин-ЫАО± трансгидрогеназной реакции, осуществляемой Комплексом I, показали, что реакция частично протекает по механизму с образованием тройного комплекса, а, следовательно, возможно одновременное связывание ферментом обоих субстратов в различных центрах [Zakharova et al., 1999].

В работе Хинчлиффа и Сазанова [Hinchliffe and Sazanov, 2005] по изучению структуры периферического домена Комплекса I из бактерии Thermus thermophilus была получена картина распределения электронной плотности, показывающая наличие трех углублений на поверхности молекулы, соответствующих, вероятно, участкам связывания субстратов. Два из них расположены на расстоянии 10 и 15А, соответственно, от первого из железосерных кластеров (N3), передающих электроны по цепи. Возможно, эти два углубления на поверхности белкового комплекса являются участками связывания NADH. Третий из упомянутых участков представляет собой небольшое углубление на обращенной к мембране части периферического домена. Этот участок, вероятно, является местом связывания убихинона, так как находится на расстоянии ~10А от последнего в цепи передачи электронов железо-серного кластера (N2) [Hinchliffe and Sazanov, 2005]. Подтверждение кинетических данных результатами структурных исследований было бы сильным аргументом в пользу гипотезы о существования двух участков связывания пиридиннуклеотидов на поверхности Комплекса I, однако в недавней работе по изучению структуры фермента авторы не получили этому подтверждения [Sazanov and Hinchliffe, 2006]. Возможно, что участки связывания субстратов Комплекса I бактерии Thermus thermophilus устроены иначе, чем у фермента млекопитающих.

Гистерезисное поведение Комплекса I а) Открытие и феноменология

Начиная с 1950 г., рядом исследователей бало замечено, что окисление NADH внутренними митохондриальными мембранами происходит с выраженной лаг-фазой, которая увеличивается после прогревания препарата [Slater, 1950- Morrison and King, 1962- Minakami et al., 1964]. Позднее в лаборатории Лузикова была предложена гипотеза существования митохондриальной дыхательной цепи в двух состояниях — активном и неактивном, соотношение между которыми зависит от скорости переноса электронов [Luzikov and Romashina, 1972- Saks et al., 1972]. В дальнейшем в нашей лаборатории была сформулирована модель существования двух форм Комплекса I — А (активной) и D (деактивированной). Активная форма фермента катализирует ЫАОН: убихинон-оксидоредуктазную реакцию с постоянной во времени скоростью, тогда как деактивированная форма сама по себе вообще не катализирует эту реакцию. После инкубации деактивированного препарата Комплекса I с субстратом реакции — NADH — фермент медленно переходит в активную форму (0-> А-переход), что на кривой регистрации выглядит, как выраженная лаг-фаза, после которой скорость реакции становится постоянной.

Переход из активной в деактивированную форму (A-^D-переход) происходит спонтанно и очень сильно зависит от температуры, что указывает на сопряженность процесса со значительными конформационными перестройками внутри белковой глобулы. В нашей лаборатории была предложена модель, связывающая деактивацию фермента с освобождением прочносвязанных убисемихинонов. Согласно этой модели во время активации фермента формируется специфический участок связывания убисемихинонов, а в отсутствие потока электронов убисемихиноны дисмутируют, и фермент теряет приобретенную активную конформацию. [Виноградов и др., 1999] В отличие от спонтанной деактивации редокс-зависимая активация чувствительна к ряду факторов, таких как рН и присутствие ионов двухвалентных металлов [Kotlyar, et al., 1992].

Изначально деактивация Комплекса I была описана как необратимый процесс. Однако позже выяснилось, что деактивированный препарат фермента сохраняет некоторую остаточную активность, следовательно, между двумя формами существует равновесие. На данный момент единственным соединением, влияющим на установление этого равновесия, является ротенон -специфический ингибитор Комплекса I дыхательной цепи. Активная форма связывает ротенон с гораздо большим сродством, чем деактивированная, при этом связывание ингибитора приводит к защите фермента от деактивации. [Grivennikova et al., 1997]

Существование А< ->0-перехода в Комплексе I млекопитающих было показано на препаратах различной степени очистки: выделенный Комплекс I [Маклашина и др., 1994], фермент в составе СМЧ [Kotlyar et al., 1990], митохондрий [Grivennikova et al., 2001], и даже в экспериментах ex vivo на интактном перфузируемом сердце крысы [Maklashina et al., 2002]. Кроме того, существование данного явления было показано на препаратах Комплекса I из других позвоночных и беспозвоночных животных [Maklashina et al., 2003], а также грибов (N. crassa и Yarroma lipolytica) [Grivennikova et al., 2003a- Maklashina et al., 2003- Ushakova, 2005], тогда как у бактерий (Paracoccus denitrificans и Rhodobacter capsulatus) AoD-переход не обнаружен [Kotlyar et al., 1998- Grivennikova et al., 2003a- Grivennikova et al., 2003b]. Вероятно, существование данного явления обеспечивается наличием & laquo-добавочных»- субъединиц в Комплексе I эукариот.

Практически все препараты Комплекса I млекопитающих представляют собой смесь А- и D-форм фермента, в связи с чем в нашей лаборатории разработан ряд методических приемов для получения препаратов, пригодных для стандартного кинетического анализа. Активация фермента происходит после преинкубации с субстратами реакции (препарат следует хранить на холоде). Наоборот, предотвращения активации фермента можно достигнуть после защелачивания среды, добавления ионов двухвалентных металлов, а также SH-модификаторов (см. ниже). б) & laquo-Появление»- реакционноспособных SH-групп

Одним из характерных свойств деактивированного Комплекса I является его чувствительность к SH-реагентам (рис. 3). Общее количество SH-rpynn, модифицируемых в препарате СМЧ при помощи реактива Эллмана, составляет ~16±1 нмоль на 1 мг белка (без использования детергентов). Однако в активированном препарате фермента связывание этих групп с SH-реагентами не приводит к потере активности [Gavrikova and Vinogradov, 1999].

Ме2+, ОН

NADH + Q

SH

NAD +ОН2 + ДцН 4 D

SR

Рис. 3. Медленный AoD-переход митохондриального Комплекса I. Активная форма фермента (А) катализирует быструю ЫАОН: убихинон-оксидоредуктазную реакцию, сопровождающуюся переносом четырех протонов из матрикса в межмембранное пространство митохондрий. При высокой температуре (> 30°) А-форма превращается в D-форму. Активация D-формы Комплекса I происходит в результате окисления NADH убихиноном, скорость активации сильно уменьшается при щелочных значениях рН, в особенности в присутствии ионов двухвалентных металлов. Только D-форма необратимо модифицируется SH-реагентами ®, что сопровождается ингибированием фермента

Впервые появление чувствительности фермента к SH-модификаторам после прогревания отметили в лаборатории Эстабрука [Minakami et al., 1964- Estabrook et al., 1968] Было замечено, что N-этилмалеимид и п-хлормеркурибензоат ингибируют NADHiQp и ЫА1) Н: цитохром с-оксидоредуктазные реакции, в то время как передача электронов на искусственные акцепторы, такие как феррицианид, не блокируется SH-модификаторами. Во время описанных исследований еще не было известно о существовании А- и D-форм фермента, и эта работа не получила дальнейшего развития. Действительно, намного позднее в нашей лаборатории было показано, что NADH: феррицианид-редуктазная реакция в отличие от NADH: Qr и NADH: цитохром с-оксидоредуктазных реакций не зависит от перехода между активной и деактивированной формами фермента и, следовательно, от присутствия SH-соединений [Gavrikova and Vinogradov,

1999].

Изменение реакционноспособности SH-групп в Комплексе I при прогревании было отмечено в работе Кремоны и Кеарни [Cremona and Kearney, 1965]. В их экспериментах NEM и соединения ртути реагировали с растворимой формой Комплекса I достаточно быстро даже на холоде, однако такая модификация не приводила к потере активности фермента. При повышении температуры до 30& deg-С фермент необратимо инактивировался. Авторы предположили существование конформационных переходов в белке, происходящих из-за встраивания ингибитора вне активного центра фермента. Однако авторы использовали препарат так называемой высокомолекулярной NADH-дегидрогеназы, а активность фермента измеряли по NADH: феррицианид-редуктазной реакции. Вероятно, наблюдаемый авторами эффект температурной инактивации фермента в присутствии SH-реагентов был связан с низкой стабильностью использованного препарата. в) Установление локализации SH-групп, принимающих участие в A < ->D-nepexode

Показано, что в деактивированном препарате Комплекса I флуоресцирующий аналог NEM связывается с SH-группой субъединицы с низкой молекулярной массой (-15 кДа). Однако идентифицировать эту субъединицу пока не удалось. Возможными кандидатами на роль этой субъединицы являются IP-15 и В 14.7. В бактериальных ферментах, у которых A-f-^D-переход отсутствует, нет и гомологов субъединиц IP-15 и В 14.7. С другой стороны, в состав фермента из N. crassa, для которого показано существование AoD-перехода, входят субъединицы, гомологичные IP-15 и В 14.7 [Персональное сообщение д-ра А. Видейры, Португалия- Carroll et al., 2002].

Возможные способы регулирования фермента in vivo

Папой и соавт. было показано, что под действием холерного токсина происходит сАМР-зависимое фосфорилирование 18-кДа субъединицы Комплекса I. Авторы установили, что эта субъединица — AQDQ, кодируемая ядерным геномом [Papa et al., 1996]. Фосфорилирование in vivo, индуцированное обработкой фибробластов холерным токсином, сопровождалось 2−3-кратным увеличением активности ротенон-чувствительной NADH-оксидазы, а также ЫАОН: убихинон-оксидоредуктазы. Авторы предполагают, что с AMP является природным регулятором активности Комплекса I, и, следовательно, уровня митохондриалыюго дыхания и синтеза АТР в целом. [Scacco et al., 2000] Позднее в лаборатории Уокера на препарате митохондрий и СМЧ сердца быка было показано, что фосфорилированию подвергаются субъединицы 18 (ESSS) и 6 (MWFE) кДа, но не AQDQ. Авторы считают, что в исследованиях в лаборатории Папы была допущена ошибка при идентификации фосфорилированной 18-кДа субъединицы. [Chen et al., 2004] Однако нельзя исключить, что причиной различия в результатах исследований могут быть значительные различия в постановке экспериментов.

Другим возможным путем регулирования активности ферментов в клетке является взаимодействие с SH-группами белковой глобулы. Одним из внутриклеточных низкомолекулярных SH-содержащих соединений в клетке является глутатион. Со времени обнаружения & laquo-филотиона»- в клетках дрожжей [De Rey-Pailhade, 1888] и установления его точной структуры [Hopkins, 1921- Hopkins, 1929] поискам физиологической роли глутатиона посвящено огромное количество работ. Учитывая почти универсальное распространение этого соединения, а также его высокую концентрацию в тканях животных, растений и микроорганизмов, можно предположить, что его роль в метаболизме значительна и разнообразна. Глутатион представляет собой трипептид (у-глутамил-цистеинил-глицин) и существует в двух формах: восстановленной, GSH, и окисленной, GSSG. По-видимому, он участвует в защите SH-rpynn внутриклеточных ферментов от окисления и блокирования ионами тяжелых металлов и другими ядами. Различные ферменты используют глутатион в качестве кофактора (глиоксалаза, формальдегиддегидрогеназа, цис-транс-изомеразы) или субстрата (глутатион-инсулин-трансгидрогеназа, глутатион-S-трансферазы, глутатион-пероксидаза и др.) [Торчинский, 1977с]. Вероятно, увеличение количества окисленной формы глутатиона в клетке может приводить к модификации некоторых значимых SH-групп, тогда как восстановление уровня GSH — к обратному процессу. Редди и соавт. [Reddy et al., 2000] показали, что активность креатинкиназы ингибируется добавлением окисленного глутатиона и восстанавливается избытком GSH. Авторы предполагают возможную защитную роль глутатиона в процессе ишемического повреждения скелетной и сердечной мышц. Обратимое связывание глутатиона цистеином активного центра креатин-киназы защищает фермент от необратимого окислительного повреждения, а последующее повышение уровня GSH приводит к полному восстановлению активности фермента.

Тэйлор и соавт. [Taylor et al., 2003] исследовали влияние добавленного глутатиона на Комплекс I дыхательной цепи митохондрий. Авторы показали, что под действием окисленного глутатиона происходит обратимая модификация Комплекса I, которая приводит к ингибированию активности фермента и увеличению продукции активных форм кислорода. Среди возможных мест генерации активных форм кислорода авторы называют железосерные кластеры, FMN и участок связывания убихинона. Авторы предполагают, что похожая модификация может иметь место во время развития некоторых патологических состояний (болезни Паркинсона и Хантингтона), для которых показано уменьшение содержания GSH и увеличение продукции супероксид-радикала в митохондриях, а также селективное повреждение Комплекса 1. Супероксид в митохондриях превращается в перекись водорода, которая может проникать через митохондриальную мембрану в цитозоль и запускать дальнейший каскад реакций. Таким образом клетка может реагировать на сигнал об изменении степени окисленности глутатиона в митохондриях. Однако описанный механизм до сих пор остается гипотетическим.

Изучение регулирования активности ферментов в клетке, и, особенно, Комплекса I дыхательной цепи (в связи с особенностями строения и локализации на внутренней мембране митохондрий), представляется нам достаточно сложной задачей. На сегодня обнаружено множество ингибиторов, влияющих на активность фермента, однако большинство из этих соединений -синтетического происхождения. Намного сложнее найти внутриклеточные модификаторы, влияющие на функционирование фермента в физиологических условиях. При изучении Комплекса I эта задача осложняется, как это было указано, существованием барьеров проницаемости для добавленных лигандов.

Реащионноспособность & Н-групп е белках

Сульфгидрильные группы выделяются среди остальных функциональных групп белков своей реакционной способностью и многообразием химических реакций, в которые они вступают: алкилирование, ацилирование, окисление, тиол-дисульфидный обмен и др. Высокая реакционная способность тиоловой группы обусловлена ее относительно высокой кислотностью (рКа~9) по сравнению с СН-, ЫН- и ОН-кислотами (если примыкающие к кислотным центрам радикалы одинаковы или близки по природе), что облегчает ионизацию с образованием реакционной анионной формы. Атом серы обладает достаточно большим размером, что способствует делокализации отрицательного заряда, образующегося после отрыва водорода в виде протона. Это, в свою очередь, приводит к стабилизации образующегося аниона (увеличение локализации заряда на атоме, наоборот, делает его менее стабильным и соответственно более трудно образующимся). [Дженкс, 1972].

Во многих реакциях 8Н-группы принимают участие в форме меркаптидного иона ИЗ& quot-, поэтому для оценки реакционноспособности этих групп в белках важно знать, при каком значении рН происходит их ионизация.

Значения рКа у SH-групп белков варьируют в широких пределах под влиянием различных факторов, например, пространственного расположения по отношению к поверхности белковой глобулы и растворителю, а также электростатического влияния соседних заряженных групп. Наличие положительно заряженной группы в непосредственной близости от SH-группы понижает ее рКа примерно до 8,35 (рКд Р-меркаптоэтиламина), при отсутствии поблизости заряженных групп рКя SH-группы может быть равно 9,5 (как у меркаптоэтанола), а при наличии вблизи отрицательно заряженной группы это значение может возрастать до 10,3 (как у (З-меркаптопропионовой кислоты). Значения рКа SH-групп в активных центрах ферментов обычно варьируют в пределах ~8−9 (папаин, глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа, протеиназа стрептококка, фицин, гистидиндекарбоксилаза бактерий и др.) [Торчинский, 1977а].

Как заметили Шинар и Геллерман [Chinard and Hellerman, 1954], большинство реагентов на различные функциональные группы белка (аминогруппы, ОН-группы, имидазол, гуанидин и др.), за некоторыми исключениями, наиболее быстро взаимодействуют со свободными SH-группами. Различные окислители, например, оиодозобензоат, феррицианид, иодин, нингидрин, в первую очередь реагируют с тиоловыми группами. В мягких условиях окисление происходит с образованием между- и внутримолекулярных дисульфидных связей:

2RSH + Аох -> RSSR + Ared, далее реакция может идти до появления сульфинатов и сульфонатов.

Органические соединения ртути принадлежат к числу достаточно специфичных реагентов на SH-группы белков:

RSH + R’HgX -> RSHgR' + X' + Н+, где X" - анион (хлорид, ацетат или др.). Существуют методики количественного определения SH-групп при помощи органических соединений ртути, где одним из & laquo-классических»- приемов является использование я-хлормеркурибензоата при рН 7,0 [MacDonnell et al., 1951- Boyer, 1954].

Алкилирующие агенты, такие как иодацетат и иодацетамид, взаимодействуют с БН-группами достаточно быстро, но неспецифично [ЫпсИеу, 1960- ГлпсИеу, 1962]:

ЯБН + 1СН2СОО" -> ЯБСНгСОО& quot- + Г + Н+, или

Я8Н + 1СН2СОШ2 -> ЯБСНгСОШг + Г + Н+.

