Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии печени

Тип работы:
Диссертация
Предмет:
Биофизика
Страниц:
122


Узнать стоимость новой

Детальная информация о работе

Выдержка из работы

Актуальность работы. Оксид азота (N0) — двухатомная молекула, обладающая исключительным многообразием биологических функций. N0 проникает через плазматические мембраны, участвуя в передаче межклеточных сигналов, а также оказывает своё действие как вторичный посредник внутри клеток в составе внутриклеточных эффекторных систем, например, при проведении сигнала запрограммированной клеточной гибели — апоптоза. В зависимости от ряда условий N0 проявляет двойственные свойства в отношении процесса апоптоза. Критической детерминантой про-либо антиапоптотической роли N0 являются его концентрация, источник и тип клеток. Биохимический механизм, лежащий в основе про- и антиапоптотических свойств N0 определяется пересечением многих сигнальных систем, участвующих в проведении сигнала апоптоза с поверхности клеточной мембраны в ядро. Особое значение при реализации программы апоптоза играет взаимодействие сигнальной системы N0 и сфингоминлинового цикла (СФМ-цикл).

СФМ-цикл, а именно изменение активности его ферментов -сфингомиелиназ (СФМаз) и последующая генерация плейотропного медиатора — церамида являются ключевыми событиями ряда патофизиологичексих процессов в клетке, таких как клеточная гибель, пролиферация и дифференцировка (Hannun, 1994).

Функциональная взаимосвязь между сигнальными системами N0 и СФМ-цикла определяется общей субклеточной локализацией ферментов синтеза NO (Patel and Insel, 2009) и присутствием церамида и СФМаз (Zhang and Li, 2010) в структурных элементах плазматической мембраны — кавеолах и рафтах.

N0 генерируется в клетке специальными ферментами — NO-синтазами

NOS) (Moneada and Higgs, 1993). Генерация NO эндотелиальной синтазой

NO (eNOS) при низких концентрациях — один их механизмов ингибирования апоптоза, который запускается при активации рецепторов суперсемейства б фактора некроза опухоли, а (TNF-а) (TNF-R1) (Liu, 1999). В высоких концентрациях N0 способен индуцировать апоптоз per se. В основе этих противоположных эффектов могут лежать разные механизмы действия N0 при низких и высоких концентрациях (Brune, 2003, Liu and Stamler, 1999). В этой связи представляется исключительно значимой способность N0 регулировать клеточный уровень церамида. Исследования на клетках U939 и Т-лимфоцитах показали, что N0 ингибирует апоптотический ответ, индуцированный TNF-R1, подавляя способность этих рецепторов генерировать церамид (De Nadai et al., 2000).

В организме животных и человека обнаружено несколько типов СФМаз, ферментов гидролизующих СФМ с образованием церамида и фосфохолина. Решающую роль в апоптозе играют две изоформы: кислая лизосомальная (А-СФМаза) и нейтральная Mg -зависимая (N-СФМаза). А-СФМаза и N-СФМаза — мишени действия NO (Perrotta and Clementi, 2010), однако защита от апоптоза в лимфоидных клетках происходит вследствие ингибирования именно А-СФМазы. Возможно, такой механизм защиты от апоптоза распространяется и на другие типы клеток, так как подобные результаты получены также на дендритных клетках человека и мыши, а также на некоторых раковых клетках. В частности, генерация N0 ингибировала апоптоз в дендритных клетках, подвергнутых обработке апоптогенными дозами липополисахарида (LPS) in vitro, и в модели LPS-индуцированного сепсиса in vivo (Falcone et al., 2004) — кроме того, наблюдалось защитное действие NO in vitro и in vivo при воздействии химиотерапевтического агента цисплатина на модели опухолевой химиотерапии. Есть данные, что в процесс ингибирования СФМаз и защиты от апоптоза (Perrotta et al., 2007) вовлечена активация растворимой гуанилатциклазы (sGC), генерация циклогуанидинмонофосфата (cGMP) и активация cGMP-завиеимой протеинкиназы (Falcone et al., 2004, Perrotta et al., 2007).

При обработке клеток высокими дозами NO, например, в результате 7 продукции NO индуцибельной NOS (iNOS) при воспалении, наблюдается прямо противоположный эффект. На ряде клеточных линий показано, что высокие дозы N0 усиливают генерацию церамида А- и N-СФМазами, что приводит к гибели клеток по пути апоптоза (Takeda et al., 1999, Huwiler et al., 1999a, Pilane and LaBelle, 2004, Castillo et al., 2007). Механизмы, участвующие в активации СФМаз, не изучены, но явно отличны от механизма ингибирования этих ферментов, так как cGMP-независимы и для их реализации необходима активация каспазы-3 (Takeda et al., 1999, Huwiler et al., 1999a, Castillo et al., 2007), в которую, возможно, вовлечена генерация эйкозаноидов из арахидоновой кислоты (Pilane and LaBelle, 2004).

В случае N-СФМазы взаимодействие между NO и СФМ-циклом двунаправленное, так как активация eNOS может быть стимулирована продуктами, генерируемыми вследствие активации N-СФМазы, в основном, церамидом.

Церамид, активируемый либо А- либо N-СФМазой, вероятно, приводит к гибели клеток различными путями. Церамид, генерируемый А-СФМазой, обычно вовлечён в индукцию и развитие апоптоза, а церамид, генерируемый N-СФМазой в большинстве случаев не является апоптогенным. В контексте передачи сигнала NO, церамид, генерируемый N-СФМазой, метаболизируется в сфингозин, который может проявлять апоптогенные свойства или превращается в антиапоптогенный сфингозин-1-фосфат (SphlP), который, в свою очередь, способен стимулировать iNOS и генерацию NO, а NO, генерируемый таким образом, ингибирует активность и /или активацию обеих СФМаз. Таким образом может происходить ингибирование апоптоза, в соответствии с тем, что в итоге из церамида генерируемого N-СФМазой, образуется SphlP, который является важным регулятором клеточного роста, дифференцировки и ответа на индукторы воспаления (Kwon et al., 2001, De Palma et al., 2006, Perrotta and Clementi, 2010).

NO и СФМ-цикл связаны не только в передаче сигнала апоптоза. 8

Кросс-ток" между сигнальными путями NO/NOS и церамид/СФМазы с множеством обратных связей является общим для большинства систем, вовлеченных в процесс клеточной сигнализации, в том числе, контроля гомеостаза кальция, что выражается в участии этих систем во многих сложных патофизиологических клеточных процессах. Полная характеристика молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия сигнальных путей NO/NOS и церамид/СФМазы, могла бы способствовать пониманию их места в сложной сети других сигнальных систем и способов контроля процессов апоптоза, дифференцировки и воспаления.