Тиолы обладают способностью присоединяться к поляризованным или легко поляризующимся двойным связям в таких соединениях, как акрилонитрил, акриламид, метилакрилат, малеиновая кислота, Ы-этилимид малеиновой кислоты, винилсульфоны и др. Широкое применение для изучения БН-групп белков получил М-этилимид малеиновой кислоты (Ы-этилмалеимид, ЫЕМ):

Скорость реакции NEM с цистеином и другими тиолами резко возрастает с увеличением рН, но при этом уменьшается и стабильность реагента (щелочной гидролиз имидной связи). Однако взаимодействие NEM с сульфгидрилыюй группой происходит намного быстрее, чем распад реагента, что позволяет использовать его при количественной оценке содержания SH-групп в белках и низкомолекулярных тиолах [Gregory, 1955]. Другой сложностью при использовании NEM является его неспецифичность: при определенных условиях он может модифицировать а-аминогруппы белка, а также остатки лизина и гистидина. Однако в условиях, при которых NEM обычно используется для модификации SH-групп (концентрация ~10'3 М, рН 6−7), алкилирование других функциональных групп практически не происходит [Brewer and Riehm, 1967]. Таким образом, надлежащий выбор условий реакции, в частности проведение ее в отсутствие большого избытка ЫЕМ при нейтральном значении рН, может значительно повысить стабильность и специфичность реагента.

Среди окислителей 8Н-групп особое место занимают дисульфиды, реакция которых с тиолами носит весьма специфический характер. Эта реакция получила название тиол-дисульфидного обмена. Одним из таких соединений является реактив Эллмана — 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота) (ДТНБ) [ЕПтап, 1958- ЕИтап, 1959]: соосоосоосоо

02Ы КБ- +

N0,

Ч/Л /Ч^ ыо2 о2и

КБ-Б Л

Анион нитротиобензоата (ТНБ «), возникающий в этой реакции, является особенно хорошей уходящей группой- заряд на атоме серы у него делокализован вследствие резонанса между анионной и хиноидной структурой:

N0,

N0,

-ООСХ

-ООС.

Это смещает равновесие реакции обмена и обеспечивает стехиометрическое освобождение нитротиобензоата даже при небольшом избытке реагента. Эти особенности нитротиобензоата, а также наличие у него интенсивного поглощения при 412 нм делают реагент Эллмана весьма полезным для количественного определения 8Н-групп. К другим достоинствам ДТНБ относятся его водорастворимость, возможность использования при нейтральных значениях pH, быстрота и специфичность реакции с SH-группами. л

Коэффициент молярной экстинкции ТНБ ~14 ООО при длине волны 412 нм в разбавленных водных растворах (25& deg-С). Оптимальное значение pH для 2 модификации SH-групп ДТНБ — 7,27, при этом значении анион ТНБ «максимально окрашен, а индуцированный ионами ОН& quot- гидролиз ДТНБ -минимален [Riddles etal., 1978].

Однако использование ДТНБ для титрования SH-групп невозможно в следующих системах: а) белки в присутствии низкомолекулярных тиолов- б) окрашенные белки (особенно гемопротеины) со спектром поглощения, покрывающим область 412 нм- в) нерастворимые и денатурированные белки. Баттерворт и соав. [Butterworth et al., 1967] предложили в таких случаях проводить обратное титрование: после реакции с избытком ДТНБ белок освобождают от низкомолекулярных веществ осаждением или хроматографией на колонке с молекулярным фильтром. Количество SH-групп затем определяют по количеству ТНБ2', высвободившемуся после реакции модифицированного белка с восстанавливающим агентом (дитиотреитол или др.).

Для выяснения характера электростатического окружения SH-групп и оценки его влияния на скорость тиол-дисульфидного обмена были синтезированы положительно заряженный и нейтральный аналоги реагента Эллмана: 5,5'-дитиобис-(2-нитро-Ы-триметилбензиламмонийиодид) и 5,5'-дитиобис-(2-нитро-Н-2'-оксиэтилбензамид). Скорость реакции этих аналогов с низкомолекулярными тиолами сильно зависит от заряда последних [Legier, 1975]. Грассетти и Мюррэй [Grassetti and Murray, 1969] описали использование еще одного аналога ДТНБ — 2,2'-дитиобис-(5-нитропиридина) (ДТНП) -специфичного реагента для определения тиолов. При реакции с SH-группами тиол гетероцикла переходит в форму тиона, максимум поглощения при этом смещается в длинноволновую область:

2RSH RSSR H

ДТНП — высокоспецифичный реагент для определения SH-групп. Едиственный его недостаток — нерастворимость в воде и необходимость использовать органические растворители.

Различными исследователями в разное время было замечено, что реакционная способность SH-групп в нативных белках варьирует в широких пределах. Некоторые исследователи выделяют 2 типа SH-групп — & laquo-быстрые»- и & laquo-медленные»- [Butterworth et al., 1967], а некоторые — 3 типа, различающихся по чувствительности к модификаторам [Barron, 1951- Boyer, 1954]. Геллерман и соав. [Hellerman et al., 1943] предложили такую классификацию SH-групп по их реакционноспособности: легко реагирующие, вяло реагирующие и & laquo-замаскированные»-. Естественно, что между различными типами SH-групп не существует резких граней, тем не менее, деление их на типы соответственно их реакционноспособности оказалось полезно и широко используется в литературе.

Например, в Комплексе I дыхательной цепи митохондрий сердца быка Гутманом и соавт. [Gutman et al., 1970] было выявлено 5 типов сульфгидрильных групп, различающихся по реакционноспособности и по возможности модификации в различных препаратах фермента. К использованным в работе препаратам относились низкомолекулярная (< 100 кДа) и высокомолекулярная (> 300 кДа) растворимые формы фермента, связанный с мембраной белок, а также фермент в составе субмитохондриальных частиц. К первому типу (тип I) SH-групп исследователи отнесли быстрореагирующие даже при 0& deg-С сульфгидрильные группы низкомолекулярной формы фермента, их модификация приводит к полной потере ферментативной активности. Второй тип (тип II) тоже реагирует с SH-модификаторами достаточно быстро, однако эта модификация не приводит к потере активности, к тому же сама модификация отрицательно заряженными соединениями ртути блокируется в фосфатном буфере. SH-Группы типа III взаимодействуют с реагентами медленнее, чем предыдущие, но добавление фосфата не влияет на этот процесс. Для модификации этого типа групп необходимо присутствие NADH, после нее происходит полная потеря ферментативной активности. Взаимодействие четвертого типа (тип IV) SH-групп с реагентами приводит к увеличению Кт для феррицианида. Пятый тип SH-групп выявляется только в препарате фермента в составе субмитохондриальных частиц. Модификация этого типа происходит при высоких концентрациях реагентов и нарушает взаимодействие Комплекса I с остальными компонентами дыхательной цепи. Модификация SH-групп типа V и, возможно, типа IV приводит к потере одного или двух участков связывания пиерицидина, А и ротенона. Это выражается в изменении кривой титрования NADH-оксидазной активности этими ингибиторами — сигмоидальная зависимость становится гиперболической.

SH-Группы ферментов, так же как и другие функциональные группы, можно отнести к существенным или несущественным. Существенные в такой классификации — это группы, участвующие либо непосредственно в акте катализа, либо в связывании субстрата, либо в поддержании каталитически активной конформации фермента [Торчинский, 1977Ь]. В нашей лаборатории [Gavrikova and Vinogradov, 1999] было показано наличие такой существенной SH-группы, принимающей участие в конформационных перестройках Комплекса I дыхательной цепи. Эта SH-группа (возможно, что она не единственная) изменяет свою реакционноспособность в зависимости от того, в какой конформации находится белок — активной или деактивированной (см. раздел & laquo-Гистерезисное поведение Комплекса I"). В первом случае эту SH-группу можно назвать & laquo-замаскированной»-, а во втором — легко реагирующей.

Вероятно, в маскировании этой группы принимают участие другие аминокислоты белка, а также липиды внутренней мембраны митохондрий.

Одной из целей нашей работы была разработка простого способа измерения активности и характеристики свойств Комплекса I в интактных митохондриях. Для этого в качестве инструмента мы использовали аламетицин — антибиотик, образующий во внутренней митохондриалыюй мембране поры, достаточные для проникновения низкомолекулярных веществ. Нам представлялось интересным охарактеризовать препарат митохондрий, обработанных этим антибиотиком, чтобы выяснить, насколько сохраняются в этом препарате внутримитохондриальные белки и наружная митохондриальная мембрана.

Вторая цель настоящей работы — установление локализации и выяснение реакционноспособности 8Н-группы, участвующей в конформационных перестройках Комплекса I дыхательной цепи, с помощью аламетицина. Так как ранее была показана различная чувствительность активного и деактивированного препаратов к БН-реагентам, нам представлялось интересным более подробно изучить этот феномен. & laquo-Появление»- и & laquo-маскирование»- определенных групп белка может служить указанием на существование путей регуляции его активности в клетке. Как уже было сказано ранее, одним из возможных внутриклеточных модификаторов БН-групп является глутатион. Однако его роль в регулировании ИАОН: убихинон-оксидоредуктазы до сих пор остается неясной. Для поиска других возможных внутриклеточных модификаторов необходимо определение локализации исследуемой БН-группы относительно митохондриальной мембраны в связи с разделением соединений в клетке по компартментам.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Препаративные методы

Выделение митохондрий сердца быка

Митохондрии сердца быка выделяли по методу Крейна и соавт. [Crane et al., 1956]. Все процедуры проводили на холоду (0−4& deg-С).

Сердца только что забитых животных охлаждали, разрезали на небольшие куски, удаляли соединительную ткать и жир и пропускали через ручную мясорубку. Фарш (~1 кг) промывали 5 раз по 3 литра средой, содержавшей 0,9% КС1, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ Трис-HCl (рН 7,8), и отфильтровывали промывные воды через слой плотной ткани (марли). При промывании суспензии рН среды контролировали и поддерживали добавлением небольших количеств раствора 1 М Трис. Затем фарш промывали средой выделения, содержавшей 0,25 М сахарозу, 15 мМ ЭДТА и 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5). К отжатому фаршу добавляли среду выделения до объема ~4 л, продували 15 мин аргоном и обрабатывали при помощи гомогенизатора «Fisher PowerGen 700» 5 раз по 1 мин со скоростью 4−5 тыс. об. /мин с интервалами в 1 мин при непрерывном продувании суспензии аргоном.

Гомогенат центрифугировали 13 мин при 1600 g (центрифуга & laquo-Весктап»-, ротор JA-10). Супернатант фильтровали, доводили до рН 7,5 раствором 1 М Трис и затем центрифугировали 15 мин при 12 000 g (ротор JA-14). Осадок суспендировали в 350 мл среды, содержавшей 0,25 М сахарозу и 10 мМ Трис-HCl (рН 7,8) в стеклянном гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком и доводили до рН 7,8−7,9 раствором 1 М Трис. Суспензию центрифугировали 10 мин при 17 000 g. Осадок был представлен двумя слоями: нижним, более темным (& laquo-тяжелые»- митохондрии) и верхним, светлым, более рыхлым легкие& raquo- митохондрии). & laquo-Легкую»- фракцию отделяли встряхиванием осадка с добавлением небольших объемов среды, содержавшей 0,25 М сахарозу и 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5). & laquo-Тяжелые»- митохондрии суспендировали в 0,25 М сахарозе и замораживали при -20& deg-С.

Концентрацию белка в суспензии митохондрий определяли с биуретовым реактивом [Gomal et al., 1949].

Получение субмитохондршшышх частиц

Препарат AS-СМЧ получали из фракции & laquo-легких»- митохондрий сердца быка по методу, описанному ранее [Kotlyar and Vinogradov, 1990]. Для этого препарат митохондрий, хранившийся в жидком азоте, размораживали и доводили раствором 0,25 М сахарозы до концентрации белка 33 мг/мл. После этого суспензию разбавляли еще раз, но уже бидистиллированной водой, до конечной концентрации белка 20 мг/мл. Затем добавляли нейтрализованный раствор К±ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ. В течение 20 мин суспензию митохондрий деаэрировали, пропуская аргон, чтобы удалить из среды кислород и избежать процессов перекисного окисления мембран в получаемом препарате. При постоянном перемешивании рН суспензии доводили до значения 8,6 добавлением 1 М NH4OH. С помощью ультразвукового дезинтегратора «Soniprep 150-MSE» препарат митохондрий озвучивали 5 раз по 30 с с перерывами в 1 мин. Процесс озвучивания происходил при 0& deg-С в постоянном токе аргона. Неразрушенные митохондрии отделяли с помощью центрифугирования при 26 000 g в течение 15 мин (центрифуга «Beckman», ротор JA-20, 0& deg-С). Осадок отбрасывали, а супернатант центрифугировали на ультрацентрифуге при 105 000 g в течение 1 ч при 0& deg-С. Супернатант отбрасывали, а полученный осадок суспендировали в ~6 мл буфера, содержавшего 75 мМ сахарозу, 0,25 М КС1, 2 мМ ЭДТА и 30 мМ Трис-S04. Полученную суспензию наносили на колонку с сефадексом G-50 (coarse) и пропускали тот же буфер со скоростью 30 капель/мин при 22& deg-С. В ходе этой процедуры препарат СМЧ освобождается от белкового ингибитора Р0РГ АТРазы. Пропущенные через колонку СМЧ осаждали ультрацентрифугированием при 105 ООО g в течение 1 ч при 18& deg-С и промывали раствором 0,25 М сахарозы с последующим ультрацентрифугированием в тех же условиях. Полученный после центрифугирования осадок суспендировали в 0,25 М сахарозе, разливали небольшими порциями в пластиковые пробирки и замораживали в жидком азоте.

Получение препарата активированных и деактивированных субмитохоидриалъпых частиц

Для активации препарата 20 мл суспензии СМЧ (10 мг белка/мл) в среде, содержавшей 0,25 М сахарозу, 20 мМ Трис-НС1 (рН 8,0), 0,2 мМ ЭДТА и 0,5 мМ малонат, инкубировали с 1 мМ ЫАОРН и олигомицином (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого суспензию пропускали через колонку с сефадексом С-50 (грубый), уравновешенную той же средой, для удаления КАОРН. Суспензию, сошедшую с колонки, центрифугировали 30 мин при 30 000 g (4& deg-С), затем осадок суспендировали в той же среде, что и при нанесении на колонку, в объеме -0,5 мл [ВигЬаеу Qt а1., 1989, с модификациями]. Препарат хранили в жидком азоте.

СМЧ деактивировали прогреванием препарата при 30& deg-С в течение 30 мин.

Получение препарата изолированного Комплекса I

Препарат изолированного Комплекса I, полученный по методу Хатефи [На1еА, 1978], был любезно предоставлен к.б.н. Гавриковой Э. В.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

Получение препарата митохондрий сердца крысы Препарат получали по модифицированной методике Джекобуса и Сакса [Jacobus and Saks, 1982]. Сердца двух крыс обсушивали фильтровальной бумагой и ополаскивали трижды в переохлажденной среде выделения, содержавшей 0,3 М сахарозу, 10 мМ HEPES (7,4) и 0,2 мМ ЭДТА. После этого все процедуры проводились на льду. Сердца измельчали ножницами на чашке Петри ~5 мин, после чего продавливали через тканевой пресс. Полученный фарш трижды промывали в среде выделения, каждый раз фильтруя его через капроновый фильтр, до обесцвечивания промывных вод. Затем к суспензии добавляли 10 мл среды выделения и ставили на магнитную мешалку. При постоянном перемешивании добавляли 0,5 мл раствора трипсина, содержавшего 2,5 мг трипсина в 1 мл 1 мМ HCl, и инкубировали в течение 15 мин. На 4-ой и 9-ой минутах суспензию вручную гомогенизировали (гомогенизатор Поттера из органического стекла) и переносили в другой стакан, стоявший на магнитной мешалке. Через 15 мин добавляли 6,5 мг ингибитора трипсина, растворенного в 10 мл среды выделения, содержавшей 0,3 М сахарозу, 10 мМ HEPES (pH 7,4), 0,2 мМ ЭДТА и 1 мг/мл БСА. Эта же среда использовалась во всех последующих процедурах. Гомогенат перемешивали в течение 1 мин и затем фильтровали через капроновый фильтр. Фильтрат сохраняли, а к оставшейся суспензии добавляли 20 мл среды выделения и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе 1 мин. Гомогенат объединяли с фильтратом и центрифугировали 15 мин при 600 g (2 500 об. /мин) в центрифуге «Beckman» (ротор JA-20). Осадок отбрасывали, а супернатант фильтровали через капроновый фильтр. Процедуру промывания полученного препарата проводили трижды. Для этого суспензию центрифугировали 15 мин при 8 500 g (9 000 об. /мин) в центрифуге «Beckman» (ротор JA-20), супернатант по возможности полно сливали, а осадок ополаскивали небольшим количеством среды выделения, стараясь удалить белую налет вокруг коричневого осадка. Осадок суспендировали вручную в маленьком гомогенизаторе с добавлением 0,5−1,0 мл среды выделения. Затем суспензию переносили в центрифужный стакан, добавляли среду выделения до объема -20 мл и повторяли процедуру промывки. Во время последней стадии осадок промывали и суспендировали в минимальном количестве среды, не содержавшей БСА (0,4−0,6 мл). После этого отбирали 15−25 мкл суспензии на определение белка по модифицированному биуретовому методу. Суспензию митохондрий во время экспериментов хранили на льду не более 7−8 часов.

Получение препарата митохондрий, обработанных аламетиципом

Суспензию митохондрий сердца крысы, полученных по описанной выше методике, доводили при комнатной температуре до объема 5 мл (0,5 мг белка/мл) средой выделения, содержавшей 0,3 М сахарозу, 10 мМ НЕРЕБ (рН 7,4), 0,2 мМ ЭДТА и 1 мг/мл БСА. Затем добавляли аламетицин и Р^СЬ до конечной концентрации 40 мкг/мл и 2,5 мМ соответственно. Смесь инкубировали 5 мин при комнатной температуре, после чего добавляли равный объем охлажденной среды выделения и центрифугировали 15 мин при 15 000 об. /мин в центрифуге & laquo-Весктап»- (ротор 1А-20). Осадок суспендировали в минимальном объеме среды выделения, не содержавшей БСА, и отбирали 15 мкл для определения концентрации белка по модифицированному биуретовому методу. Во время опытов суспензию митохондрий хранили на льду.

Подготовка препарата митохондрий к электронной микроскопии

Митохондрии, выделенные из сердец 2-х крыс, суспендировали в 400 мкл среды выделения, содержавшей 0,3 М сахарозу, 50 мМ НереБ-КОН (рН 8,0), 0,2 мМ ЭДТА и 1 мг/мл БСА (см. выше). Полученную суспензию разделяли на 2 равные части по 200 мкл, а затем разводили той же средой в 5 раз. Первый препарат был контрольным, а ко второму препарату добавляли аламетицин и раствор MgCl2 до концентраций 40 мкг/мл и 2,5 мМ соответственно. Препараты инкубировали 5 мин при комнатной температуре, после чего в каждую пробу добавляли по 200 мкл 25%-ного глутарового альдегида и инкубировали на льду в течение 30−60 минут. Фиксированные глутаровым альдегидом препараты центрифугировали при 11 000 об. /мин в течение 10 мин на настольной центрифуге «Eppendorf». Полученные осадки промывали буфером, содержавшим 0,3 М сахарозу, 50 мМ Hepes-KOH (pH 8,0) и 0,2 мМ ЭДТА. Осадки разделяли тонкой иглой на несколько частей и помещали в раствор, содержавший 1,5 мл осмиевой кислоты и 1,5 мл буфера, на 40 мин. После этого оба препарата несколько раз промывали 50%-ным раствором этанола, чтобы удалить остатки воды. Дальнейшая процедура состояла в постепенном повышении концентрации спирта в пробах. Инкубацию проводили в 50%- и 60%-ном растворах спирта по 30 мин, а затем в растворе уранилацетата, приготовленном на 70%-ном растворе спирта, в течение ночи (~4& deg-С). На следующий день пробы обрабатывали 80%-ным спиртом (30 мин), после чего их оставляли в 96%-ном спирте на ночь при 4−5& deg-С.

На следующий день препараты еще раз промывали спиртом, а затем 2 раза ацетоном, каждый раз инкубируя по 20−30 минут. Затем осадки митохондрий последовательно помещали в смолу (& laquo-Ероп»-), разведенную ацетоном в 3, 2 и 1,5 раза соответственно, каждый раз оставляя препараты для пропитки смолой на ночь при комнатной температуре. Последним этапом было помещение препаратов в неразведенную смолу при 37& deg-С в течение ночи и дальнейшая полимеризация эпона при 60& deg-С до твердого стекловидного состояния.

Ультратонкие срезы фиксированных препаратов, а также электронномикроскопические снимки срезов были сделаны в Отделе электронной микроскопии (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского) J1.E. Бакеевой.

Аналитические методы

Измерение малат/глутамат-оксидазной реакции и величины дыхательного контроля

Малат/глутамат-оксидазную реакцию измеряли с помощью полярографа и кислородного электрода Кларка. Для этого в полярографическую кювету со средой измерения, содержавшей 0,25 M сахарозу, 10 мМ КС1, 5 мМ К±фосфат (рН 7,0) и 0,2 мМ ЭДТА, вносили 200−500 мкг/мл митохондрий, 5 мМ глутамат и 5 мМ малат. Измеряли скорость сопряженного дыхания (состояние 4 по Чансу [Chance and Williams, 1955]), после чего вносили 200 мкМ ADP и регистрировали скорость дыхания в состоянии 3. Величину Д К находили по отношению скоростей потребления кислорода в состоянии 3 и 4. Стандартные препараты митохондрий сердца крысы, использованные в данной работе, характеризовались величиной ДК, равной 10−15.

Измерение NADH: Ql-pedyKina3iioii активности

NADH: Qi-peflyKTa3Hyio активность измеряли на спектрофотометре Hitachi 557 при длине волны Х=340 нм по убыли NADH в кювете с длиной оптического пути 1 см, используя коэффициент молярного поглощения ?340=6,22−103. Среда измерения содержала 0,25 M сахарозу, 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ NaN3, 100 мкМ Q, и 100 мкМ NADH. В случае СМЧ среда содержала также 0,2 мкг/мл грамицидина D, а в случае митохондрий — 2,5 мМ MgCb и 40 мкг/мл аламетицина. Реакцию начинали добавлением СМЧ или митохондрий соответственно.

Измерение NADH-оксидазной активности

NADH-оксидазную активность измеряли на спектрофотометре Hitachi 557 при длине волны A=340 или 380 нм (если концентрация нуклеотида была > 150 мкМ) по убыли NADH. Среда измерения содержала 0,25 M сахарозу, 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 0,2 мМ ЭДТА и -100 мкМ NADH (стандартные условия), в случае не обработанных заранее аламетицином митохондрий среда содержала также 2,5 мМ MgCb и 40 мкг/мл аламетицина.

Измерение изоцитратдегидрогеназной активности

ЫАОР±зависимая изоцитратдегидрогеназа (ИЦДГ) катализирует реакцию: трео-^-изоцитрат + NADP+ а-кетоглутарат + НСО3' + NADPH + Н+

Изоцитратдегидрогеназную реакцию измеряли на спектрофотометре Hitachi 557 при длине волны Х=340 нм по появлению NADPH. Среда измерения содержала 0,25 М сахарозу, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 0,2 мМ ЭДТА-К+, 1 цМ ротенон, 2,5 мМ MgCb, 40 мкг/мл аламетицина, 10 мМ Д/,-изоцитрат и 5 мМ NADP+. Реакцию начинали добавлением митохондрий [Cleland et al, 1969, с модификациями].

Измерение аконитазной активности

Аконитазную реакцию регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 при длине волны? i=340 нм по прибыли NADPH. Среда измерения содержала 0,25 М сахарозу, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 0,2 мМ ЭДТА-К+, 1 цМ ротенон, 2,5 мМ MgCb, 40 мкг/мл аламетицина, 10 мМ цитрат и 5 мМ NADP+. Реакцию начинали добавлением митохондрий, полагая, что эндогенная ИЦДГ окисляет образующийся в аконитазной реакции изоцитрат:

Акоиитаза ИЦДГ цитрат -" изоцитрат + а-кетоглутарат + СО2 + NADPH + Н+.

Измерение сукцинат-оксидазной активности

Измерение проводили полярографически по убыли О2 в кювете с помощью электрода Кларка. Среда измерения содержала 0,3 М сахарозу, 10 мМ HEPES (рН 7,4), 0,2 мМ ЭДТА, 5 мкМ ротенон и 10 мкМ цитохром с. Реакцию начинали внесением 10 мМ сукцината.

Измерение АТРазной активности

АТРазную активность измеряли по количеству высвобождаемых в среду протонов по изменению окраски индикатора фенолового красного при 557−620 нм [Chance and Nishimura, 1967]. Среда измерения содержала 0,25 M сахарозу, 100 мМ KCl, 5 мМ Hepes, 0,1 мМ ЭДТА-К+ (pH 7,4), 2 мМ MgCl2, 2 мМ АТР и 30 мкМ феноловый красный. Для остановки реакции в среду вносили олигомицин (5 нмоль/мг белка). При измерении скорости реакции в присутствии азида регистрацию проводили через 4 мин после начала реакции (азид является ингибитором АТРазы только в присутствии ADP, который накапливается в ходе АТРазной реакции).

Изучение набухания митохондрий по изменению светорассеивания

Иследуемый препарат митохондрий вносили в кювету, заполненную 2 мл среды измерения (состав указан в подписи к рисунку), и регистрировали величину оптического поглощения на приборе Pharmacia LKB Ultrospec III при длине волны Х=520 нм. Концентрация белка в пробе составляла 0,3 мг/мл.

Определение белка

К 10−100 мкл суспензии митохондрий, содержавшей 0,1−1,0 мг белка, добавляли раствор 0,1%-ного дезоксихолата Na+, приготовленного на 1 н. NaOH, до объема 250 мкл. Суспензию оставляли на ночь в холодильнике, либо не менее чем на 30 мин при комнатной температуре. К исследуемому и контрольному растворам добавляли по 1 мл стандартного биуретового реактива. Контрольный раствор содержал 250 мкл 0,1% дезоксихолата Na+ на 1 н. NaOH. После добавления биуретового реактива растворы убирали в защищенное от света место на 30 минут. Измерения проводили при ^=540 нм на приборе Pharmacia LKB Ultrospec III в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см. Калибровочный график для определения количества белка строили по стандартному раствору БСА.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Аламетицин как инструмент для изучения внутримитохондриальных ферментов

Влияние аламетицина на свойства препаратов митохондрий, субмитохопдриальных частиц и изолированного Комплекса I

Так как внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для КАОН [ЬеИп^ег, 1951], а ИАОН-связывающий центр Комплекса I экспонирован в матрикс, выделяемые нами препараты интактных митохондрий сердца крысы (дыхательный контроль > 10) практически не окисляют добавленные пиридиннуклеотиды (данные не приведены). В связи с этим нас интересовала возможность использования аламетицина, каналообразующего антибиотика, для увеличения проницаемости внутренней митохондриальной мембраны. Ранее на препарате интактных митохондрий печени крысы было показано, что аламетицин в концентрации около 10 мкг/мл вызывает активацию их сукцинатоксидазной активности [Якоу й а1., 1992]. Недавно в нашей лаборатории было показано, что и ЫАОН-оксидазную активность можно измерять с использованием этого антибиотика [Опуепшкоуа а!., 2001].

Мы сравнили зависимости сукцинатоксидазной (рис. 4, кривая 1) и ЫАОН-оксидазной (рис. 4, кривая 2) активностей митохондрий от концентрации добавленного аламетицина. Видно, что максимальная ЫАОН-оксидазная активность фермента выявляется при концентрациях аламетицина, превышающих 20 мкг/мл, а полная активация сукцинатоксидазы происходит уже при добавлении 10 мкг/мл антибиотика, что хорошо согласуется с данными, полученными ранее Ритовым и соавт. [11Цоу е1 а1., 1992]. Так как в митохондриальной мембране существует дикарбоксилатный переносчик, способный переносить сукцинат внутрь, а образованный фумаразой малат наружу, можно считать, что активация окисления сукцината происходит за счет разобщения мембраны (увеличения проницаемости мембраны для протонов). Однако активность сукцинатоксидазы в присутствии аламетицина (0,4 мкмоль/мин/мг белка) в ~3 раза выше, чем активность, измеренная в присутствии разобщителя (0,15 мкмоль/мин/мг белка), что указывает на дикарбоксилатный переносчик в качестве лимитирующего фактора при измерении окисления сукцината в полностью разобщенных митохондриях. Таким образом, увеличение активности сукцинатоксидазы при добавлении аламетицина можно объяснить суперпозицией двух процессов: разобщения мембраны и увеличения проницаемости мембраны для субстрата.

Различия в концентрациях аламетицина, необходимых для выявления максимальных активностей ЫАОН- и сукцинат-оксидазной реакций, по-видимому, обусловлено строением аламетициновой поры (& laquo-модель бочонка& raquo-) [Ермишкин, Зильберштейн, 1982]. Согласно этой модели при увеличении концентрации аламетицина происходит увеличение диаметра образующегося канала, и следовательно, для проникновения через мембрану более крупный субстрат нуждается в большей концентрации добавляемого аламетицина.

100

10 20 30 40 Аламетицин (мкг/мл)

Рис. 4. Зависимость NADH-oкcидaзнoй и сукцинатоксидазной активностей интактных митохондрий сердца крысы от концентрации аламстицина. о) — Сукцинатоксидазная активность, 100% соответствует активности 0,4 мкмоль сукцината/мин на 1 мг белка, (•) — ЫАОН-оксидазная активность, 100% соответствует активности 1,4 мкмоль ЫАОН/мин на 1 мг белка.

Митохондрии сердца крысы (0,3 мг/мл) инкубировали в среде, содержащей 0,3 М сахарозу, 10 мМ НЕРЕБ (7,4), 0,2 мМ ЭДТА и 10 мкМ цитохром с в присутствии 2,5 мМ МёСЬ и различных количеств аламетицина в течение 5-ти минут. Реакцию начинали внесением 1 мМ ЫАБП (кривая 2) или 10 мМ сукцината (кривая /) соответственно. При измерении сукцинат-оксидазной активности среда дополнительно содержала 5 мкМ ротенон. N, А ОН-оксидазную активность регистрировали спектрофотометрически при 380 нм, а сукцинатоксидазную активность определяли полярографически по убыли Ог

В табл. 1 представлены сводные данные по влиянию аламетицина на различные оксидоредуктазные активности, измеренные на препаратах митохондрий, СМЧ и выделенного Комплекса I. Скорость глутамат/малат-поддерживаемого дыхания в состоянии 3 (в присутствии ADP и Pj) была в ~10 раз ниже, чем скорость окисления NADH после добавления аламетицина (0,13 и 1,25 мкмоль/мин/мг белка соответственно). NADH-оксидазная реакция, измеренная в присутствии аламетицина, была на ~90% чувствительна к ротенону и не стимулировалась добавлением разобщителя. Аламетицин не влиял на NADH-оксидазную активность, катализируемую выделенным препаратом Комплекса I и субмитохондриальными частицами. Последнее доказывает, что полученный нами препарат СМЧ действительно являлся препаратом & laquo-вывернутых»- митохондриальных мембран, где активный центр Комплекса I обращен наружу.

Еще один фермент, активность которого является важнейшей характеристикой препарата митохондрий, — F0Fi-ATPa3a. По меньшей мере, два переносчика могут вносить вклад в скорость гидролиза АТР разобщенными митохондриями, — карбоксиатрактилат-чувствительная ATP/ADP-транслоказа и фосфатный переносчик. Как видно из результатов, представленных в табл. 2, аламетицин делает мембрану проницаемой для ATP, ADP и фосфата, так как в его присутствии реакция становится нечувствительной к добавлению карбоксиатрактилата. Скорость олигомицин-чувствительного гидролиза АТР после добавления аламетицина была в ~2 раза выше, чем скорость, измеренная в присутствии разобщителя (1,4 и 0,8 мкмоль АТР/мин/мг белка соответственно). Это указывает на то, что в нативных, необработанных аламетицином митохондриях лимитирующим скорость реакции фактором являются переносчики (нуклеотидный и/или фосфатный). Обработанные аламетицином митохондрии полностью сохраняли чувствительность АТРазы к азиду и олигомицину, специфическим ингибиторам F0FrATPa3. С другой стороны, как и ожидалось, аламетицин не влиял на карбоксиатрактилат-нечувствительную АТРазную активность СМЧ.

Таблица 1. Эффект аламетицина на оксидоредуктазные активности в различных митохондриальных препаратах

Препарат и реакция

Активность (мкмоль/мин на 1 мг белка)

— Аламетицин Аламетицин (30 мкг/мл)

Митохондрии сердца крысы:

Малат/глутамат-оксидаза Дыхание в состояние 4 Дыхание в состоянии Зб ЫАОН-оксидазав ротенон (5 мкМ) Сукцинатоксидаза + РССР (1 мкМ) N АОН: 1 -редуктазаг + ротенон (5 мкМ) СМЧ сердца быка:

ЫАОН-оксидаза" ротенон (5 мкМ) ИАОН: С) | -редуктазаг + ротенон (5 мкМ) Комплекс I сердца быка:

N АОН: 1 -редуктаза6 + ротенон (5 мкМ)

0,01 0,13 0,10 0,06 0,08 0,15 0,05

0,96 < 0,01 0,84 0,11

2,65 0,21

1,25 0,06 0. 40

0,54 0,05

0,95 < 0,01 0,82 0,11

2,73 0,24

Приведены данные типичных экспериментов. Различия в значениях, полученных в серии аналогичных опытов, не превышали 20%.

6 В стандартную среду измерения вносили 200 мкМ АОР (см. & laquo-Методы исследования& raquo-). в В качестве субстрата вносили 200 мкМ ЫАОН.