Наглядный пример пересечения сигнальных систем N0 и СФМ-цикла -их активация при проведении токсического сигнала от TNF-a. Показано, что TNF-a влияет на рост и дифференцировку клеток, участвует в проведении иммунного ответа и в развитии многих патологических процессов, в том числе ишемии-реперфузии органов и тканей. Конкретная роль TNF-a в том или ином системном процессе определяется совокупностью биохимических и биофизических факторов, действующих параллельно с TNF-a. Активация СФМазы и изменение содержания активных форм кислорода (АФК) играют ключевую роль в механизме цитотоксического действия TNF-a. Ишемические повреждения, как правило сопровождаются повышением содержания TNF-a. В процессе реперфузии ишемизированного органа накапливается церамид, что определяется активацией СФМаз, сопровождающейся повышением содержания TNF-a в реперфузированном органе.

Однако N0 может и защищать клетки от токсического действия TNF-a. В экспериментах на iNOS-дефицитных мышах установлено, что iNOS может служить источником NO, оказывающим защитный эффект при окислительном шоке, вызванном TNF-a. Возможно, двойственное действие N0 проявляется также при ишемии-реперфузии.

Как правило, апоптоз наблюдается при реперфузии ишемизированного 9 органа. NO и TNF-a генерируются при ишемии и при реперфузии, но в разных концентрациях. Можно предположить, что в условиях ишемии N0, генерируемый iNOS, сдерживает проявление токсических свойств TNF-a, вызывающих апоптоз, а при реперфузии резкое повышение содержания TNF-a запускает программу воспалительного каскада, который не может контролироваться N0. Кроме того, значительное повышение содержания N0 при реперфузии также становится токсичным для клеток. Следует подчеркнуть, что одновременное повышение содержания цитокина и N0 может приводить к критическому накоплению апоптогенного церамида, реализующего программу клеточной гибели.

Взаимодействие сигнальных систем NO/NOS и церамид/СФМаза определяется окислительным статусом клетки. Это видно при проведении токсического сигнала TNF-a, поскольку он развивается в условиях окислительного стресса.

Показано, что NO и Ог'- в эквимолярных концентрациях образуют пероксинитрит, который является очень сильным оксидантом (Huie and Padmaja, 1993, Rubbo et al., 1994). При физиологических условиях продукция пероксинитрита минимальна и возможные отрицательные последствия его воздействия находятся под контролем системы эндогенной антиоксидантной защиты (Radi et al., 2002). Однако даже небольшое увеличение одновременной продукции N0 и О2& quot- приводит к образованию значительных количеств пероксинитрита: 10-кратное увеличение генерации N0 и 02'~ вызывает 100-кратное повышение продукции пероксинитрита. Такая ситуация возможна в условиях разнообразных патологий (Virag et al., 2003). Образование пероксинитрита обнаруживается при диабете, кардиологических, сосудистых, нейродегенеративных, онкологических заболеваниях.

Основное свойство цитотоксичности пероксинитрита — его способность вызывать перекисное окисление в мембранах (Radi et al., 1991), липосомах и липопротеинах, что приводит к образованию гидроперекисей липидов, диеновых конъюгатов и альдегидов (Denicola et al., 2005). Эти радикалы в свою очередь атакуют ненасыщенные жирные кислоты, генерируя дополнительные радикалы и приводя к развитию цепи свободнорадикальных реакций и деградации липидов мембран (Radi et al., 1991, Hogg and Kalyanaraman, 1999), повышая их проницаемость и текучесть (Richter, 1987). Пероксинитрит — сильный окислитель липопротеинов низкой плотности (ЛНП) (Leeuwenburgh et al., 1997). Модифицированные пероксинитритом ЛНП с высокой аффинностью к рецепторам вызывают аккумуляцию окисленных эфиров холестерина и формирование пенистых клеток, что является ключевым маркером раннего атерогенеза (Guy et al., 2001). Взаимодействие пероксинитрита с липидами мембран приводит также к образованию ряда нитропроизводных липидов (медиаторов при передаче биологических сигналов как при физиологических условиях, так и при развитии различных патологий). Пероксинитрит также реагирует с тиольными группами ряда белков, взаимодействуя с тиолами в активном центре ферментов.

Тем не менее N0 может также защищать от окислительного стресса: нейтрализует CV- и липопероксильные радикалы, регулирует работу супероксиддисмутазы (SOD) (Frank et al., 1999), ингибирует активность NADPH-оксидазы (Muzaffar et al., 2003) и цитохрома P450 (Minamiyama et al., 1997). Следовательно, при избытке 02'~ в присутствии NO развивается перекисное окисление, а в условиях высоких концентраций NO действие 02'~ нейтрализуется и перекисное окисление ингибируется (Miles et al., 1996).

Активность СФМаз также находится под контролем про- и антиоксидантных систем. На культурах клеток и в организме млекопитающих глутатион участвует в регуляции активности N-СФМазы: показано, что апоптоз в нейронах индуцируемый при активации N-СФМазы, вызывает изменения в окислительно-восстановительном состоянии клетки и/или метаболизме глутатиона (Lee et al., 2004). Также известно, что N-СФМаза активируется Н202 и ингибируется глутатионом (Liu et al., 1998).

Ii

Ингибирование продукции церамида антиоксидантами, и индукция оксидантами и прооксидантами определяют функцию активных форм кислорода (АФК) и глутатиона в регуляции первого шага в трансдукции сигнала по СФМ-пути. Более того, пониженный уровень глутатиона и повышенный церамида коррелируют с фрагментацией ДНК при апоптозе. Церамид вызывает дисфункцию митохондрий и индуцируют окислительный стресс (Singh et al., 1998). Очевидно, взаимосвязь между окислительной системой и СФМ-циклом, существующая в живых клетках, вносит существенный вклад в развитие апоптоза при кислород-зависимых патологиях, включая ишемические повреждения.

Поскольку сигнальные системы NO и СФМ-цикла активируются провоспалительными цитокинами, в первую очередь TNF-a, что сопровождается индукцией окислительного стресса, то естественным представляется изучение не только этих двух систем, N0 и СФМ-цикла, но и их зависимости от активации окислительных процессов и экспрессии TNF-a. Наиболее адекватной моделью для изучения последовательности активации и взаимосвязи двух сигнальных систем с уровнем продуктов ПОЛ и накоплением TNF-a является экспериментальная ишемия с последующей реперфузией, в нашем случае, печени.

Целью нашей работы было показать наличие взаимосвязи сигнальной системы N0 со СФМ-циклом и ПОЛ в норме и при проведении токсического сигнала TNF-a в условиях ишемии-реперфузии печени. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние соединений-доноров N0: динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ), нитрозоглутатиона (GSNO) и нитрита натрия (NaN02) на изменения параметров СФМ-цикла (активность СФМаз, уровень сфингомиелина (СФМ) и церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов.