Стандартная среда содержала 100 мкМ ЫАОН, 100 мкМ С^ и 1,5 мМ цианид калия. Стандартная среда содержала 100 мкМ КАИН, 100 мкМ и 5 мМ азид натрия

Таблица 2. Влияние аламетицина на АТРазную активность СМЧ сердца быка и митохондрий сердна крысы

Условия измерения

АТРазпая активность3 (мкг-ионы Н+/мин/мг белка) Митохондрии СМЧ

1. Без добавок 0,1 6,0

2. + FCCP (0,7 мкМ) 0,8 8,0

3. + FCCP (0,7 мкМ) + олигомицин (0,5 нмоль/мг белка) 0,1 0,1

4. + FCCP (0,7 мкМ) + карбоксиатрактилат (2 мкМ) 0,1 7,9

5. + Аламетицин (30 мкг/мл) 1,4 8,0

6. + Аламетицин (30 мкг/мл) + карбоксиатрактилат (2 мкМ) 1,2 7,0

7. + Аламетицин (30 мкг/мл)+ азид (0,4 мМ) 0,1 < 0,1 аАТРазную активность измеряли, как описано в разделе & laquo-Методы исследования& raquo-. В пробах / и 3−6 после 5 мин преинкубации препарата с указанными реагентами реакцию начинали добавлением АТР, после чего измеряли уровень начальной скорости. В пробе 2 FCCP добавляли через 1 мин после внесения АТР. В пробе 7 реакцию начинали внесением митохондрий или СМЧ в стандартную среду измерения, содержавшую азид, после чего через

4 мин измеряли скорость реакции. Во всех случаях реакцию останавливали внесением олигомицина (5 нмоль/мг, остаточная активность при этом составляла < 0,05 мкг-ионов Н+). Ответ фенолового красного на закисление среды калибровали добавлением 20−50 мкМ HCl. В таблице приведены данные типичных экспериментов. Различия в значениях, полученных в серии аналогичных опытов, не превышали 20%

Влияние ионов магния на МАйН-оксидазную активность митохондрий

В ряде случаев полученные митохондрии имели сниженные величины дыхательного контроля (ДК~5 вместо 10−15 для обычных препаратов). Оказалось, что после предварительной обработки аламетицином ЫАОН-оксидазная активность таких препаратов митохондрий сильно снижена и зависит от концентрации ионов магния в среде измерения (рис. 5). Мы предположили, что такие митохондрии имеют повреждения во внешней мембране, в результате чего после набухания происходит уход в раствор цитохрома с, который в норме локализован на внешней стороне внутренней мембраны митохондрий. Действительно, оказалось, что добавление цитохрома с в среду измерения снимает ингибирующий эффект ионов магния. График зависимости ЫАОН-оксидазной активности от концентрации цитохрома с в двойных обратных координатах представлен на рис. 6.

Хорошо сопряженные митохондрии сердца крысы (ДК& gt-10) даже после обработки аламетицином практически не ингибировались ионами магния, а добавление цитохрома с практически не влияло на их ЫАОН-оксидазную активность.

10 15 20 МдС! (мМ)

Рис. 5. Зависимость ОДОН-оксидазной активности митохондрий сердца крысы от концентрации Л^СЬ в реакционной среде.

Митоходрии предварительно обрабатывали аламетицином и измеряли КАЭН-оксидазную активность, как описано в разделе & laquo-Методы исследования& raquo-, добавляя в реакционную среду различные концентрации М? С12. Дыхательный контроль митохондрий ДК=5. Реакцию начинали добавлением митохондрий (20 мкг/мл), за 100% активности принимали 0,9 мкмоль ЫАОН/мин на 1 мг белка

1/Цитохром с (мкМ& quot-1)

Рис. 6. Зависимость ОДЭН-оксидазнои активности митохондрий сердца крысы от концентрации цитохрома с при двух различных концентрациях М§ СЬ в двойных обратных координатах.

Митоходрии предварительно обрабатывали аламетицином и измеряли ЫАОН-оксидазную активность, как описано в разделе & laquo-Методы исследования& raquo-. Концентрация М§ СЬ в пробе составляла 11,3 мМ (кривая 1) и 5,6 мМ (кривая 2). Реакцию начинали добавлением митохондрий (20 мкг/мл)

Таким образом, использование каналообразующего антибиотика аламетицина является удобным инструментом при измерении каталитических активностей различных ферментов митохондриальных мембран в препарате нативных митохондрий. Однако нас интересовал вопрос, вызывает ли аламетицин нарушения в структуре митохондрий, а также сохраняются ли в матриксе митохондрий белки после формирования аламетициновых каналов во внутренней мембране. С этой целью мы получили электронные микрофотографии нашего препарата, а также определили содержание некоторых ферментов матрикса митохондрий до и после обработки аламетицином.

Ультраструктура митохондрий сердца крысы, обработанных аламетицином

На рис. 7 (два разных увеличения) представлены электронные микрофотографии контрольного препарата митохондрий сердца крысы и того же препарата после обработки аламетицином. Митохондрии в изотоническом растворе сахарозы имеют очень плотный и темный матрикс, что соответствует литературным данным, согласно которым в отсутствие высокомолекулярных веществ в среде суспендирования митохондрий, при условии целостности внешней мембраны, вода поступает в межмембранное пространство, и создаваемое гидростатическое давление вызывает сильное сжатие матрикса митохондрий. После добавления аламетицина барьеры проницаемости для низкомолекулярных веществ исчезают и митохондрии, обработанные аламетицином, набухают (рис. 7, Б). Объем их матрикса увеличился, матрикс стал более светлым по сравнению с контрольными митохондриями. Митохондрии приобрели сферическую форму. Однако обработка митохондрий аламетицином не приводила к разрушению митохондрий. Видно, что после обработки аламетицином наружная мембрана сохранялась.

Рис. 7. Ультраструктура митохондий сердца крысы до (А) и после (Б) обработки аламетицииом при двух различных увеличениях.

Подготовка препаратов к электронной микроскопии описана в разделе & laquo-Методы исследования& raquo-

Мы проследили также за набуханием митохондрий методом измерения светорассеиёания (рис. 8). Из рисунка видно, что аламетицин, добавленный к суспензии митохондрий, вызывал снижение оптической плотности (А). Эти результаты находятся в полном соответствии с данными электронной микроскопии, свидетельствующими о набухании митохондрий. Набухание митохондрий происходит, по-видимому, из-за того, что в матриксе митохондрий сохраняются белки, для которых мембрана митохондрий непроницаема даже в присутствии аламетицина. Митохондрии в присутствии аламетицина набухали максимально, как это происходит при набухании митохондрий в чистой воде (см. рис. 8, Б). Добавление аламетицина и ионов магния к митохондриям в воде практически не меняло уровень их набухания. При добавлении в среду измерения высокомолекулярного белка БСА исходное поглощение митохондрий уменьшалось (рис. 8, В). Этот результат хорошо согласуется с данными литературы, согласно которым введение в изотоническую среду суспендирования митохондрий высокомолекулярных веществ вызывает уравновешивание онкотического давления межмембранного пространства и внемитохондриальной среды. В результате происходит выход воды из межмембраного пространства, где снижается гидростатическое давление, которое в отсутствии БСА приводило к сильному сжатию матрикса митохондрий. Объем матрикса увеличивается, что приводит к уменьшению светорассеивания [Бакеева и др., 1971]. Добавление аламетицина в этих условиях приводило к дальнейшему набуханию, которое связано с выравниванием онкотического давления матрикса и внемитохондриальной среды. Степень набухания при этом меньше, чем в изотоническом буферном растворе (рис. 8, А). Помещенные в гипотонический 20%-ный раствор БСА митохондрии набухают максимально (рис. 8, Г). Этот результат подтверждает известный в литературе факт, что вклад белков в общее осмотическое давление в матриксе незначителен и определяется практически только растворенными там низкомолекулярными веществами, для которых внутренняя мембрана непроницаема [Бакеева и др., 1971]. После снятия барьера проницаемости для низкомолекулярных веществ (добавление аламетицина) митохондрии в 20%-ном растворе БСА сжимаются, так как объем митохондрий теперь регулируется только соотношением концентраций высокомолекулярных соединений в матриксе и внемитохондриалыюй среде. Сжатие митохондрий в среде с 20%-ным БСА (рис. 8, Г) косвенно свидетельствует о том, что мембрана митохондрий, обработанных аламетицином непроницаема для белков, что позволяет полагать, что после обработки аламетицином митохондрии сохраняют неизменным белковое содержание матрикса.

АА52о=0,2

1 мин Б

МёС12 1 Алам 1 мх

Рис. 8. Набухание митохондрий сердца крысы в различных средах.

Степень набухания митохондрий регистрировали по изменению светорассеяния суспензии, как описано в разделе & laquo-Методы исследования& raquo-. Среда измерения содержала 0,3 М сахарозу, 10 мМ НЕРЕБ (рН 7,4), 0,2 мМ ЭДТА, 5 мкМ ротенон (А) — воду и 5 мкМ ротенон (Б) — то же, что в случае а, + 20% БСА (В) — то же, что в случае Б, + 20% БСА (Г). Концентрация белка в пробах составляла 300 мкг/мл, где указано, вносили 2,5 мМ МцСЬ и 40 мкг/мл аламетицина

Таким образом, используя метод электронной микроскопии и метод светорассеивания, мы показали, что аламетицин вызывает набухание препарата митохондрий сердца крысы. Нельзя было исключить, что появление ЫАОН-оксидазной активности в таком препарате вовсе не связано с образованием аламетициновых каналов для ЫАЭН, а происходит в результате изменения проницаемости внутренней мембраны митохондрий при набухании. Мы проверили такую возможность. Результаты, приведенные на рис. 8, Б, показывают, что инкубация митохондрий в воде не приводит к появлению высокой ЫАОН-оксидазной активности. Небольшая ЫАОН-оксидазная активность митохондрий, по-видимому, связана с некоторым количеством поврежденных митохондрий. Таким образом, аламетицин действительно образует специальные каналы для проникновения ЫАОН и делает внутримитохондриальный участок связывания ЫАЭН Комплекса I доступным для добавленных пиридиннуклеотидов.

Акопитазпая и изоцитратдегидрогеназная активности митохондрий сердца крысы до и после обработки аламетиципом

Данные электронной микроскопии показали морфологическую целостность внутренней и внешней мембран митохондрий. Можно было ожидать, что обработка в указанных условиях митохондрий аламетицином приведет к проницаемости мембран только для низкомолекулярных компонентов, тогда как белки сохранятся в матриксе. Для подтверждения этого мы измеряли активность двух ферментов матрикса: аконитазы и изоцитратдегидрогеназы.

Так же, как и в случае Комплекса I, активность изоцитратдегидрогеназы в интактных митохондриях измерить невозможно, так как субстратом фермента является ЫАОР+. Однако добавление аламетицина к митохондриям в среде, содержащей субстраты изоцитратдегидрогеназной реакции, приводит к многократному увеличению каталитической активности изоцитратдегидрогеназы (рис. 9, А). Также многократно увеличивается активность аконитазной реакции, измеренной в системе, сопряженной с изоцитратдегидрогеназной реакцией:

Аконитаза ИЦЦГ цитрат -" изоцитрат а-кетоглутарат + С02 + ЫАЭРН + Н+.

ЫАОР+

Реакцию регистрировали по появлению ИАОРН. Из рис. 9, Б видно, что добавление аламетицина вызывает резкое увеличение аконитазной активности препарата митохондрий. Таким образом, аламетицин оказался удобным инструментом для измерения активности не только Комплекса I, но и аконитазы и изоцитратдегидрогеназы.

Далее мы определили, сохраняются ли аконитаза и изоцитратдегидрогеназа в матриксе митохондрий после обработки аламетицином. Препарат митохондрий обрабатывали аламетицином, после чего осаждали центрифугированием (30 ООО g). Полученный осадок митохондрий ресуспендировали и анализировали на содержание в нем аконитазной и изоцитратдегидрогеназной активностей. Результаты приведены на рис. 9, В. Видно, что до и после обработки аламетицином активности этих ферментов различаются незначительно. Таким образом, диаметр пор, образованных аламетицином, не достаточно велик для выхода белков.

Изоцитратдегидрогеназа Аконитаза

Рис. 9. Сравнение изоцитратдегидрогеназной и аконитазной активностей митохондрий до и после обработки аламетицином.

Митоходрии предварительно обрабатывали аламетицином, как описано в тексте и разделе & laquo-Методы исследования& raquo-. Измерение активностей проводили, как описано в разделе & laquo-Методы исследования& raquo-. Контрольные митохондрии и препарат, предварительно обработанный аламетицином, помещали в среду измерения активности и инкубировали 5 мин в присутствии аламетицина (40 мкг/мл). Концентрация белка в среде измерения была одинаковой и составляла 22 мкг/мл. Реакцию начинали добавлением изоцитрата (для ИЦДГ) или цитрата (для аконитазы). 100% Активности изоцитратдегидрогеназы соответствует 0,25 мкмоль изоцитрата/мин/мг белка, аконитазы — 0,05 мкмоль цитрата/мин/мг белка. Светлосерые столбики — контрольные митохондрии, темно-серые — контрольные митохондрии в присутствии аламетицина, белые — митохондрии после обработки аламетицином и переосаждения

В результате проделанной работы мы показали, что препарат сопряженных митохондрий после обработки аламетицином полностью сохраняет структуру из двух замкнутых мембран (внешнюю и внутреннюю), а также сохраняет белковый состав матрикса. Таким образом, использование аламетицина позволяет проводить измерения активностей внутримитохондриальных ферментов в нативном окружении при полном или, по крайней мере, частичном сохранении специфических белок-белковых и белок-мембранных взаимодействий. Однако существуют некоторые ограничения при использовании аламетицина для изучения митохондриальных ферментов. Например, после образования аламетициновых пор становится невозможным создание протонного градиента на мембране, и дальнейшие исследования проводятся на полностью разобщенном мембранном препарате. Кроме того, появление проницаемости для низкомолекулярных веществ может привести к потере специфических активаторов или ингибиторов отдельных ферментов и, таким образом, повлиять на измеряемую активность непредсказуемым образом. С другой стороны, эта особенность обработанного аламетицином препарата может быть полезной для изучения селективного воздействия низкомолекулярных соединений на активности ферментов.

Следует заметить, что количество антибиотика и условия инкубации, необходимые для пермеабилизации мембраны, могут сильно различаться в зависимости от конкретного препарата. Несмотря на то, что в наших экспериментах аламетицин не влиял на активности Комплекса I и РоРрАТР-азы (препарат СМЧ, табл. 1 и 2), в каждом конкретном случае при измерении специфических активностей необходимо проводить соответствующие контрольные измерения, чтобы исключить влияние аламетицина непосредственно на изучаемый фермент.

В случае изучения активности Комплекса I дыхательной цепи в составе нативных митохондрий обработка аламетицином дает возможность освободиться от эндогенных пиридиннуклеотидов и достичь состояния деактивации фермента, невозможной в присутствии восстановленных ЫАЭН и КАОРН. Такой препарат становится удобным объектом для изучения регуляторных свойств Комплекса I в его естественном белковом окружении.

В связи с этим мы решили сравнить кинетику деактивации Комплекса I в препарате митохондрий сердца крысы, предварительно обработанных аламетицином, и в СМЧ сердца быка.

Кинетика деактивации Комплекса I в митохондриях и субмитохондриальных частицах

Препарат митохондрий сердца крысы обрабатывали аламетицином, как описано в разделе & laquo-Методы исследования& raquo-. Для получения деактивированного препарата часть митохондрий прогрели в течение 15 минут при 37& deg-С. Известно, что в отличие от активного препарата деактивированный фермент катализирует ЫАЭН-оксидазную и ЫАОН^-редуктазную активность с лаг-фазой, при этом появляется чувствительность фермента к модификатору БН-групп ЫЕМ, а также к ионам Mg2+ при щелочных значениях рН.

Для изучения кинетики деактивации Комплекса I препарат митохондрий прогревали при 37& deg-С в присутствии 2 мМ ИЕМ. Через определенные промежутки времени отбирали пробы на измерение ЫАОН^-редуктазной активности активности. Как видно из рис. 10 А, активность митохондрий падает и уже через 10 минут составляет около 10% от исходной (кривая 1). Если митохондрии инкубировали с 2 мМ ЫЕМ при комнатной температуре (~20& deg-С), то активность митохондрий падает весьма незначительно даже после 40 мин инкубации (кривая 2). Полученные данные находятся в соответствии с результатами, полученными для СМЧ, где, как было показано, процесс деактивации Комплекса I происходит только при высокой температуре (30& deg-С и выше).

Можно было предположить, что различная чувствительность митохондрий к ЫЕМ при комнатной температуре и 37& deg-С связана не с деактивацией, а с сильно различающейся скоростью модификации Комплекса I Ы-этилмалеимидом. Чтобы исключить такую возможность, был поставлен эксперимент, во время которого препарат митохондрий сначала прогревали при 37& deg-С, после чего препарат охлаждали до комнатной температуры. Затем добавляли 2 мМ ЫЕМ и проводили измерение активности через 3 минуты. Из рис. 10 А (кривая 3) видно, что появление чувствительности Комплекса I к ЫЕМ происходит в результате нагревания фермента, а снижение температуры, при которой проводилась модификация фермента ЫЕМ не сказывается на кинетике процесса.

Мы провели аналогичный эксперимент с препаратом СМЧ (рис. 10 Б, кривые 1, 2). Активность СМЧ при нагревании (37& deg-С) с 2 мМ ЫЕМ изменялась так же, как и в случае с митохондриями, и достигала 10% через 10 мин. Если СМЧ инкубировали с 2 мМ ЫЕМ при комнатной температуре (~20& deg-С), то активность падала весьма незначительно даже после 40 мин инкубации.

Чтобы оценить влияние температуры на скорость модификации СМЧ, препарат частиц деактивировали при 37& deg-С в течение 15 мин, затем охлаждали до комнатной температуры, добавляли к нему 2 мМ ЫЕМ и инкубировали различное время. Рис. 10 Б (кривая 3) показывает, что при комнатной температуре ЫЕМ уже через 30 сек практически полностью блокирует деактивированный препарат СМЧ.

Таким образом, в митохондриях, где Комплекс 1 находится в естественном белковом окружении, процесс его деактивации протекает с параметрами, сходными с таковыми для СМЧ.

А (Митохондрии)

Б (СМЧ)

Рис. 10. Кинетика деактивации Комплекса I в составе митохондрий сердца крысы (А) и СМЧ (Б).

Концентрация белка митохондрий и СМЧ в пробе составляла 12 мкг/мл. А — Митохондрии инкубировали при 37& deg-С (кривая 1) или 20& deg-С (кривая 2) в присутствии 2 мМ ЫЕМ в стандартной среде измерения активности. Через определенные промежутки времени отбирали пробы и измеряли ЫАОН'. С^-редуктазную активность, как описано в разделе & laquo-Методы исследования& raquo-. Кривая 3 — митохондрии инкубировали при 37& deg-С, охлаждали до комнатной температуры, затем добавляли 2 мМ ЫЕМ и инкубировали 3 мин, затем измеряли активность. Б — СМЧ инкубировали при 37& deg-С (кривая 1) или 20& deg-С (кривая 2) в присутствии 2 мМ ЫЕМ в стандартной среде измерения активности. Через определенные промежутки времени отбирали пробы и измеряли ЫАОН^-редуктазную активность, как описано в разделе & laquo-Методы исследования& raquo-. Кривая 3 — СМЧ прогревали 15 мин при 37& deg-С, охлаждали до комнатной температуры, затем добавляли 2 мМ ЫЕМ и смесь инкубировали указанное время. Отбирали пробы и измеряли активность

II. Топография БН-группы, чувствительной к АоБ-переходу

Все ранее опубликованные нашей лабораторией данные об А< -Ю-переходе Комплекса I и связанному с ним появлению чувствительности фермента к 8Н-реагентам были получены с использованием ЫЕМ -относительно гидрофобного соединения, проникающего через мембраны. Описанные в предыдущем разделе данные о пермеабилизации внутренней мембраны митохондрий аламетицином позволили перейти к установлению топографии БН-группы Комплекса I, чувствительной к АоБ-переходу. Можно было ожидать, что если эта группа локализована в матриксе, аламетицин вызовет появление ее реактивности по отношению к гидрофильным непроникающим реагентам.

Локализация ЗН-группы, меняющей реакционноспособность при деактивации Комплекса I

Мы сделали предположение, что использование непроникающего через мембрану реагента на деактивированных препаратах интактных митохондрий и & laquo-вывернутых»- СМЧ позволит выяснить расположение АЮ-БН-группы относительно внутренней митохондриальной мембраны. Для наших целей мы выбрали два модификатора: проникающий через мембрану нейтрально заряженный ЫЕМ и непроникающий анион ДТНБ (рис. 11). Чтобы достичь состояния деактивации белка и предотвратить его реактивацию эндогенными субстратами, митохондрии были преинкубированы при 37& deg-С в анаэробных условиях. На рис. 12 представлены результаты измерения ЫАОН-оксидазной активности таких препаратов, обработанных ИЕМ и ДТНБ в присутствии и в отсутствие аламетицина. Видно, что непроникающий анион ДТНБ, в отличие от ЫЕМ, не приводит к ингибированию активности фермента. После добавления аламетицина в среду преинкубации оба реагента ингибируют активность с одинаковой эффективностью.

Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что интересующая нас БН-группа расположена на внутренней стороне внутренней митохондриальной мембраны, а на ее внешней стороне нет других значимых для активности Комплекса I 8Н-групп.

БТ1ЧВ

-2

-2

Рис. 11. Доступность БН-групп в мембранных препаратах для добавленных извне модификаторов в присутствии (крайний справа рисунок) и в отсутствие аламетицина

Аламетицин

Рис. 12. Эффект каналообразующего антибиотика аламетицина на ингибированис деактивированного Комплекса I йН-моднфикаторами.

Митохондрии сердца крысы (1 мг/мл) инкубировали в среде, содержавшей 0,25 М сахарозу, 0,2 мМ ЭДТА, 1,5 мМ сукцинат К& quot-, 50 мМ Тш/СГ (рН 8,0) при 37& deg-С в течение I ч в закрытых флаконах (общий объем 2 мл). Реакционную среду наливали до плотно закрытой резиновой крышки, чтобы избежать контакта суспензии с воздухом, а растворенный в среде кислород восстанавливался во время сукцинат-оксидазной реакции. После анаэробной инкубации образцы охлаждали до 15& deg-С, добавляли ингибиторы (0,5 мМ ЫЕМ или ДТНБ) шприцом под крышку, после чего инкубировали в течение 30 мин. Аламетицин (20 мкг/мл) и MgCl2 (0,6 мМ) добавляли к образцам, где указано (Б), перед добавлением ингибиторов. Затем образцы разводили в 5 раз и переосаждали (1 ч 16 000 об/мин, ротор Вескшап М-20). Осадки ресуспендировали в среде, содержавшей 0,25 М сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Тш/СГ (рН 8,0), после чего измеряли ЫАО! 1-оксидазную активность при 30& deg-С в среде, содержавшей 0,25 М сахарозу, 0,2 мМ ЭДТА, 0,6 мМ MgCI2, 20 мкг/мл аламетицина, 100 мкМ. ЫАОН, 50 мМ Тпз/СГ (рН 8,0) и 20−30 мкг белка на 1 мл. Незначительное ингибирование (-15%, данные не приведены) ЫАОН-оксидазной активности 8Н-реагентами наблюдалось в контрольных препаратах, преинкубированных в аэробных условиях (открытые и хорошо перемешиваемые флаконы), в дальнейшем обработанных аналогично анаэробным препаратам. 100% ЫАГШ-оксидазной активности соответствовало 0,6 мкмоль/мин на 1 мг белка (значение, полученное для необработанных ингибиторами митохондрий после анаэробиоза)

Общее содержаниереакционноспособпых SH-групп е препаратах митохондрий сердца крысы и СМЧ сердца быка

Для измерения общего количества реакционноспособных SH-групп был выбран реактив Эллмана (5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота, ДТНБ) как наиболее специфичный модификатор. Полученные результаты приведены в таблице 3. Как и ожидалось, аламетицин вызывал значительное увеличение количества SH-групп, реагирующих с ДТНБ, в препарате нативных митохондрий, однако в случае субмитохондриальных частиц это количество практически не менялось. Растворение мембран детергентом Triton Х-100 приводило к дальнейшему увеличению количества выявляемых сульфгидрильных групп в обоих препаратах. Следовательно, проницаемость мембраны — не единственное ограничение при выявлении модифицируемых групп, часть из них экранирована липидами и/или белковыми цепями. В дальнейшем подсчитанное количество реакционноспособных SH-групп учитывалось при подборе концентрации ингибитора.

Таблица 3. Содержание реакционноспособных SH-груии в различных препаратах.

Количество групп, взаимодействующих с ДТНБ Препараты (нмоль на 1 мг белка)

— аламетицин + аламетицин*

Митохондрии сердца крысы Triton Х-100

СМЧ сердца быка Triton Х-100

16 ±2 40 ±2

48 + 2

16 ±2 16 ±2 35 ±2 35 ±2

Митохондрии сердца крысы или СМЧ сердца быка (0,2 мг/мл) суспендировали в среде, содержавшей 0,25 М сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Tris/СГ, рН 8,0. Аламетицин и Triton Х-100 вносили до конечных концентраций 30 мкг/мл и 1% соответственно. ДТНБ (2−10'4 М, т. е. 1 мкмоль/мг белка) добавляли в суспензию, и измеряли поглощение при X 412/510 нм. Значение оптической плотности переставало увеличиваться через ~30 мин. Конечный уровень поглощения использовали для подсчета содержания SH-групп в белке.

Одновременно с аламетицином добавляли MgCb (2,5 мМ), так как ранее была показана необходимость присутствия ионов Mg2+ для формирования аламетициновых каналов [Gostimskaya et al., 2003, Grivennikova et al., 2001]

Реакциошюспособпость БН-группы Комплекса I

Для изучения реакционноспособности А/О-БН-группы мы выбрали три БН-модификатора: ЫЕМ, ДТНБ и ДТНП (2,2'-дитиобис-(5-нитропиридин)). ДТНБ и ДТНП обладают схожей структурой, однако ДТНБ обладает большей гидрофильностыо, чем ДТНП, и отрицательно заряжен в отличие от нейтрального ДТНП. Оба этих модификатора взаимодействуют с БН-группами по механизму тиол-дисульфидного обмена в отличие от алкилирующего реагента ЫЕМ. В качестве препарата мы выбрали субмитохондриальные частицы в связи с удобством их использования в исследованиях. На рис. 13 представлены характерные кинетические кривые, полученные с помощью модификатора ДТНБ. Видно, что активная форма фермента практически не ингибируется БН-реагентом, а деактивированный препарат полностью восстанавливает свою активность после добавления избытка дитиотреитола (ДТТ). Ингибирование Б-формы фермента подчиняется временной и концентрационной кинетике первого порядка (при использовании избытка ДТНБ по отношению к общему количеству БН-групп). Незначительное ингибирование активной формы фермента (-15%) связано с существованием равновесия между активной и деактивированной формами белка. Качественно аналогичные результаты были получены и для двух других реагентов (ИЕМ и ДТНП) за исключением обратимости ингибирования ДТТ при использовании ИЕМ.

0 2 4 6

Время (мин)

9 ¦

DTT Б

Рис. 13. Кинетика ингибирования Комплекса IДТНБ в составе вывернутых субмитохондриальных частиц.

А — Активированные (А-форма) или деактивированные (D-форма) СМЧ (1 мг/мл) инкубировали в среде, содержавшей 0,25 M сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Tris/Cl" (рН 8,0) и 200 мкМ ДТНБ при 15& deg-С. Остаточную NADH-оксидазную активность измеряли при 30& deg-С в той же среде без ДТНБ, содержавшей помимо перечисленного 100 мкМ NADH и разобщитель (грамицидин D, 0,05 мкг/мл). Где указано, вносили 5 мМ ДТТ. В случае деактивированного препарата во время регистрации активности наблюдалась выраженная лаг-фаза, в таком случае активность определяли после выхода на постоянный уровень (~ 30 с после начала реакции добавлением СМЧ). Б — Графики, полученные аналогично (А), для деактивированного препарата при различных концентрациях ДТНБ в полу-логарифмических координатах

В наших экспериментах предварительная обработка Комплекса I ДТНБ приводила к защите белка от последующего необратимого ингибирования КЕМ (рис. 14). Это указывает на то, что оба реагента взаимодействуют с одной и той же сульфгидрильной группой (группами). юо контроль+NEM +ДТНБ с последующей обработкой ДТТ

NEM +ДТНБ +NEM после ДТНБ

Рис. 14. Предотвращение необратимой модификации Комплекса I N-этилмалеимидом с помощью ДТНБ.

Деактивированный препарат СМЧ (1 мг/мл) инкубировали в среде, содержавшей 0,25 M сахарозу, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ Tris/Cl" (рН 8,0) в присутствии и в отсутствие 0,5 мМ ДТНБ в течение 10 мин при 25& deg-С. СМЧ осаждали центрифугированием и ресуспендировали в той же среде (без ДТНБ). Затем образцы обрабатывали NEM (0,5 мМ, 5 мин при 25& deg-С), осаждали и вновь суспендировали в среде, содержавшей 5 мМ ДТТ (где указано & laquo-+ДТТ»-) для удаления ДТНБ. NADH-оксидазную активность измеряли при 30°, как описано выше (см. рис. 13)

Мы сравнили реакционноспособность по отношению к A/D-SH-rpynne двух сходных по химическому строению и механизму реакции (тиол-дисульфидный обмен) модификаторов — ДТНБ и ДТНП (табл. 4). Удобным параметром для оценки реакционноспособности соединения является константа скорости его взаимодействия с A/D-SH-группой. Для определения этой константы мы использовали большой избыток ингибитора по отношению к количеству фермента. Через определенные промежутки времени из смеси отбирали пробы фермента для определения активности. Далее строили зависимость In Vo/Vt от времени, которая представляла собой прямую, тангенс угла наклона которой численно равен наблюдаемой константе скорости псевдопервого порядка. Чтобы перейти к истинной константе скорости второго порядка необходимо разделить значение наблюдаемой константы скорости на использованную концентрацию ингибитора.

Так как выбранные нами ингибиторы обладают различной реакционноспособностью по отношению к нейтральному низкомолекулярному тиолу (ДТТ), то нам представлялось целесообразным нормировать ингибирующую способность модификаторов к их относительной реакционноспособности по отношению к & laquo-стандартному»- тиолу. Из таблицы видно, что нормированная константа скорости реакции ДТНП с A/D-SH-группой в -14 раз больше таковой для ДТНБ (0,72 и 0,05 соответственно). Такой результат можно ожидать, если A/D-SH-группа находится в окружении относительно гидрофобных и/или отрицательно заряженных групп. Ранее в нашей лаборатории было показано, что AoD-переход влияет на ЫАОН: убихинон-редуктазную реакцию, но не на восстановление искусственных акцепторов электронов (феррицианид, гексааминорутений), взаимодействующих с гидрофильной частью фермента [Sled and Vinogradov, 1993]. Эти факты позволяют предположить, что A/D-SH-группа расположена в непосредственной близости к убихинон-связывающему участку (участкам), вероятно, на границе раздела фаз мембрана/матрикс митохондрии. Если это предположение верно, то увеличение отрицательного заряда на мембране должно приводить к уменьшению реакционноспособности АЮ-БН-группы (сдвиг кажущейся рКа) из-за электростатических взаимодействий, мешающих депротонированию тиола (стадия, необходимая для протекания реакции). Действительно, модификация мембраны отрицательно заряженным 80Б приводила к уменьшению реакционноспособности 8Н-группы белка, но не низкомолекулярного ДТТ. Наоборот, увеличение ионной силы приводило к увеличению реакционноспособности благодаря вторичному солевому эффекту.

Также мы проверили возможность влияния на активность Комплекса I внутриклеточного дисульфида — глутатиона. Однако мы не наблюдали ингибирования ни активной, ни деактивированной форм фермента окисленным глутатионом.

Таблица 4. Реакционноспособность различных БН-реагентов по отношению к АЛ)-8Н-группе Комплекса I (25& deg-С)

БН-реагент Константа скорости второго порядка (М*'-мин"'-104) Относительная реакционно

Ингибирование Комплекса I Реакция с ДТТа (*дтт) способность гт) кд

ДТНБ (стандартная среда)6 0,30 6,0 0,05 КС1 (100 мМ) в 0,70 7,0 0,10 БОБ (200 мкМ) 0,17 6,0 0,03

ДТНП (стандартная среда)6 50 69 0,72 КС1(100мМ)в 100 80 1,25 ЗЭБ (200 мкМ) 25 69 0,36

Окисленный глутатион не ингибирует не определяли

10 мМ, 75 мин, рН 8,0)6 аИзмсреиия проводили с использованием 1 мкМ ДТТ и 10 мкМ ДТНБ или ДТНП в стандартной среде измерения (см. рис. 13) при рН 7,0. При этом значении рН реакция протекает со скоростью, достаточно медленной для достоверного измерения константы скорости. бКонстапты скорости определяли, как описано в рис. 13. Концентрации ДТНБ и ДТНП были 200 мкМ и 1 мкМ, а содержание белка в пробах — 1 мг/мл и 10 мкг/мл соответственно.

Другие соли (ТМаС1, ЯиС1, ацетат Ыа+) оказывали практически такой же эффект на скорости реакций

Также нами было сделано предположение о возможно высоком значении кажущейся рКа АЛ> 8Н-группы вследствие влияния отрицательного заряда поверхности мембраны. Мы измерили рН-зависимость реакционноспособности АЮ-БН-группы по отношению к ДТНБ (рис. 15). Действительно, оказалось, что эта 8Н-группа обладает аномально высоким значением рКа (> 10) определить которое невозможно, так как не удается достичь выхода кривой на плато вплоть до значения рН 11. Эти данные подтверждают наше предположение о расположении АЛЭ-БН-группы в непосредственной близости от гидрофобных и/или отрицательно заряженных групп.

Рис. 15. рН-Зависимость скорости взаимодействия АЯ)-8Н-грунпы с ДТНБ.

Деактивированный препарат СМЧ (1 мг/мл) обрабатывали 40 мкМ ДТНБ при 25°, как описано в подписи к рис. 13, и из графиков в полу-логарифмических координатах находили значение константы скорости псевдо-первого порядка

Таким образом, мы показали, что А/О-БН-группа локализована в обращенной к митохондриалыюму матриксу части Комплекса I. Реакционноспособность АЛ> 8Н-группы по отношению к различным БН-реагентам, а также ее зависимость от рН, ионной силы и модификации мембраны с помощью 808 позволяют предположить, что АЮ-БН-группа находится в примембранном слое (граница раздела фаз мембрана/матрикс) в окружении гидрофобных и/или отрицательно заряженных групп. Структурные перестройки в белке, происходящие при А< ->0-переходе, можно представить следующим образом. Активная форма фермента содержит протежированную форму АЛ> 8Н-группы, которая не реагирует с 8Н-модификаторами, так как протонированный атом серы практически не обладает нуклеофильными свойствами. Деактивация фермента приводит к изменению локального окружения АЛ> 8Н-группы, например, смене гидрофобной среды на гидрофильную. В этом окружении АЛ> 8Н-группа переходит в форму меркаптид-аниона, отличающегося высокой реакционноспособностью по отношению как к алкилирующим реагентам (ИЕМ), так и модификаторам, действующим по механизму тиол-дисульфидного обмена (ДТНБ, ДТНП). Эта модель находится в соответствии с данными о том, что при щелочных значениях рН 0-> А-переход значительно замедляется. Возможным объяснением полученных данных могло бы быть и то, что А/0−8Н-группа находится не в примембранном слое, а в окружении гидрофобных и/или отрицательно заряженных аминокислот гидрофильного домена Комплекса I. Однако это кажется нам маловероятным — как уже упоминалось ранее, А< ->Э-переход затрагивает только ту часть молекулы, которая находится на терминальном участке пути электронов (на уровне связывания убихинона), и не влияет на реакции восстановления искусственных акцепторов, которые происходят в гидрофильном домене. Окончательное выяснение расположения А/0−8Н-группы будет возможно только после установления ее принадлежности к определенной субъединице Комплекса I.