2. На модели ишемии-реперфузии печени изучить изменения в содержании N0 в зависимости от сроков ишемии и последующей

12 реоксигенации.

3. Исследовать характер активности СФМаз и параметры ПОЛ (диеновые конъюгаты) в зависимости от длительности периодов ишемии и реперфузии.

4. Изучить изменения содержания ТЫБ-а в зависимости от сроков ишемии-реперфузии.

5. Изучить влияние ТКР-а на параметры СФМ-цикла (активность Ы-СФМазы и концентрацию церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.

6. Изучить влияние церамида на уровень ТОР-а и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей.

7. Исследовать состояние ДНК в ишемизированной печени и при реперфузии.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Между сигнальными системами N0 и СФМ-цикла в организме животных (печень мышей) существует взаимосвязь: соединения-доноры N0: ДНКЖ, ОБИО и №N02 влияют на параметры СФМ-цикла (активность N-СФМазы, уровень СФМ и церамида) в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов, при этом наблюдается зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла от механизма освобождения N0 из его доноров: ДНКЖ и GSNO, непосредственно содержащие N0 в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние сроки после их введения животным, а №N02, механизм образования N0 из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл только через несколько часов после инъекции.

2. Существует корреляция между изменением активности №СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров N0, что подтверждает свойства №СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

3. Ишемические повреждения печени и последующая реперфузия

13 приводят к повышению уровня содержания N0 в печени, наиболее выраженного при реперфузии.

4. В процессе ишемии-реперфузии наблюдается образование провоспалительного цитокина TNF-a, которое опережает изменения уровня содержания NO в печени.

5. Существует взаимное влияние TNF-a и СФМ-цикла: TNF-a модулирует активность N-СФМазы и приводит к образованию церамида и продуктов ПОЛ, а продукт СФМ-цикла, церамид, вызывает накопление TNF-a и продуктов ПОЛ в печени мышей.

6. При реперфузии наблюдается активация СФМ-цикла и ПОЛ и высокое содержание TNF-a и N0. В этих условиях развивается апоптоз, что подчёркивает взаимосвязь сигнальных систем NO, TNF-a и СФМ-цикла, в результате чего наблюдается совместный эффект этих сигнальных систем, приводящий к гибели клеток ишемизированного органа.

Научная новизна. Впервые проведено исследование in vivo влияния доноров N0: ДНКЖ, GSNO и NaN02 на СФМ-цикл. Показано, что введение животным доноров N0 приводит к изменениям параметров СФМ-цикла в зависимости от дозы и времени прошедшего после введения препаратов. Обнаружена корреляция между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров N0, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

Впервые методом ЭТСР-спектроскопии с использованием спиновой ловушки показано, что ишемические повреждения печени и последующая реперфузия приводят к повышению уровня содержания N0, наиболее выраженного при реперфузии. При этом показано, что накопление провоспалительного цитокина TNF-a опережает изменение уровня содержания NO в печени.

Показано наличие взаимного влияния TNF-a и компонентов СФМ-цикла в организме животных (печень мышей).

14

На фоне резкого повышения уровня N0 и ТЫБ-а при реперфузии ишемизированной печени наблюдается активация СФМ-цикла, сопровождающаяся развитием окислительного стресса и апоптоза.

Научно-практическая значимость. Результаты исследования имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания механизмов регуляции дифференцировки, пролиферации, апоптоза клеток в норме и при кислород-зависимых патологиях при участии сигнальных систем N0, СФМ-цикла и ПОЛ.

Обнаруженная нами взаимосвязь этих сигнальных систем свидетельствует о возможности влияния на клеточные процессы, находящиеся под контролем N0, путем воздействия на СФМ-цикл и ПОЛ. Например, активаторы и ингибиторы ключевых ферментов СФМ-цикла -кислой и нейтральной СФМаз — могут оказывать существенное влияние на эффективность терапии направленной на восстановление печени подвергнутой ишемии-реперфузии.

Предложен механизм проведения апоптотического сигнала при ишемии-реперфузии печени, заключающийся в накоплении ТКР-а и последующей активации СФМ-цикла и повышении концентрации N0, которые совместно индуцируют апоптоз в клетках печени. Таким образом, полученные нами данные могут быть использованы в медицине при разработке тактики лечения ряда заболеваний связанных с патологией ишемии-реперфузии, таких как инсульт, инфаркт, атеросклероз, а также при трансплантации органов с использованием препаратов нового поколения на основе ингибиторов СФМ-цикла.

Диссертационная работа выполнена в Институте биохимической физики им Н. М. Эмануэля РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ института, а также поддержана грантами & quot-Фундаментальные науки — медицине& quot- и РФФИ № 02−04 48 228.

Вклад автора. Личный вклад диссертанта состоял в проведении экспериментов, обобщении, анализе и трактовке полученного экспериментального материала, формулировании положений и выводов работы. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал во всех этапах исследований — от постановки эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Апробация диссертации и публикации. Основные результаты исследования по теме диссертации представлены в 3 статьях и 13 тезисах.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах.

Выводы

1. Показано наличие взаимосвязи между сигнальными системами N0 и СФМ-цикла в организме животных (печень мышей). Введение доноров N0: ДНКЖ, ОБЖ) и №N02 приводит к ингибированию СФМ-цикла в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов. При этом наблюдается зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла (активность И-СФМазы, уровень СФМ и церамида) от механизма освобождения N0 из его доноров: ДНКЖ и ОБМЭ, непосредственно содержащие N0 в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние, уже через 15 мин, сроки после их введения животным, а Ма1чЮ2, механизм образования N0 из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл только через 2 ч после инъекции.

2. Обнаружена корреляция между изменением активности! Ч-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введении доноров N0, что подтверждает свойства И-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

3. Ишемические повреждения печени и последующая реперфузия приводят к повышению уровня содержания N0 в печени, наиболее выраженного при реперфузии.

4. В процессе ишемии-реперфузии наблюдается образование провоспалительного цитокина ПЧГР-а, которое опережает изменения уровня содержания N0 в печени.

5. Показано наличие взаимного влияния ТЫБ-а и компонентов СФМ-цикла в организме животных (печень мышей). Внутрибрюшинное введение ТЫБ-а модулирует активность М-СФМазы, приводит к накоплению проапоптотического агента церамида и продуктов ПОЛ. В свою очередь, продукт СФМ-цикла, церамид вызывает накопление в печени ТЫБ-а и продуктов ПОЛ.