Отсутствие ингибирования Комплекса I глутатионом в наших экспериментах противоречит данным, полученным Тэйлор и соав. [Taylor et al., 2003], где сообщалось об обратимом глутатионилировании 51 и 75 кДа-субъединиц Комплекса I, приводящем к ингибированию ротенон-чувствительной активности и повышению уровня продукции супероксида. Вероятно, разногласия данных двух лабораторий могут быть связаны с различиями в получаемых препаратах фермента и экспериментальных условиях. Отсутствие ингибирования Комплекса I окисленным глутатионом, однако, не исключает возможности влияния соотношения GSSG/GSH на активность фермента. Например, GSH может защищать A/D-SH-rpynny Комплекса I от модификации другими SH-соединениями по конкурентному механизму.

Изменение свойств A/D-SH-группы является, по-видимому, не единственным признаком, отличающим две формы фермента. Высокая энергия активации, характеризующая AoD-переход белка, указывает на существование значительных структурных перестроек в молекуле во время перехода.

Недавно Ушаковой и соавт. было показано, что мутации 29,9 кДа-субъединицы фермента из N. crassa [Ushakova et al., 2005], гомологичной В13-субъединице Комплекса I млекопитающих, влияет на кинетику AoD-перехода. Мы полагаем, что существование двух форм Комплекса I может оказаться существенным для ряда регуляторных воздействий (фосфорилирование под действием протеинкиназ [Р Papa et al., 1996, Scacco et al., 2000, Papa et al., 2002, Chen et al., 2004, Schulenberg et al., 2003], нитрозилирование и другие известные и неизвестные ковалентные модификации фермента). Структурная гетерогенность митоходриального Комплекса I может быть причиной различной чувствительности отдельных аминокислот к посттрансляционной модификации. выводы

1. Каналообразующий антибиотик аламетицин вызывает набухание митохондрий сердца крысы, не приводящее к разрушению внутренней и внешней митохондриальных мембран.

2. Внутренняя мембрана митохондрий после обработки аламетицином становится свободно проницаемой для низкомолекулярных соединений (NADH, АТР, фосфат, сукцинат), но не ферментов матрикса митохондрии. Обработанные аламетицином митохондрии полностью сохраняют аконитазную и изоцитратдегидрогеназную активности.

3. Аламетицин не влияет на активности Комплекса I и АТРазы в составе препарата субмитохондриальных частиц. Его использование позволяет измерять активности внутримитохондриальных ферментов: ротенон-чувствительную NADH-оксидазу, ЫАОН: убихинон-редуктазу, олигомицин-чувствительную АТРазу, аконитазу и изоцитратдегидрогеназу.

4. SH-группа (группы), меняющая свою реакционноспособность в зависимости от состояния Комплекса I (А- или D-форма фермента), локализована на обращенной в сторону митохондриального матрикса части белка.

5. Реакционноспособность этой группы (групп) по отношению к различным SH-реагентам соответствует модели, согласно которой цистеиновый остаток расположен в примембранном слое внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 99−448 082, 02−04−48 679, 05−04−48 809, 03−04−48 202, 06−04−48 931), Программы поддержки ведущих научных школ (гранты № 00−15−97 798 и НШ-596. 2003. 4), Шведской Королевской Академии Наук (грант № 12 557) и NIH Fogarty International Research Collaboration Award (FIRCA) grant 1R03TW006041.

Автор выражает глубокую благодарность Виноградову Андрею Дмитриевичу за руководство в работе над диссертацией и Гривенниковой Вере Георгиевне за руководство над курсовой и дипломной работами. Автор признателен Бакеевой Лоре Евгеньевне за помощь в получении электронных микрофотографий. Автор благодарит Гаврикову Элеонору Владимировну за помощь в работе с SH-реагентами и Дениса Калашникова за помощь в обработке данных, а также всех сотрудников лаборатории за дружескую обстановку. Также автор благодарен коллективу кафедры биохимии биологического факультета за полученные знания и творческую атмосферу.

1. Бакеева, JI.E., Северина И. И., Скулачев В. П., Ченцов Ю. С., Ясайтис A.A. (1971) Митохондрии. Структура и функции в норме и патологии, Наука, Москва, стр. 67−84.

2. Виноградов А. Д. (2001) Комплекс I дыхательной цепи: структура, редокс-компоненты и возможные механизмы трансформации энергиии. Биохимия, 66, 1346−1360.

3. Виноградов А. Д., Гаврикова Э. В., Гривенникова В. Г., Жарова Т. В., Захарова Н. В. (1999) Каталитические свойства митохондриальной КА0Н: убихинон-оксидоредуктазы (Комплекса I). Биохимия, 64, 174−193.

4. Галкин A.C., Гривенникова В. Г., Виноградов А. Д. (2001) Стехиометрический коэфициент Н*/2е~ КА0Н: убихинон-редуктазной реакции Комплекса I субмитохондриальных частиц. Биохимия, 66, 537−548.

5. Гривеникова, В.Г., Виноградов, А.Д. (2003) Митохондриальный Комплекс I. Успехи биол. хим., 43, 19−58.

6. Гривенникова, В.Г., Виноградов, А.Д. (2005) Генерация супероксид-радикала NADH: убихинон оксидоредуктазой митохондрий сердца. Биохимия, 70, 150−159.

7. Дженкс В. (1972) Катализ в химии и энзшюлогии, Мир, Москва, стр. 65−79.

8. Ермишкин Jl. Н., Григорьев П. А., Ильясов Ф. Э. (1988) Короткоживущие подсостояния аламетицинового канала. Биологические мембраны, 5, 544−550.

9. Ермишкин Jl. Н., Зильберштейн А. Я. (1982) Ионные каналы, образуемые антибиотиками. Структура и свойства. Итоги науки и техники. Биофизика мембран, 2, 83−160.

10. Маклашина, Е.О., Следь В. Д., Виноградов А. Д. (1994) Гистерезисное поведение Комплекса I митохондрий сердца быка: кинетические и термодинамические параметры медленного обратимого перехода из неактивного в активное состояние. Биохимия, 59, 946−957.

11. Торчинский Ю. М. (1977) Сера в белках, Наука, Москва, стр. 13−14.

12. Торчинский Ю. М. (1977) Сера в белках, Наука, Москва, стр. 157.

13. Торчинский Ю. М. (1977) Сера в белках, Наука, Москва, стр. 204−209.

14. Balaban, R.S., Nemoto, S., and Finkel, Т. (2005) Mitochondria, oxidants, and aging. Cell, 120, 483−495.

15. Barron, E.S.G. (1951)Adv. EnzymoL, 11, 201.

16. Boekema, E.G., van Heel, M., and van Bruggen, E.F.J. (1984) Three-dimentional structure of bovine NADH: ubiquinone oxidoreductase of the mitochondrial respiratory chain. Biochim. Biophys, Acta, 787, 19−26.

17. Bottcher, В., Scheide, D., Hesterberg, M., Nagel-Steger, L., and Friedrich, T. (2002) A novel, enzymatically active conformation of the Escherichia coli NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I). J. Biol. Chem., 277, 17 970−17 977.

18. Boyer, P.D. (1954) Spectrophotometric Study of the Reaction of Protein Sulfhydryl Groups with Organic Mercurials. J. Amer. Chem. Soc., 76, 4331−4337.

19. Brewer, C.F., and Riehm, J.P. (1967) Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Analyt. Biochem., 18, 248−255.

20. Brody, S., and Mickolajczyk, S. (1988) Neurospora mitochondria contain an acyl-carrier protein. Eur. J. Biochem., 173, 353−359.

21. Burbaev, D. Sh., Moroz, I.A., Kotlyar, A.B., Sled, V.D., and Vinogradov, A.D. (1989) Ubisemiquinone in the NADH-ubiquinone reductase region of the mitochondrial respiratory chain. FEBS Letters, 254, 47−51.

22. Butterworth, P.H.W., Baum, H., and Porter, J.W. (1967) A modification of the Ellman procedure for the estimation of protein sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys., 118, 716−723.

23. Caroll, J., Shannon, R.J., Fearnley, I.M., Walker, J., and Hirst, J. (2002) Definition of the nuclear encoded protein composition of bovine heart mitochondrial complex I: Identification of two new subunits. J. Biol. Chem., 277,5031 1−50 317.

24. Chance, B., and Nishimura, M. (1967) Sensitive measurements of changes of hydrogen ion concentration. Methods Enzymol., 10, 641−650.

25. Chance, B., and Williams, G.R. (1955) Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem., 217, 409−428.

26. Chen, R., Fearnley, I.M., Peak-Chew, S.Y., and Walker, J.E. (2004) The phosphorylation of subunits of complex I from bovine heart mitochondria, J. Biol. Chem., 279,26 036−26 045.

27. Chinard, F.P., and Hellerman, L. (1954) «Determination of Suljhydryl Groups in Certain Biologycal Substances» in «Methods of Biochemical Analysis», vol. 1, New York, «Interscience Publishers, Inc. «, pp. 1−26.

28. Cleland, W.W., Thompson, V.W., and Barden, R.E. (1969) Isocitrate dehydrogenase (TPN-specific) from pig heart. Methods Enzymol., 13, 30−33.

29. Crane, F.L., Glenn, J.L., and Green, D. (1956) Studies on the electon transfer system. IV. The electron transfer particles. Biochim. Biophys. Acta., 22, 475−487.

30. Cremona, T., and Kearney, E.B. (1965) Studies on the respiratory chain-linked reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase. X. Reactions with sulfhydryl reagents. J. Biol. Chem., 240, 3645−3652.

31. Cronan, J.E., Fearnley, I.M., and Walker, J.E. (2005) Mammalian mitochondria contain a soluble acyl carrier protein FEBS Let., 579, 4892−4896.

32. De Rey-Pailhade, J. (1888) C. r. Acad. Sci. Paris, 106, 1683.

33. Ellman, G.L. (1958) A colorimetric method for determining low concentrations of mercaptans. Arch. Biochem. Biophys., 74, 443−450

34. Ellman, G.L. (1959) Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys., 82, 70−77.

35. Estabrook, R.W., et al. (1968) Flavins andflavoproteins, Tokyo, pp. 268−279.

36. Fearnley, I.M., Carroll, J., Shannon, R.J., Runswick, M.J., Walker, J.E., and Hirst, J. (2001) GRIM-19, a cell death regulatory gene product, is a subunit of bovine mitochondrial NADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I). J. Biol. Chem., 276, 38 345−38 348.

37. Finel, M., Skehel, J.M., Albracht, S.P., Fearnley, I.M., and Walker, J.E. (1992) Resolution of NADH: ubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria into two subcomplexes, one of which contains the redox centers of the enzyme. Biochemistry, 31, 11 425−11 434.

38. Friedrich, T. (1998) The NADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I) from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1364, 134−146.

39. Friedrich, Т., and Bottcher, B. (2004) The gross structure of the respiratory complex I: a Lego System. Biochim. Biophys. Acta, 1608, 1−9.

40. Galante, Y., and Hatefi, Y. (1978) Resolution of complex I and isolation of NADH dehydrogenase and an iron-sulfur protein. Methods Enzymol., 53, 15−21.

41. Galkin, A.S., Grivennikova, V.G., and Vinogradov, A.D. (1999) -*H+/2e stoichiometry in NADH-quinone reductase reactions catalyzed by bovine heart submitochondrial particles. FEBS Lett., 451, 157−161.

42. Gavrikova, E.V., Grivennikova, V.G., Sled, V.D., Ohnishi, Т., and Vinogradov, A.D. (1995) Kinetics of the mitochondrial three-subunit NADH-dehydrogenase interaction with hexaamminoruthenium (III). Biochim. Biophys. Acta, 1230, 23−30.

43. Gavrikova, E.V., and Vinogradov, A.D. (1999) Active/de-active state transition of the mitochondrial complex I as revealed by specific sulfhydril group labeling. FEBSLett., 455, 36−40.

44. Gornal, A.G., Bardawill, C.J., and David, M.M. (1949) Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. Biol. Chem., 177, 751−766.

45. Gostimskaya, I.S., Cecchini, G., and Vinogradov, A.D. (2006) Topography and chemical reactivity of the active-inactive transition-sensitive SH-group in the mitochondrial NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I). Biochim. Biophys. Acta, 1757, 1155−1161.

46. Gostimskaya, I.S., Grivennikova, V.G., Zharova, T.V., Bakeeva, L.E., and Vinogradov, A.D. (2003) In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem., 313, 46−52.

47. Grassetti, D.R., and Murray, J.F. Jr. (1969) The use of 2,2'-dithiobis-(5-nitropyridine) as a selective reagent for the detection of thiols. J. Chromatogr., 41, 121−123.

48. Gregory, J.D. (1955) The Stability of N-Ethylmaleimide and its Reaction with Sulfhydryl Groups. J. Amer. Chem. Soc., 77, 3922−3923.

49. Grivennikova, V.G., Kapustin, A.N., and Vinogradov, A.D. (2001) Catalytic activity of NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex 1) in intact mitochondria. J. Biol. Chem., 276, 9038−9044.

50. Grivennikova, V.G., Maklashina, E.O., Gavrikova, E.V., and Vinogradov, A.D. (1997) Interaction of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase with rotenone as related to the enzyme active/inactive transition. Biochim. Biophys. Acta, 1319, 223−232.

51. Grivennikova, V.G., Maklashina, E.O., Gavrikova, E.V., and Vinogradov, A.D. (1997) Interaction of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase with rotenone as related to the enzyme active/inactive transition. Biochim. Biophys. Acta, 1319,223−232.

52. Grivennikova, V.G., Serebryanaya, D.V., Isakova, E.P., Belozerskaya, T.A., and Vinogradov, A.D. (2003) Active/de-active transition of NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I) in the mitochondrial membrane of Neurospora crassa. Biochem. J., 369, 619−626.

53. Grivennikova, V.G., Kapustin, A.N., and Vinogradov, A.D. (2001) Catalytic activity of NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) in intact mitochondria, evidence for the slow active/inactive transition. J. Biol. Chem., 276, 9038−9044.

54. Grivennikova, V.G., Roth, R., Zakharova, N.V., Hagerhall, C., and Vinogradov, A.D. (2003) The mitochondrial and prokaryotic proton-translocating NADH: ubiquinone oxidoreductases: similarities and dissimilarities of the quinone-junction sites. Biochim. Biophys. Acta, 1607, 79−90.

55. Grivennikova, V.G., Ushakova, A.V., Cecchini, G., and Vinogradov, A.D. (2003) Unidirectional effect of lauryl sulfate on the reversible NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I). FEBSLett., 549, 39−42.

56. Grivennikova, V.G., and Vinogradov, A.D. (2006) Generation of superoxide by the mitochondrial Complex I. Biochim. Biophys. Acta., 1757, 553−61.

57. Guenebaut, V., Schlitt, A., Weiss, H., and Leonard, K. (1998) Consistent structure between bacterial and mitochondrial NADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I). J. Mol. Biol., 276, 105−112.

58. Gutman, M., Mersmann, H., Luthy, J., and Singer, T.P. (1970) Action of sulfhydryl inhibitors on different forms of the respiratory chain-linked reduced nicotinamide-adenine dinucleotide dehydrogenase. Biochemistry, 9, 2678−2687.

59. Hanke, W., and Boheim, G. (1980) The lowest conductance state of the alamethicin pore. Biochim. Biophys. Acta, 596, 456−462.

60. Hatefi, Y. (1978) Preparation and properties of NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I). Methods Enzimol, 53, 11−14.

61. Hatefi Y., and Rieske J.S. (1967) Preparation and properties of DPNH-coenzyme Q reductase (Complex I of the respiratory chain). Methods Enzimol., 10, 235−239.

62. Hellerman, L, Chinard, F.P., and Deitz, V.R. (1943) Protein Sulfhydryl Groups And The Reversible Inactivation Of The Enzyme Urease. The Reducing Groups Of Egg Albumin And Of Urease. J. Biol. Chem., 147, 443−462.

63. Hinchliffe, P., and Sazanov, L.A. (2005) Organization of iron-sulfur clusters in respiratory complex I. Science, 309, 771−774.

64. Hofhaus, G., Weiss, H., and Leonard, K. (1991) Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J. Mol. Biol., 221, 1027−1043.

65. Hopkins, F.G. (1921) On an Autoxidisable Constituent of the Cell. Biochem. J., 15,286−305.

66. Hopkins, F.G. (1929) On Glutathione: A Reinvestigation. J. Biol. Chem., 84, 269−320.

67. Jacob, J., and Cafiso, D.S. (1997) Mechanism of voltage-gating in alamethicin: NMR studies of structurial variants. Biophys. J., 72, A-190, Tu-Pos300.

68. Jacobus, A., and Saks, V. (1982) Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation. Arch. Biochem. Biophys., 219, 167−178.

69. Jones, L.R., Maddock, S.W., and Besch, H.R., Jr. (1980) Unmasking effect of alamethicin on the (Na+, K+)-ATPase, P-adrenergic receptor-coupled adenylate cyclase, and cAMP- dependent protein kinase activities of cardiac sarcolemmal vesicles. J. Biol. Chem., 255, 9971−9980.

70. Kaduk, C., Dathe, M., and Bienert, M. (1998) Functional modification of alamethicin ion channels by substitution of glutamine-7, glycine-11 and proline-14. Biochim. Biophys. Acta, 1373, 137−146.

71. Kolyar, A.B., Albracht, S.P.J., and van Spanning, R.J.M. (1998) Comparison of energization of complex I in membrane particles from Paracoccus denitrificans and bovine heart mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1365, 53−59.

72. Kotlyar, A.B., Sled, V.D., and Vinogradov, A.D. (1992) Effect of Ca2±ions on the slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase. Biochim. Biophys. Acta, 1098, 144−150.

73. Kotlyar, A.B., and Vinogradov, A.D. (1990) Slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase. Biochim. Biophys. Acta., 1019, 151−158.

74. Legler, G. (1975) 4,4-Dinitrodiphenyldisulfides of different charge type as probes for the electrostatic environment of sulfhydryl groups. Biochim. Biophys. Acta, 405, 136−143.

75. Lehninger, A.L. (1951) Phosphorylation coupled to oxidation of dihydrodiphosphopyridine nucleotide. J. Biol. Chem., 190, 345−359.

76. Leonard, K., Haiker, H., and Weiss, H. (1987) Three-dimentional structure of NADH: ubiquinone reductase (complex I) from Neurospora mitochondria determined by electron microscopy of membrane crystals. J. Mol. Biol., 194, 277−286.

77. Lindley, H. (1960) A study of the kinetics of the reaction between thiol compounds and chloroacetamide. Biochem. J., 74, 577−584.

78. Lindley, H. (1962) The reaction of thiol compounds and chloroacetamide. 2. The reaction between chloroacetamide and cysteine peptides. Biochem. J., 82, 418−425.

79. Luzikov, V.N., and Romashina, L.V. (1972) Studies on stabilization of the oxidative phosphorylation system. II. Electron transfer-dependent resistance of succinate oxidase and NADH oxidase systems of submitochondrial particles to proteinases and cobra venom phospholipase. Biochim. Biophys. Acta, 267, 37−47.

80. MacDonnell, L.R., Silva, R.B., and Feeney, R.E. (1951) The sulfhydryl groups of ovalbumin. Arch. Biochem. Biophys., 32, 288−299.

81. Maklashina, E., Kotlyar, A.B., and Cecchini, G. (2003) Active/de-active transition of respiratory complex I in bacteria, fungi, and animals. Biochim. Biophys. Acta, 1606,95−103.

82. Maklashina, E., Sher, E., Zhou, H. -Z., Gray, M.O., Karliner, J.S., and Cecchini, G. (2002) Effect of anoxia/reperfusion on the reversible active/de-active transition of NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) in rat heart. Biochim. Biophys. Acta, 1556, 6−12.

83. Martin, D.R., and Williams, R.J.P. (1976) Chemical nature and sequence of alamethicin. Biochem. J., 153, 181−190.

84. Mathew, M. K, and Balaram, P. (1983) A helix dipole model for alamethicin and related transmembrane channels. FEBSLett., 157, 1−5.

85. Mickolajczyk, S., and Brody, S. (1990) De novo fatty acid synthesis mediated by acyl-carrier protein in Neurospora crassa mitochondria. Eur. J. Biochem., 187, 431−437.

86. Minakami, S., Schindler, F.J., and Estabrook, R.W. (1964) Hydrogen Transfer Between Reduced Diphosphopyridine Nucleotide Dehydrogenase And The Respiratory Chain. II. An Initial Lag In The Oxidation Of Reduced Diphosphopyridine Nucleotide. J. Biol. Chem., 239, 2049−2054.

87. Minakami, S., Schindler, F.J., and Estabrook, R.W. (1964) Hydrogen Transfer between Reduced Diphosphopyridine Nucleotide Dehydrogenase and the Respiratory Chain. I. Effect Of Sulfhydryl Inhibitors And Phospholipase. J. Biol. Chem., 239, 2042−2048.

88. Morris, R.O., and King, T.E. (1962) Thermal Denaturation of the Heart Muscle Preparation with Respect to Its Capacity for DPNH Oxidation. Biochemistry, 1, 1017−1024.

89. Papa, S., Sardanelli, A.M., Cocco, T., Speranza, F., Scacco, S.C., and Technikova-Dobrova, Z. (1996) The nuclear-encoded 18 kDa (IP) AQDQ subunit of bovine heart complex I is phosphorylated by the mitochondrial cAMP-dependent protein kinase. FEBSLett., 379, 299−301.

90. Papa, S., Scacco, S., Sardanelli, A.M., Petruzzella, V., Vergari, R., Signorile, A., and Technikova-Dobrova, Z. (2002) Complex I and the cAMP cascade in human physiopathology, Biosci. Rep., 22, 3−16.

91. Reddy, S., Jones, A.D., Cross, C.E., Wong, P. S. -Y., and van der Vliet, A. (2000) Inactivation of creatine kinase by S-glutathionylation of the active-site cysteine residue. Biochem. J., 347, 821−827.

92. Reusser, F. (1967) Biosynthesis of antibiotic U-22,324, a cyclic polypeptide. J. Biol. Chem., 242, 243−247.

93. Riddles, P.W., Blakeley, R.L., and Zerner, B. (1979) Ellman’s reagent: 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)~a reexamination. Analyt. Biochem., 94, 75−81.

94. Ritov, V. B., Tverdislova, I.L., Avakyan, T. Yu., Menshikova, E.V., Leikin, Yu.N., Bratkovskaja, L.B., and Shimon, R.G. (1992): Alamethicin-induced pore formation in biological membranes. Gen. Physiol. Biophys., 11,49−58.

95. Runswick M.J., Fearnley I.M., Skehel J.M., and Walker J.E. (1991) Presence of an acyl carrier protein in NADH: ubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria. FEBS Lett., 286, 121−124.

96. Sackmann, U., Zensen, R., Rohlen, D., Jahnke, U., and Weiss, H. (1991) The acyl carrier protein in Neurospora crassa mitochondria is subunite of NADH: ubiquinone reductase (Complex I). Eur. J. Biochem., 200, 463−469.

97. Saks, V.A., Kupriyanov, V.V., and Luzikov, V.N. (1972) Some peculiarities of the steady-state kinetics of electron transfer in submitochondrial particles. A kinetic model based on the idea of activation on the respiratory chain induced by electron transfer. Biochim. Biophys. Acta, 283,42−53.

98. Sazanov, L.A., and Hinchliffe, P. (2006) Structure of the hydrophilic domain of respiratory complex I from Thermus thermophilus. Science, 311, 1430−1436.

99. Sazanov, L.A., Peak-Chew, S.Y., Fearnley, I.M., and Walker, J.E. (2000) Resolution of the membrane domain of bovine complex I into subcomplexes: implications for the structural organization of the enzyme. Biochemistry, 39, 7229−7253.

100. Scacco, S., Vergari, R., Scarpulla, R.C., Technikova-Dobrova, Z., Sardanelli, A., Lambo, R., Lorusso, V., and Papa, S. (2000) cAMP-dependent phosphorylation of the nuclear encoded 18-kDa (IP) subunit of respiratory complex I and activation of the complex in serum-starved mouse fibroblast cultures. J. Biol. Chem., 275, 17 578−17 582.

101. Schneider, R., Massow, M., Lisowsky, T., and Weiss, H. (1995) Different respiratory-defective phenotypes of Nenrospora crassa and Sacaromyces cerevisiae after inactivation of the gene encoding the mitochondrial acyl carrier protein. Curr. Genet., 29, 10−17.

102. Schulenberg, B., Aggeler, R., Beechem, J.M., Capaldi, R.A., and Patton, W.F. (2003) Analysis of steady-state protein phosphorylation in mitochondria using a novel fluorescent phosphosensor dye. J. Biol. Chem., 278, 27 251−27 255.

103. Slater, E.C. (1950) The dihydrocozymase-cytochrome c reductase activity of heartmuscle preparation. Biochem. J., 46, 499−503.

104. Sled, V.D., and Vinogradov, A.D. (1993) Kinetics of the mitochondrial NADH: ubiquinone oxidoreductase interaction with hexaamminoruthenium (III). Biochim. Biophys. Acta, 1141, 262−268.

105. Starostin, A.V., Butan, R., Borisenko, V., James, D.A., Wenschuh, H., Sansom, M.S.P., and Wooley, G.A. (1999) An anion-selective analog of the channel-forming peptide alamethicine. Biochemistry, 38, 6144−6150.

106. Taylor, E.R., Hurrell, F., Shannon, R., Lin, T. -K., Hirst, J., and Murphy, M.P. (2003) J. Biol. Chem., 278, 19 603−19 610.

107. Ushakova, A.V., Duarte, M., Vinogradov, A.D., Videira, A. (2005) The 29.9 kDa subunit of mitochondrial complex I is involved in the enzyme active/de-active transitions. J. Mol. Biol., 351, 327−333.

108. Ushakova, A.V., Grivennikova, V.G., Ohnishi, T., and Vinogradov, A.D. (1999) Triton X-100 as a specific inhibitor of the mammalian NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I). Biochim. Biophys. Acta, 1409, 143- 153.

109. Vinogradov, A.D. (1993) Kinetics, control, and mechanism of ubiquinone reduction by the mammalian respiratory chain-linked NADH-ubiquinone reductase. J. Bioenerg. Biomembr., 25, 367−375.

110. Vodyanoy, I., Hall, J.E., Balasubramanian, T.M., and Marshall, G.R. (1982) Two purified fractions of alamethicin have different conductance properties. Biochim. Biophys. Acta, 684, 53−58.

111. Wikstrom, M. (1984) Two protons are pumped from the mitochondrial matrix per electron transferred between NADH and ubiquinone. FEBSLett., 169, 300−304.

112. Zaharova, N.V., Zharova, T.V., and Vinogradov, A.D. (1999) Kinetics of transhydrogenase reaction catalyzed by the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I) imply more than one catalytic nucleotide-binding sites. FEBS Lett., 444,211−216.

113. Zensen, R., Husmann, H., Schneider, R., Peine, T., and Weiss, H. (1992) De novo synthesis and desaturation of fatty acids at the mitochondrial acyl-carrier protein, a subunit of NADH: ubiquinone oxidoreductase in Neurospora crassa. FEBS Let., 310, 179−181.

114. Zharova, T.V., and Vinogradov, A.D. (1997) A competitive inhibition of the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) by ADP-ribose. Biochim. Biophys. Acta., 1320,256−264.

выводы

1. Каналообразующий антибиотик аламетицин вызывает набухание митохондрий сердца крысы, не приводящее к разрушению внутренней и внешней митохондриальных мембран.

2. Внутренняя мембрана митохондрий после обработки аламетицином становится свободно проницаемой для низкомолекулярных соединений (NADH, АТР, фосфат, сукцинат), но не ферментов матрикса митохондрии. Обработанные аламетицином митохондрии полностью сохраняют аконитазную и изоцитратдегидрогеназную активности.

3. Аламетицин не влияет на активности Комплекса I и АТРазы в составе препарата субмитохондриальных частиц. Его использование позволяет измерять активности внутримитохондриальных ферментов: ротенон-чувствительную NADH-оксидазу, ЫАОН: убихинон-редуктазу, олигомицин-чувствительную АТРазу, аконитазу и изоцитратдегидрогеназу.

4. SH-группа (группы), меняющая свою реакционноспособность в зависимости от состояния Комплекса I (А- или D-форма фермента), локализована на обращенной в сторону митохондриального матрикса части белка.

5. Реакционноспособность этой группы (групп) по отношению к различным SH-реагентам соответствует модели, согласно которой цистеиновый остаток расположен в примембранном слое внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 99−448 082, 02−04−48 679, 05−04−48 809, 03−04−48 202, 06−04−48 931), Программы поддержки ведущих научных школ (гранты № 00−15−97 798 и НШ-596. 2003. 4), Шведской Королевской Академии Наук (грант № 12 557) и NIH Fogarty International Research Collaboration Award (FIRCA) grant 1R03TW006041.

Автор выражает глубокую благодарность Виноградову Андрею Дмитриевичу за руководство в работе над диссертацией и Гривенниковой Вере Георгиевне за руководство над курсовой и дипломной работами. Автор признателен Бакеевой Лоре Евгеньевне за помощь в получении электронных микрофотографий. Автор благодарит Гаврикову Элеонору Владимировну за помощь в работе с SH-реагентами и Дениса Калашникова за помощь в обработке данных, а также всех сотрудников лаборатории за дружескую обстановку. Также автор благодарен коллективу кафедры биохимии биологического факультета за полученные знания и творческую атмосферу.

ПоказатьСвернуть

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Способы измерения активности ферментов в интактных митохондриях.

Аламетицин как инструмент для изучения внутримитохондриальных ферментов.

Препараты Комплекса I и катализируемые ими реакции.

Структура фермента.

Гистерезисное поведение Комплекса 1.

Возможные способы регулирования фермента in vivo.

Реакционноспособность SH-групп в белках.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Препаративные методы.

Выделение митохондрий сердца быка.

Получение субмитохондриалъных частиц.

Получение препарата активированных и деактивированных субмитохондриалъных частиц.

Получение препарата изолирован}юго Комплекса 1.

Получение препарата митохондрий сердца крысы.

Получение препарата митохондрий, обработанных аламетицином.

Подготовка препарата митохондрий к электронной микроскопии.

Аналитические методы.

Измерение малат/глутамат-оксидазной реакции и величины дыхательного контроля.

Измерение NADH: Ql-pedyKma3Hou активности.

Измерение NADH-оксидазной активности.

Измерение изоцитратдегидрогеназной активности.

Измерение аконитазной активности.

Измерение сукцинат-оксидазной активности.

Измерение АТРазной активности.

Изучение набухания митохондрий по изменению светорассеивания.

Определение белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние аламетицина на свойства препаратов митохондрий, субмитохондриальных частиц и изолированного Комплекса 1.

Влияние ионов магния на NADH-оксидазную активность митохондрий.

Ультраструктура митохондрий сердца крысы, обработанных аламетицином.

Аконитазная и изоцитратдегидрогеназная активности митохондрий сердца крысы до и после обработки аламетицином.

Кинетика деактивации Комплекса I в митохондриях и субмитохондриальных частицах.

Локализация SH-группы, меняющей реакционноспособность при деактивации Комплекса I.

Общее содерэ/саниереакционноспособных SH-групп в препаратах митохондрий сердца крысы и СМЧ сердца быка.

Реакционноспособность SH-группы Комплекса 1.

ВЫВОДЫ.

Список литературы

1. Бакеева, J1.E., Северина И. И., Скулачев В. П., Ченцов Ю. С., Ясайтис A.A. (1971) Митохондрии. Структура и функции в норме и патологии, Наука, Москва, стр. 67−84.

2. Виноградов А. Д. (2001) Комплекс I дыхательной цепи: структура, редокс-компоненты и возможные механизмы трансформации энергиии. Биохимия, 66, 1346−1360.

3. Виноградов А. Д., Гаврикова Э. В., Гривенникова В. Г., Жарова Т. В., Захарова Н. В. (1999) Каталитические свойства митохондриальной КА0Н: убихинон-оксидоредуктазы (Комплекса I). Биохимия, 64, 174−193.

4. Галкин A.C., Гривенникова В. Г., Виноградов А. Д. (2001) Стехиометрический коэфициент Н*/2е КА0Н: убихинон-редуктазной реакции Комплекса I субмитохондриальных частиц. Биохимия, 66, 537−548.

5. Гривеникова, В.Г., Виноградов, А.Д. (2003) Митохондриальный Комплекс I. Успехи биол. хим., 43, 19−58.

6. Гривенникова, В.Г., Виноградов, А.Д. (2005) Генерация супероксид-радикала NADH: убихинон оксидоредуктазой митохондрий сердца. Биохимия, 70, 150−159.

7. Дженкс В. (1972) Катализ в химии и энзшюлогии, Мир, Москва, стр. 65−79.

8. Ермишкин Jl. Н., Григорьев П. А., Ильясов Ф. Э. (1988) Короткоживущие подсостояния аламетицинового канала. Биологические мембраны, 5, 544−550.

9. Ермишкин Jl. Н., Зильберштейн А. Я. (1982) Ионные каналы, образуемые антибиотиками. Структура и свойства. Итоги науки и техники. Биофизика мембран, 2, 83−160.

10. Маклашина, Е.О., Следь В. Д., Виноградов А. Д. (1994) Гистерезисное поведение Комплекса I митохондрий сердца быка: кинетические и термодинамические параметры медленного обратимого перехода из неактивного в активное состояние. Биохимия, 59, 946−957.