6. На фоне резкого повышения уровня N0 и ТТчГР-а при реперфузии ишемизированной печени наблюдается активация СФМ-цикла,

97 сопровождающаяся развитием окислительного стресса. В этих условиях развивается апоптоз, что подчёркивает взаимосвязь сигнальных систем N0, ТЫБ-а и СФМ-цикла, в результате чего наблюдается совместный эффект этих сигнальных систем, приводящий к гибели клеток ишемизированного органа.

Заключение

Механизмы, по которым ишемия и последующая реперфузия вызывают апоптоз, могут включать секрецию TNF-a, накопление продуктов ПОЛ и активацию сигнальных систем N0 и СФМ-цикла. СФМ-цикл взаимодействует с другими сигнальными системами, такими, как система генерации активных форм кислорода, в том числе NO.

Особое значение во взаимодействии N0 со СФМ-циклом играет провоспалительный цитокин TNF-a, поскольку он способен модулировать как активность ферментов, синтезирующих NO, так и активность СФМаз, индуцирующих СФМ-цикл. В свою очередь, продукты реакций этих ферментов, N0 и церамид, влияют на экспрессию TNF-a. Кроме того, окислительный стресс и накопление продуктов ПОЛ, вызываемые TNF-a, являются основным звеном его цитотоксического действия. Пересечение во времени этих событий может привести к усилению проапоптотического сигнала, индуцируемого каким-либо фактором, в нашем случае, ишемией и последующей реперфузией. В связи с этим задачей нашего исследования явилось изучение сигнальных систем N0, СФМ-цикла и ПОЛ в норме и при проведении токсического сигнала TNF-a при патологии ишемии-реперфузии, что позволит более полно охарактеризовать механизм индукции апоптоза в клетках печени.

В настоящее время в литературе появились доказательства зависимости активности СФМаз от уровня N0. Исследования, проведенные на клеточных культурах, показали, что N0 в зависимости от концентрации и типа клеток способен как вызывать апоптоз, генерацию церамида и активировать СФМазы, так и ингибировать процесс апоптоза и блокировать синтез церамида. В свою очередь, церамид может повышать уровень экспрессии ферментов, продуцирующих N0, активировать их, приводить к накоплению нитритов и нитратов во внутриклеточной среде, или, наоборот, ингибировать NOS.

В нашей работе впервые исследовалось влияние соединений-доноров

90

N0 на СФМ-цикл в организме животных. Соединения-доноры N0: ДНКЖ, ОБЖ) и ЫаЖ& gt-2 в диапазоне исследованных концентраций ингибируют СФМ-цикл и ПОЛ в зависимости от дозы и времени, прошедшего после введения препаратов. Изменения параметров СФМ-цикла (активность Ы-СФМазы, уровень СФМ и церамида) определяются механизмом освобождения N0 из его доноров: ДНКЖ и 08& gt-Ю, непосредственно содержащие N0 в своей структуре, ингибируют параметры СФМ-цикла на ранние, уже через 15 мин, сроки после их введения животным, а №N02, механизм образования N0 из которого связан с метаболическими превращениями, ингибирует СФМ-цикл и ПОЛ только через 2 ч после инъекции. То есть, зависимость характера изменений параметров СФМ-цикла от природы донора может быть связана с тем, что №Ж)2 не является непосредственным донором N0, и на образование N0 из нитрита (N02″) необходимо время, а часть №Ж)2 выводится из организма.

Восстановление N02″ в N0 осуществляется в ходе нитритредуктазной реакции: N02″ + е& quot- -> N0. Эта реакция катализируется электронно-донорными системами с участием NADH, NADPH, флавопротеинов и цитохромоксидазы в митохондриях и с участием NADH, NADPH, флавопротеинов и цитохрома Р-450 в эндоплазматическом ретикулуме. В результате активации при гипоксии ферментативных и неферментативных систем, участвующих в образовании N0 из ионов N02″, происходит активация цикла N0: Ь-аргининЖ)-> Ж)27М)з"->N0. Биологический смысл

94сопряженности Са -мобилизующей и нитритредуктазной активности в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме заключается в более эффективном использовании N0 и продуктов его метаболизма (N02- и N03-) в регуляции концентрации Са. Эта способность субклеточных структур может иметь особое значение при развитии патологических процессов, протекающих на фоне ишемии и гипоксии клеток тканей человека и животных. Ранее установлено, что умеренная гипоксия является одним из факторов, которые приводят организм в состояние повышенной мобилизации. Отмечены многочисленные изменения, которые можно было бы отнести к компенсаторно-приспособительным. Так, активация цикла N0 и увеличение содержания N0 и NO2 может приводить к индукции перераспределения белков из растворимого в мембранно-связанное состояние, в котором активируются многие ферментные системы, в том числе, участвующие в синтезе АТФ, а также осуществляющие передачу сигнала в клетках и активацию процессов пролиферации. Возможно, этот механизм лежит в основе компенсаторно-приспособительных изменений в ответ на гипоксию (Реутов и др., 2003).

Поскольку ишемия является широко распространенным повреждением печени при отравлениях, хирургических вмешательствах, в том числе и при трансплантации органа, знание биохимических механизмов, приводящих к гибели клеток ишемизированной печени, позволит обозначить новые пути к предупреждению или снижению повреждений органа в условиях недостатка кислорода.

Ранее при ишемии параметры СФМ-цикла и содержание N0 и TNF-a исследовали раздельно и в фиксированные сроки, преимущественно на клетках сердца, мозга и почек. Однако ни в одном из опубликованных исследований не проводилось комплексное изучение характера поведения сигнальных систем N0, СФМ-цикла, ПОЛ и TNF-a при индукции апоптоза в условиях ишемии печени и последующей ее реперфузии у животных.

В наших экспериментах установлено, что при ишемии первым значимым событием является накопление TNF уже через 15 мин после прекращения кровотока. Эти данные согласуются с данными экспериментов, проведенных на сердце и мозге, что ишемические повреждения сопровождаются повышением содержания TNF-a (Tuttolomondo et al., 2008). Изменения содержания N0 и активности СФМаз в печени происходят только спустя 30 мин после начала ишемии.

При изучении изменения активности СФМаз в ишемизированной печени и после ее реперфузии мы обнаружили резкое снижение активности

И-СОМазы на сроках ишемии 30−60 мин и повышение ее активности при реперфузии. А-СФМаза на начальные сроки ишемии (15 и 30 мин) ингибируется, а после 60 мин ишемии ее активность возрастает, превышая контрольный уровень в 1.8 раза. При последующей реперфузии активность этой изоформы фермента резко падает. То есть, при ишемии печени до 30 мин, при которой выживают все животные, снижена активность как 14-СФМазы, так и А-СФМазы, а после 60 мин ишемии, когда гибнет 80% животных, А-СФМаза активирована. По-видимому, на ранних сроках ишемии возможна защитная реакция организма, способная ингибировать активность СФМаз, в результате чего не происходит накопление критического уровня церамида. Это предположение находится в соответствии с нашими данными по введению животным доноров N0, которые показывают, что в исследованных концентрациях N0 ингибирует активность КГ-СФМазы и снижает уровень церамида в печени. При длительной, 60 мин ишемии, когда активирована одна из изоформ СФМазы (А-СФМаза), вероятность накопления проапоптического уровня церамида резко увеличивается, особенно при реперфузии, когда наблюдается активация и другой изоформы фермента (ТЧ-СФМазы). В этих условиях уровень церамида является достаточным для проведения сигнала апоптоза, в ходе которого погибает часть поврежденных клеток при реперфузии после 60 мин ишемии, что мы видим в своих экспериментах, анализируя состояние ДНК.

В статье (2Ьа1 е1 а1., 2009) методом масс-спектрометрии были изучены молекулярные виды сфингомиелинов и церамидов в процессе реперфузии ишемизированной печени. Общее количество церамидов и сфингомиелинов, в том числе и других сфинголипидов, значительно увеличивалось после 60 мин реперфузии. Через 6 ч после реперфузии содержание церамида и СФМ максимально повышалось по сравнению с контролем. Повышение содержания сфинголипидов определялось появлением новых молекулярных форм через 6 ч после реперфузии. Этот эффект авторы объясняют

93 возможным синтезом с1е поуо новых форм сфинголипидов, в то время как повышение содержания церамидов на ранних стадиях реперфузии, вероятнее всего, определяется Т№-а, который в значительных количествах накапливается в реперфузированном органе после ишемии. Таким образом, изменение количества и профиля молекулярных видов сфинголипидов, в основном СФМ и церамида, может быть определяющим звеном в ишемическом процессе с последующей реперфузией.

Накопление ТЫБ-а происходит как при ишемии, так и после реперфузии, однако деградация ДНК по типу апоптотической лестницы наблюдается только при реперфузии после 60 мин ишемии, когда активируется ЬГ-СФМаза, что приводит к накоплению проапоптотических агентов СФМ-цикла, и происходит резкое повышение содержания N0. В процессе реперфузии содержание N0 резко возрастает, в 2−5 раз при 15−30 мин реперфузии после 30 мин ишемии, и достигает семикратного увеличения через 60 мин реперфузии после 60 мин ишемии.

Для понимания механизма взаимодействия ТЫБ-а и СФМ-цикла при индукции апоптоза большое значение имеют наши данные о влиянии церамида на экспрессию ТЫТ-а в печени. Так, мы показали, что церамид вызывает накопление ТМР-а в печени животных. Эти данные дают возможность предположить, что образование церамида, индуцируемое эндогенным ТТЯБ-а в ишемизированной печени, может приводить к генерации новых порций ТИТ-а, который вновь, активируя СФМазу, приводит к накоплению церамида. Когда уровень церамида достигает критических значений, события в клетке завершаются апоптозом. Именно этот процесс возможен в ишемизированной печени после реперфузии. По такой же схеме могут взаимодействовать церамид и N0 в высоких концентрациях, который также индуцирует накопление церамида, а церамид, в свою очередь, индуцирует синтез N0. Активация при ишемии всех систем, связанных с усиленной генерацией церамида, на наш взгляд, является основным условием, при котором клетки печени входят в апоптоз в условиях ишемии-реперфузии.

Большой вклад в развитие ишемических повреждений вносят окислительные процессы в липидах. Ранее нами и другими исследователями была показана связь активности СФМ-цикла с окислительным статусом клеток (Цюпко и др., 2001). В своей работе мы обнаружили корреляцию между изменением активности N-СФМазы и окислительным статусом липидной фракции печени после введения соединений-доноров N0, что подтверждает свойства N-СФМазы в качестве кислород-зависимого фермента.

Наши результаты демонстрируют, что пусковым механизмом апоптоза при ишемии-реперфузии может быть накопление в ишемизированном органе TNF-a, который индуцирует накопление N0. Эти события активируют СФМазу, которая расщепляет СФМ до проапоптотического агента церамида. Чтобы уровень церамида достиг критических значений, содержание N0 и TNF-a должно быть высоким, особенно в процессе реперфузии, когда наблюдается деградация ДНК. В свою очередь, церамид, генерируемый при ишемии, способен поддерживать и даже увеличивать содержание NO и TNF-а. То есть, в критических условиях в клетке возможен активный процесс обратной регуляции. Вероятнее всего, именно он имеет место при вхождении клеток в апоптоз. Чтобы этот лавинообразный процесс остановить, необходимо прекратить генерацию церамида, то есть, ингибировать активность СФМаз.

Предложенный нами механизм индукции апоптоза в ишемизированной-реперфузированной печени позволяет рассмотреть новые препараты для предупреждения ишемических повреждений, как при пересадке донорской печени, так и при хирургических вмешательствах на печени. Такими новыми препаратами могут выступить ингибиторы СФМаз. На основании как представленных выше, так и полученных ранее данных об ингибировании in vivo природными антиоксидантами СФМазы, можно предположить, что широко известное противоишемическое действие различного типа антиоксидантов объясняется не только снижением интенсивности ПОЛ, но и их ингибирующим действием на СФМ-цикл. Блокирование СФМ-цикла не позволит развиваться апоптозу даже при наличии высокого содержания ТЫБ-а, который не способен самостоятельно вызывать апоптоз клеток печени. В то же время церамид и сфингозин индуцируют апоптоз во многих типах клеток даже в отсутствии ТЫБ-а. Поэтому в ишемизированном органе необходимо в первую очередь ингибировать активность СФМаз, которые участвуют в генерации индукторов апоптоза.

Показать Свернуть

Содержание

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Свойства N0 и его физиологическое действие

1.2. Двойственный эффект N0 при апоптозе

1.2.1. Апоптотические свойства N

1.2.1.1. Влияние N0 на функции митохондрий

1.2.2. Антиапоптотические свойства N

1.2.2.1. Ингибирование апоптоза сОМР-зависимым путем

1.2.2.2. Ингибирование активности каспаз Б-нитрозилированием

1.3. Про- и антиоксидантные свойства N

1.4. N0 и СФМ-цикл

1.4.1. СФМ-Цикл

1.4.2. Роль церамида в регуляции гибели клеток

1.4.2.1. Роль генерации N0 в клеточной гибели, индуцированной церамидом

1.4.2.2. N0 и ингибирование генерации церамида

1.4.2.3. Церамид и N0 при проведении сигнала апоптоза

1.4.3. Взаимосвязь сигнальных систем СФМ-цикла и окислительного стресса. Общие активаторы и ингибиторы