11. Торчинский Ю. М. (1977) Сера в белках, Наука, Москва, стр. 13−14.

12. Торчинский Ю. М. (1977) Сера в белках, Наука, Москва, стр. 157.

13. Торчинский Ю. М. (1977) Сера в белках, Наука, Москва, стр. 204−209.

14. Balaban, R.S., Nemoto, S., and Finkel, Т. (2005) Mitochondria, oxidants, and aging. Cell, 120, 483−495.

15. Barron, E.S.G. (1951)Adv. EnzymoL, 11, 201.

16. Boekema, E.G., van Heel, M., and van Bruggen, E.F.J. (1984) Three-dimentional structure of bovine NADH: ubiquinone oxidoreductase of the mitochondrial respiratory chain. Biochim. Biophys, Acta, 787, 19−26.

17. Bottcher, В., Scheide, D., Hesterberg, M., Nagel-Steger, L., and Friedrich, T. (2002) A novel, enzymatically active conformation of the Escherichia coli NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I). J. Biol. Chem., 277, 17 970−17 977.

18. Boyer, P.D. (1954) Spectrophotometric Study of the Reaction of Protein Sulfhydryl Groups with Organic Mercurials. J. Amer. Chem. Soc., 76, 4331−4337.

19. Brewer, C.F., and Riehm, J.P. (1967) Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Analyt. Biochem., 18, 248−255.

20. Brody, S., and Mickolajczyk, S. (1988) Neurospora mitochondria contain an acyl-carrier protein. Eur. J. Biochem., 173, 353−359.

21. Burbaev, D. Sh., Moroz, I.A., Kotlyar, A.B., Sled, V.D., and Vinogradov, A.D. (1989) Ubisemiquinone in the NADH-ubiquinone reductase region of the mitochondrial respiratory chain. FEBS Letters, 254, 47−51.

22. Butterworth, P.H.W., Baum, H., and Porter, J.W. (1967) A modification of the Ellman procedure for the estimation of protein sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys., 118, 716−723.

23. Caroll, J., Shannon, R.J., Fearnley, I.M., Walker, J., and Hirst, J. (2002) Definition of the nuclear encoded protein composition of bovine heart mitochondrial complex I: Identification of two new subunits. J. Biol. Chem., 277,5031 1−50 317.

24. Chance, B., and Nishimura, M. (1967) Sensitive measurements of changes of hydrogen ion concentration. Methods Enzymol., 10, 641−650.

25. Chance, B., and Williams, G.R. (1955) Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem., 217, 409−428.

26. Chen, R., Fearnley, I.M., Peak-Chew, S.Y., and Walker, J.E. (2004) The phosphorylation of subunits of complex I from bovine heart mitochondria, J. Biol. Chem., 279,26 036−26 045.

27. Chinard, F.P., and Hellerman, L. (1954) «Determination of Suljhydryl Groups in Certain Biologycal Substances» in «Methods of Biochemical Analysis», vol. 1, New York, «Interscience Publishers, Inc. «, pp. 1−26.

28. Cleland, W.W., Thompson, V.W., and Barden, R.E. (1969) Isocitrate dehydrogenase (TPN-specific) from pig heart. Methods Enzymol., 13, 30−33.

29. Crane, F.L., Glenn, J.L., and Green, D. (1956) Studies on the electon transfer system. IV. The electron transfer particles. Biochim. Biophys. Acta., 22, 475−487.

30. Cremona, T., and Kearney, E.B. (1965) Studies on the respiratory chain-linked reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase. X. Reactions with sulfhydryl reagents. J. Biol. Chem., 240, 3645−3652.

31. Cronan, J.E., Fearnley, I.M., and Walker, J.E. (2005) Mammalian mitochondria contain a soluble acyl carrier protein FEBS Let., 579, 4892−4896.

32. De Rey-Pailhade, J. (1888) C. r. Acad. Sci. Paris, 106, 1683.

33. Ellman, G.L. (1958) A colorimetric method for determining low concentrations of mercaptans. Arch. Biochem. Biophys., 74, 443−450

34. Ellman, G.L. (1959) Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys., 82, 70−77.

35. Estabrook, R.W., et al. (1968) Flavins andflavoproteins, Tokyo, pp. 268−279.

36. Friedrich, T. (1998) The NADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I) from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1364, 134−146.

37. Friedrich, Т., and Bottcher, B. (2004) The gross structure of the respiratory complex I: a Lego System. Biochim. Biophys. Acta, 1608, 1−9.

38. Galante, Y., and Hatefi, Y. (1978) Resolution of complex I and isolation of NADH dehydrogenase and an iron-sulfur protein. Methods Enzymol., 53, 15−21.

39. Galkin, A.S., Grivennikova, V.G., and Vinogradov, A.D. (1999) -*H+/2e stoichiometry in NADH-quinone reductase reactions catalyzed by bovine heart submitochondrial particles. FEBS Lett., 451, 157−161.

40. Gavrikova, E.V., Grivennikova, V.G., Sled, V.D., Ohnishi, Т., and Vinogradov, A.D. (1995) Kinetics of the mitochondrial three-subunit NADH-dehydrogenase interaction with hexaamminoruthenium (III). Biochim. Biophys. Acta, 1230, 23−30.

41. Gavrikova, E.V., and Vinogradov, A.D. (1999) Active/de-active state transition of the mitochondrial complex I as revealed by specific sulfhydril group labeling. FEBSLett., 455, 36−40.

42. Gornal, A.G., Bardawill, C.J., and David, M.M. (1949) Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. Biol. Chem., 177, 751−766.

43. Gostimskaya, I.S., Grivennikova, V.G., Zharova, T.V., Bakeeva, L.E., and Vinogradov, A.D. (2003) In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem., 313, 46−52.

44. Grassetti, D.R., and Murray, J.F. Jr. (1969) The use of 2,2'-dithiobis-(5-nitropyridine) as a selective reagent for the detection of thiols. J. Chromatogr., 41, 121−123.

45. Gregory, J.D. (1955) The Stability of N-Ethylmaleimide and its Reaction with Sulfhydryl Groups. J. Amer. Chem. Soc., 77, 3922−3923.

46. Grivennikova, V.G., Kapustin, A.N., and Vinogradov, A.D. (2001) Catalytic activity of NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex 1) in intact mitochondria. J. Biol. Chem., 276, 9038−9044.

47. Grivennikova, V.G., Maklashina, E.O., Gavrikova, E.V., and Vinogradov, A.D. (1997) Interaction of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase with rotenone as related to the enzyme active/inactive transition. Biochim. Biophys. Acta, 1319, 223−232.

48. Grivennikova, V.G., Maklashina, E.O., Gavrikova, E.V., and Vinogradov, A.D. (1997) Interaction of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase with rotenone as related to the enzyme active/inactive transition. Biochim. Biophys. Acta, 1319,223−232.

49. Grivennikova, V.G., Kapustin, A.N., and Vinogradov, A.D. (2001) Catalytic activity of NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) in intact mitochondria, evidence for the slow active/inactive transition. J. Biol. Chem., 276, 9038−9044.

50. Grivennikova, V.G., Ushakova, A.V., Cecchini, G., and Vinogradov, A.D. (2003) Unidirectional effect of lauryl sulfate on the reversible NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I). FEBSLett., 549, 39−42.

51. Grivennikova, V.G., and Vinogradov, A.D. (2006) Generation of superoxide by the mitochondrial Complex I. Biochim. Biophys. Acta., 1757, 553−61.

52. Guenebaut, V., Schlitt, A., Weiss, H., and Leonard, K. (1998) Consistent structure between bacterial and mitochondrial NADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I). J. Mol. Biol., 276, 105−112.

53. Gutman, M., Mersmann, H., Luthy, J., and Singer, T.P. (1970) Action of sulfhydryl inhibitors on different forms of the respiratory chain-linked reduced nicotinamide-adenine dinucleotide dehydrogenase. Biochemistry, 9, 2678−2687.

54. Hanke, W., and Boheim, G. (1980) The lowest conductance state of the alamethicin pore. Biochim. Biophys. Acta, 596, 456−462.

55. Hatefi, Y. (1978) Preparation and properties of NADH: ubiquinone oxidoreductase (Complex I). Methods Enzimol, 53, 11−14.

56. Hatefi Y., and Rieske J.S. (1967) Preparation and properties of DPNH-coenzyme Q reductase (Complex I of the respiratory chain). Methods Enzimol., 10, 235−239.

57. Hellerman, L, Chinard, F.P., and Deitz, V.R. (1943) Protein Sulfhydryl Groups And The Reversible Inactivation Of The Enzyme Urease. The Reducing Groups Of Egg Albumin And Of Urease. J. Biol. Chem., 147, 443−462.

58. Hinchliffe, P., and Sazanov, L.A. (2005) Organization of iron-sulfur clusters in respiratory complex I. Science, 309, 771−774.

59. Hofhaus, G., Weiss, H., and Leonard, K. (1991) Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J. Mol. Biol., 221, 1027−1043.

60. Hopkins, F.G. (1921) On an Autoxidisable Constituent of the Cell. Biochem. J., 15,286−305.

61. Hopkins, F.G. (1929) On Glutathione: A Reinvestigation. J. Biol. Chem., 84, 269−320.

62. Jacob, J., and Cafiso, D.S. (1997) Mechanism of voltage-gating in alamethicin: NMR studies of structurial variants. Biophys. J., 72, A-190, Tu-Pos300.

63. Jacobus, A., and Saks, V. (1982) Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation. Arch. Biochem. Biophys., 219, 167−178.

64. Kaduk, C., Dathe, M., and Bienert, M. (1998) Functional modification of alamethicin ion channels by substitution of glutamine-7, glycine-11 and proline-14. Biochim. Biophys. Acta, 1373, 137−146.

65. Kolyar, A.B., Albracht, S.P.J., and van Spanning, R.J.M. (1998) Comparison of energization of complex I in membrane particles from Paracoccus denitrificans and bovine heart mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1365, 53−59.

66. Kotlyar, A.B., Sled, V.D., and Vinogradov, A.D. (1992) Effect of Ca2±ions on the slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase. Biochim. Biophys. Acta, 1098, 144−150.

67. Kotlyar, A.B., and Vinogradov, A.D. (1990) Slow active/inactive transition of the mitochondrial NADH-ubiquinone reductase. Biochim. Biophys. Acta., 1019, 151−158.

68. Legler, G. (1975) 4,4-Dinitrodiphenyldisulfides of different charge type as probes for the electrostatic environment of sulfhydryl groups. Biochim. Biophys. Acta, 405, 136−143.

69. Lehninger, A.L. (1951) Phosphorylation coupled to oxidation of dihydrodiphosphopyridine nucleotide. J. Biol. Chem., 190, 345−359.

70. Leonard, K., Haiker, H., and Weiss, H. (1987) Three-dimentional structure of NADH: ubiquinone reductase (complex I) from Neurospora mitochondria determined by electron microscopy of membrane crystals. J. Mol. Biol., 194, 277−286.

71. Lindley, H. (1960) A study of the kinetics of the reaction between thiol compounds and chloroacetamide. Biochem. J., 74, 577−584.

72. Lindley, H. (1962) The reaction of thiol compounds and chloroacetamide. 2. The reaction between chloroacetamide and cysteine peptides. Biochem. J., 82, 418−425.

73. MacDonnell, L.R., Silva, R.B., and Feeney, R.E. (1951) The sulfhydryl groups of ovalbumin. Arch. Biochem. Biophys., 32, 288−299.

74. Maklashina, E., Kotlyar, A.B., and Cecchini, G. (2003) Active/de-active transition of respiratory complex I in bacteria, fungi, and animals. Biochim. Biophys. Acta, 1606,95−103.

75. Martin, D.R., and Williams, R.J.P. (1976) Chemical nature and sequence of alamethicin. Biochem. J., 153, 181−190.

76. Mathew, M. K, and Balaram, P. (1983) A helix dipole model for alamethicin and related transmembrane channels. FEBSLett., 157, 1−5.

77. Mickolajczyk, S., and Brody, S. (1990) De novo fatty acid synthesis mediated by acyl-carrier protein in Neurospora crassa mitochondria. Eur. J. Biochem., 187, 431−437.

78. Minakami, S., Schindler, F.J., and Estabrook, R.W. (1964) Hydrogen Transfer between Reduced Diphosphopyridine Nucleotide Dehydrogenase and the Respiratory Chain. I. Effect Of Sulfhydryl Inhibitors And Phospholipase. J. Biol. Chem., 239, 2042−2048.

79. Morris, R.O., and King, T.E. (1962) Thermal Denaturation of the Heart Muscle Preparation with Respect to Its Capacity for DPNH Oxidation. Biochemistry, 1, 1017−1024.

80. Papa, S., Scacco, S., Sardanelli, A.M., Petruzzella, V., Vergari, R., Signorile, A., and Technikova-Dobrova, Z. (2002) Complex I and the cAMP cascade in human physiopathology, Biosci. Rep., 22, 3−16.

81. Reddy, S., Jones, A.D., Cross, C.E., Wong, P. S. -Y., and van der Vliet, A. (2000) Inactivation of creatine kinase by S-glutathionylation of the active-site cysteine residue. Biochem. J., 347, 821−827.

82. Reusser, F. (1967) Biosynthesis of antibiotic U-22,324, a cyclic polypeptide. J. Biol. Chem., 242, 243−247.

83. Riddles, P.W., Blakeley, R.L., and Zerner, B. (1979) Ellman’s reagent: 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) a reexamination. Analyt. Biochem., 94, 75−81.

84. Ritov, V. B., Tverdislova, I.L., Avakyan, T. Yu., Menshikova, E.V., Leikin, Yu.N., Bratkovskaja, L.B., and Shimon, R.G. (1992): Alamethicin-induced pore formation in biological membranes. Gen. Physiol. Biophys., 11,49−58.

85. Runswick M.J., Fearnley I.M., Skehel J.M., and Walker J.E. (1991) Presence of an acyl carrier protein in NADH: ubiquinone oxidoreductase from bovine heart mitochondria. FEBS Lett., 286, 121−124.

86. Sackmann, U., Zensen, R., Rohlen, D., Jahnke, U., and Weiss, H. (1991) The acyl carrier protein in Neurospora crassa mitochondria is subunite of NADH: ubiquinone reductase (Complex I). Eur. J. Biochem., 200, 463−469.

87. Sazanov, L.A., and Hinchliffe, P. (2006) Structure of the hydrophilic domain of respiratory complex I from Thermus thermophilus. Science, 311, 1430−1436.

88. Sazanov, L.A., Peak-Chew, S.Y., Fearnley, I.M., and Walker, J.E. (2000) Resolution of the membrane domain of bovine complex I into subcomplexes: implications for the structural organization of the enzyme. Biochemistry, 39, 7229−7253.

89. Schulenberg, B., Aggeler, R., Beechem, J.M., Capaldi, R.A., and Patton, W.F. (2003) Analysis of steady-state protein phosphorylation in mitochondria using a novel fluorescent phosphosensor dye. J. Biol. Chem., 278, 27 251−27 255.

90. Slater, E.C. (1950) The dihydrocozymase-cytochrome c reductase activity of heartmuscle preparation. Biochem. J., 46, 499−503.

91. Sled, V.D., and Vinogradov, A.D. (1993) Kinetics of the mitochondrial NADH: ubiquinone oxidoreductase interaction with hexaamminoruthenium (III). Biochim. Biophys. Acta, 1141, 262−268.

92. Starostin, A.V., Butan, R., Borisenko, V., James, D.A., Wenschuh, H., Sansom, M.S.P., and Wooley, G.A. (1999) An anion-selective analog of the channel-forming peptide alamethicine. Biochemistry, 38, 6144−6150.

93. Taylor, E.R., Hurrell, F., Shannon, R., Lin, T. -K., Hirst, J., and Murphy, M.P. (2003) J. Biol. Chem., 278, 19 603−19 610.

94. Ushakova, A.V., Duarte, M., Vinogradov, A.D., Videira, A. (2005) The 29.9 kDa subunit of mitochondrial complex I is involved in the enzyme active/de-active transitions. J. Mol. Biol., 351, 327−333.

95. Ushakova, A.V., Grivennikova, V.G., Ohnishi, T., and Vinogradov, A.D. (1999) Triton X-100 as a specific inhibitor of the mammalian NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I). Biochim. Biophys. Acta, 1409, 143- 153.

96. Vinogradov, A.D. (1993) Kinetics, control, and mechanism of ubiquinone reduction by the mammalian respiratory chain-linked NADH-ubiquinone reductase. J. Bioenerg. Biomembr., 25, 367−375.

97. Vodyanoy, I., Hall, J.E., Balasubramanian, T.M., and Marshall, G.R. (1982) Two purified fractions of alamethicin have different conductance properties. Biochim. Biophys. Acta, 684, 53−58.

98. Wikstrom, M. (1984) Two protons are pumped from the mitochondrial matrix per electron transferred between NADH and ubiquinone. FEBSLett., 169, 300−304.

99. Zaharova, N.V., Zharova, T.V., and Vinogradov, A.D. (1999) Kinetics of transhydrogenase reaction catalyzed by the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I) imply more than one catalytic nucleotide-binding sites. FEBS Lett., 444,211−216.

100. Zharova, T.V., and Vinogradov, A.D. (1997) A competitive inhibition of the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) by ADP-ribose. Biochim. Biophys. Acta., 1320,256−264.

Заполнить форму текущей работой