1.4.4. Взаимодействие N0, ТГчГР-а и СФМ-цикла при апоптозе

1.4.4.1. Функциональные свойства ТЫБ-а

1.4.4.2. ТЫБ-а и пероксидное окисление липидов

1.4.4.3. ТШ-а и СФМ-цикл

1.4.4.4. Роль N0 при передаче сигнала Т№"-а

1.5. N0 при ишемии-реперфузии

1.6. Роль ТЫБ-а при ишемии-реперфузии

Глава 2. Материалы и методы исследований

2.1. Экспериментальные модели

2.1.1. Ишемия печени

2.1.2. Введение доноров N0, ТЫБ-а и церамида животным

2. 2. Препаративные методы

2.2.1. Получение гомогената ткани

2.2.2. Экстракция липидов из субклеточных структур

2.2.3. Синтез нитрозотиолов и ДНКЖ

2.3. Аналитические методы

2.3.1. Определение активности СФМаз

2.3.2. Определение содержания белка в гомогенате

2.3.3. Анализ фосфолипидов и церамидов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ)

2.3.4. Анализ продуктов ПОЛ

2.3.5. Электрофорез низкомолекулярной ДНК в агарозном геле

2.3.6. Идентификация ТИБ-а

2.3.7. Идентификация N

2.3.8. Статистический анализ

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Изучение влияния соединений-доноров N0 на показатели СФМ-цикла (активность Ы-СФМазы, содержание СФМ и церамида) и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей

3.1.1. Влияние ДНКЖ на СФМ-цикл

3.1.2. Влияние ОБИО на СФМ-цикл

3.1.3. Влияние №N02 на СФМ-цикл

3.1.4. Влияние доноров N0 на показатели ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей

3.2. Изучение влияния ТЫР-а на показатели СФМ-цикла (активность 1Г-СФМазы и содержание церамида) и ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей

3.2.1. Влияние ТЫБ-а на показатели СФМ-цикла: активность Ы-СФМазы и содержание церамида в печени мышей

3.2.2. Влияние ТЫБ-а на показатели ПОЛ в печени мышей

3.3. Изучение влияния церамида на содержание ТЫБ-а и продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты) в печени мышей

3.3.1. Влияние церамида на содержание Т№-а в печени мышей

3.3.2. Влияние церамида на содержание продуктов ПОЛ в печени мышей

3.4. Изучение содержания ТЫБ-а, продуктов ПОЛ, N0, и активности СФМаз при ишемии-реперфузии печени

3.4.1. Определение содержания ТЫБ-а при ишемии-реперфузии

3.4.2. Определение содержания диеновых конъюгатов при ишемии-реперфузии

3.4.3. Определение содержания N0 при ишемии-реперфузии

3.4.4. Изменение активности СФМаз при ишемии-реперфузии

3.4.4.1. Изменение активности И-СФМазы при ишемии-реперфузии

3.4.4.2. Изменение активности А-СФМазы при ишемии-реперфузии

3.4.5. Определение деградации ДНК при ишемии-реперфузии

Список литературы

1. Алесенко A.B. Роль метаболитов сфингомиелинового цикла в проведении сигналов пролиферации, дифференцировки и смерти клеток // Биологические мембраны. 1999. Т. 16, № 2. С. 242−255.

2. Ванин А. Ф. К вопросу о стабильности динитрозильного комплекса железа с цистеином как кандидата на роль эндотелиального фактора релаксации кровеносных сосудов // Биохимия. 1995. Т. 60, № 2. С. 308−314.

3. Ванин А. Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7, № 11. С. 7−12.

4. Гесслер H.H., Гомбоева С. Б., Шумаев К. Б., Быховский В. Я., Ланкин В. З. Механизм соокисления & szlig--каротина и полиеновых жирных кислот // Докл. РАН. 2001. Т. 63, № 3. С. 402−405.

5. Горрен А. К. Ф., Майер Б. Универсальная и комплексная энзимология синтазы оксида азота // Биохимия. 1998. Т. 63, № 7. С. 870−880.

6. Заббарова И. В., Шумаев К. Б., Ванин А. Ф., Губкин A.A., Петрова Н. Э., Руге Э. К. Взаимодействие ферритина и миоглобина как индукторов перекисного окисления липидов. Роль активных форм кислорода и азота // Биофизика. 2004. Т. 49, № 4. С. 659−665.

7. Реутов В. П., Сорокина Е. Г. NO-синтазная и нитритредуктазная компоненты цикла оксида азота // Биохимия. 1998. Т. 63, № 7. С. 1029−1040.

8. Реутов В. П., Сорокина Е. Г., Косицын Н. С., Охотин В. Е. Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикличности: ретроспективный анализ идей, принципов и концепций. М.: Едиториал УРСС. 2003. 96 с.

9. Стальная И. Д., Гаришвили Т. Г. Метод определения диеновых конъюгатов ненасыщенных жирных кислот // Современные методы в биохимии. М.: Медицина. 1997. С. 63−64.

10. Шпигель С., Гувилер О., Мензелеев Р. Н., Оливера А., Томас Д., Ти 3., Вонг Ф. Роль сфингозин-1-фосфатав клеточном росте, дифференциации и смерти клеток // Биохимия. 1998. Т. 63, № 1. С. 78−88.

11. Шумаев К. Б., Рууге Э. К., Ланкин В. З., Ванин А. Ф., Гомбоева С. Б., Беленков Ю. Н. Механизм ингибирования свободнорадикального окисления (3-каротина S-нитрозоглутатионом и динитрозильными комплексами железа // Докл. РАН. 2001. Т. 379, № 5. С. 702−704.

12. Шумаев К. Б., Заббарова И. В., Рууге Э. К., Ванин А. Ф. Влияние активных форм кислорода и азота на высвобождение ионов железа из ферритина и синтез динитрозильных комплексов железа // Биофизика. 2003. Т. 48, № 1. С. 5−10.

13. Adam-Clages S., Adam D., Wiegmann К., Struve S., Kolanus W., Schneider-Mergener J., and Kronke M. FAN, a novel WD-repeat protein, couples the p55 TNF-receptor to neutral sphingomyelinase // Eur. Cytokine Netw. 1996. Vol. 7. P. 93−124.

14. Albina J.E., Cui S., Mateo R.B., and Reichner J.S. Nitric oxide-mediated apoptosis in murine peritoneal macrophages // J. Immunol. 1993. Vol. 150. P. 5080−5085.

15. Allen D.A., Harwood S., Varagunam M., Raftery M.J., and Yaqoob M.M. High glucose-induced oxidative stress causes apoptosis in proximal tubular epithelial cells and is mediated by multiple caspases // FASEB J. 2003. Vol. 17. P. 908−910.

16. Arana L., Gangoiti P., Ouro A., Trueba M., and Gomez-Munoz A. Ceramide and ceramide 1-phosphate in health and disease // Lipids Health. Dis. 2010. Vol. 5. P. 9−15.

17. Ariga T., Jarvis W.D., and Yu R.K. Role of sphingolipid-mediated cell death in neurodegenerative diseases // J. Lipid. Res. 1998. Vol. 39, 1. P. 1−16.

18. Ballou L. R., Laulederkind S. J., Rosloniec E. F., and Raghow R. Ceramide signalling and the immune response // Biochim. Biophis. Acta. 1996. Vol. 1301. P. 273−287.

19. Bilzer M., and Gerbes A. J. Preservation injury of the liver: mechanisms and novel therapeutic strategies // J. Hepatol. 2000. Vol. 32, 3. P. 508−115.

20. Bligh E.G., and Dyer W.Y. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. 1959. Vol. 37. P. 911−923.

21. Bloodsworth A., O’Donnell V.B., Freeman B.A. Nitric oxide regulation of free radical- and enzyme-mediated lipid and lipoprotein oxidation // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000. Vol. 20, 7. P. 1707−1715.

22. Boese M., Mordvintcev P.I., Vanin A.F., Busse R., and Mulsh A. S-nitrosation of serum albumin by dinitrosyl-iron complex // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, 49. P. 29 244−29 249.

23. Brekke O.L., Sagen E., and Bjerve K.S. Specificity of endogenous fatty acid release during tumor necrosis factor-induced apoptosis in WEHI 164 fibrosarcoma cells // J. Lipid Res. 1999. Vol. 40, 12. P. 2223−2233.

24. Brugg B., Michel P.P., Agid Y., and Ruberg M. Ceramide induces apoptosis in cultured mesencephalic neurons // J. Neurochem. 1996. Vol. 66. P. 733−739.

25. Briine B. Nitric oxide: NO apoptosis or turning it ON? // Cell Death Differ. 2003. Vol. 10, 8. P. 864−869.

26. Castillo S.S., Levy M., Thaikoottathil J.V., and Goldkorn T. Reactive nitrogen and oxygen species activate different sphingomyelinases to induce apoptosis in airway epithelial cells // Exp. Cell Res. 2007. Vol. 313. P. 26 802 686.

27. Cauwels A., Bultinck J., and Brouckaert P. Dual role of endogenous nitric oxide in tumor necrosis factor shock: induced NO tempers oxidative stress // Cell Mol. Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 1632−1640.

28. Cauwels A., and Brouckaert P. Survival of TNF toxicity: dependence on caspases and NO // Arch. Biochem. Biophys. 2007. Vol. 462. P. 132−139.

29. Chen T., Zamora R., Zuckerbraun B., and Billiar T.R. Role of nitric oxide in liver injury // Curr. Mol. Med. 2003. Vol. 3. P. 519−526.

30. Chun S.Y., Eisenhauer K.M., Kubo M., and Hsueh A.J. Interleukin-1 beta suppresses apoptosis in rat ovarian follicles by increasing nitric oxide production // Endocrinology. 1995. Vol. 136. P. 3120−3127.

31. Chung H. T, Pae H. O, Choi B. M, Billiar T. R, and Kim Y.M. Nitric oxide as a bioregulator of apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 282, 5. P. 1075−1079.

32. Coffey M.J., Coles B. and O’Donnell V.B. Interactions of nitric oxide-derived reactive nitrogen species with peroxidases and lipoxygenases // Free Radic. Res. 2001. Vol. 35. P. 447−464.

33. Colombini M. Ceramide channels and their role in mitochondria-mediated apoptosis // Biochim. Biophys. Acta. 2010. Vol. 1797. P. 1239−1244.

34. Cui S., Reichner J. S., Mateo R. B., and Albina J. E. Activated murine macrophages induce apoptosis in tumor cells through nitric oxide-dependent or -independent mechanisms // Cancer Res. 1994. Vol. 54, 9. P. 2462−2467.

35. Degli Esposti M., and McLennan H. Mitochondria and cells produce reactive oxygen species in virtual anaerobiosis: relevance to ceramide-induced apoptosis // FEBS Lett. 1998. Vol. 430. P. 338−342.

36. Delaney C.A., Tyrberg B., Bouwens L., Vaghef H., Hellman B., and Eizirik D.L. Sensitivity of human pancreatic islets to peroxynitrite-induced cell dysfunction and death // FEBS Lett. 1996. Vol. 394. P. 300−306.

37. Denicola A., and Radi R. Peroxynitrite and drug-dependent toxicity // Toxicology. 2005. Vol. 208. P. 273−288.

38. Dobrowsky R.T., Werner M.N., Castellino A.M., Chao M.V., and Hannun Y.A. Activation of the sphingomyelin cycle through the low-affinity neurotrophin receptor// Science. 1994. Vol. 265. P. 1596−1599.

39. Drapier J. C., Wietzerbin J., and Hibbs J. B. Interferon-gamma and tumor necrosis factor induce the L-arginine-dependent cytotoxic effector mechanism in murine macrophages // Eur. J. Immunol. 1988. Vol. 18, 10. P. 1587−1592.

40. Dressier K.A., Mathias S., and Kolesnik R. Tumor necrosis factor-alpha activates the sphingomyelin signal transduction pathway in a cell-free system // Science. 1992. Vol. 255. P. 1715−1718.

41. Fehsel K., Kroncke K. D., Meyer K. L., Huber H., Wahn V., and Kolb -Bachofen V. Nitric oxide induces apoptosis in mouse thymocytes // J. Immunol. 1995. Vol. 155, 6. P. 2858−2865.

42. Festjens N., Kalai M., Smet J., Meeus A., Van Coster R., Saelens X., and Vandenabeele P. Butylated hydroxyanisole is more than a reactive oxygen species scavenger // Cell Death Differ. 2006. Vol. T3, 1. P. 166−169.

43. Fortenberry J.D., Owens M.L., Brown M.R., Atkinson D., and Brown L.A. Exogenous nitric oxide enhances neutrophil cell death and DNA fragmentation // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1998. Vol. 18. P. 421−428.

44. France-Lanord V., Brugg B., Michel P.P., Agid Y., and Ruberg M. Mitochondrial free radical signal in ceramide-dependent apoptosis: a putative mechanism for neuronal death in Parkinson’s disease // J. Neurochem. 1997. Vol. 69. P. 1612−1621.

45. Franzen R., Pfeilschifter J., and Huwiler A. Nitric oxide induces neutral ceramidase degradation by the ubiquitin/proteasome complex in renal mesangial cell cultures // FEBS Lett. 2002. Vol. 532. P. 441−444.

46. Genaro A.M., Hortelano S., Alvarez A., Martinez C., and Bosca L. Splenic B lymphocyte programmed cell death is prevented by nitric oxide release through mechanisms involving sustained Bcl-2 levels // J. Clin. Invest. 1995. Vol. 95, 4. P. 1884−1890.

47. Geng Y. -L., Petersson A. -S., Wennmalm A., and Hannson G. Cytokine-induced expression of nitric oxide synthase results in nitrosylation of heme and nonheme iron proteins in vascular smooth muscle cells // Exp. Cell Res. 1994. Vol. 214, 1. P. 418−424.

48. Gill J.S., and Windebank A.J. Ceramide initiates NFkappaB-mediated caspase activation in neuronal apoptosis // Neurobiol. Dis. 2000. Vol. 4. P. 448 461.

49. Goni F.M., and Alonso A. Sphingomyelinases: enzymology and membrane activity // FEBS Lett. 2002. Vol. 531. P. 38−46.

50. Grether-Beck S., Bonizzi G., Schmitt-Brenden H., Felsner I., Timmer A., Sies H., Johnson J.P., Piette J., and Krutmann J. Non-enzymatic triggering of the ceramide signalling cascade by solar UVA radiation // EMBO J. 2000. Vol. 19. P. 5793−5800.

51. Guy R.A., Maguire G.F., Crandall I., Connelly P.W., and Kain K.C. Characterization of peroxynitrite-oxidized low density lipoprotein binding to human CD36 // Atherosclerosis. 2001. Vol. 155. P. 19−28.

52. Han D., Ybanez M.D., Ahmadi S., Yeh K., and Kaplowitz N. Redox regulation of tumor necrosis factor signaling // Antioxid. Redox. Signal. 2009. Vol. 11. P. 2245−2263.

53. Hannun Y. The sphingomyelin cycle and the second messenger function of ceramide // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, 5. P. 3125−3128.

54. Hannun Y.A., and Luberto C. Ceramide in the eukaryotic stress response // Trends Cell. Biol. 2000. Vol. 10. P. 73−80.

55. Hebestreit H., Dibbert B., Balatti I., Braun D., Schapowal A., Blaser K., and Simon H.U. Disruption of fas receptor signaling by nitric oxide in eosinophils // J. Exp. Med. 1998. Vol. 187. P. 415−425. 106

56. Herrmann M., Lorenz H., Voll R., Griinke M., Woith W., and Kalden J. A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments // Nucleic Acids Research. 1994. Vol. 22, 24. P. 5506−5507.

57. Higuchi M., and Aggarwal B. Modulation of two forms of tumor necrosis factor receptors and their cellular response by soluble receptors and their monoclonal antibodies // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 20 892−20 899.

58. Hines I.N., Harada H., Bharwani S., Pavlick K.P., Hoffman J.M., and Grisham M.B. Enhanced post-ischemic liver injury in iNOS-deficient mice: a cautionary note. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 284. P. 972 976.

59. Hines I.N., Kawachi S., Harada H., Pavlik K.P., Hoffman J.M., Bharvanti S., Wolf R.E., and Grisham M.B. Role of nitric oxide in liver ischemia and reperfusion injury // Mol. Cell. Biochem. 2002. Vol. 234−235. P. 229−237.

60. Hogg N., and Kalyanaraman B. Nitric oxide and lipid peroxidation // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1411(2−3). P. 378−384.

61. Hortelano S., Dallaporta B., Zamzami N., Hirsch T., Susin S.A., Marzo I., Bosca L. and Kroemer G. Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition // FEBS Lett. 1997. Vol. 410, 2−3. P. 373 377.

62. Hostetler K.Y., Yazaki P.Y. The subcellular localization of neutral sphingomyelinase in rat brain // J. Lip. Res. 1979. Vol. 20. P. 456−463.

63. Huie R.E., and Padmaja S. The reaction NO with superoxide // Free Radie. Res. Commun. 1993. Vol. 18. P. 195−199.

64. Huwiler A., Dorsch S., Briner V.A., van den Bosch H. and Pfeilschifter J. Nitric oxide stimulates chronic ceramide formation in glomerular endothelial cells // 1999a. Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 258, 1. P. 60−65.

65. Huwiler A., Pfeilschifter J., and van den Bosch H. Nitric oxide donors induce stress signaling via ceramide formation in rat renal mesangial cells // J. Biol. Chem. 1999b. Vol. 274. P. 7190−7195.

66. Igarashi J., Thatte H.S., Prabhakar P., Golan D.E. and Michel T. Calcium-independent activation of endothelial nitric oxide synthase by ceramide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 12 583−12 588.

67. Irie F., and Hirabayashi Y. Application of exogenous ceramide to cultured rat spinal motoneurons promotes survival or death by regulation of apoptosis depending on its concentrations // J. Neurosci. Res. 1998. Vol. 54. P. 475−485.

68. Isobe M., Katsuramaki T., Hirata K., Kimura H., Nagayama M., and Matsuno T. Beneficial effects of inducible nitric oxide synthase inhibitor on reperfusion injury in the pig liver // Transplantation. 1999. Vol. 68, 6. P. 803 813.

69. Jaeschke H. Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2003. Vol. 284. P. G15-G26.

70. Josephs M., Katan M., and Rodrigues-Lima F. Irreversible inactivation of magnesium-dependent neutral sphingomyelinase 1 (NSM1) by peroxynitrite, a nitric oxide-derived oxidant // FEBS Lett. 2002. Vol. 531, 2. P. 329−334.

71. Jungner M., Ohvo H., and Slott J. P. Interfacial regulation of bacterial sphingomyelinase activity // Biochim. Biophis. Acta. 1997. Vol. 1344, 3. P. 230−240.

72. Kaplowitz N. J. Mechanisms of liver cell injury // J. Hepatol. 2000. Vol. 32, l.P. 3917.

73. Kawachi S., Hines I.N., Laroux F.S., Hoffman J., Bharwani S., Gray L., Leffer D., and Grisham M.B. Nitric oxide synthase and postischemic liver injury // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 276, 3. P. 851−854.

74. Kim Y.M., Bergonia H., and Lancaster J.R. Nitrogen oxide-induced autoprotection in isolated rat hepatocytes // FEBS Lett. 1995. Vol. 374, 2. P. 228−232.

75. Kim Y. M., de Vera M. E., Watkins S. C., and Billiar T. R. Nitric oxide protects cultured rat hepatocytes from tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis by inducing heat shock protein 70 expression // J. Biol. Chem. 1997a. Vol. 272,2. P. 1402−1411.

76. Kim Y.M., Talanian R.V., and Billiar T.R. Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase-3-like activity via two distinct mechanisms // 1997b. J. Biol. Chem. Vol. 272, 49. P. 31 138−31 148.

77. Kim Y.M., Kim T.H., Seol D.W., Talanian R.V., and Billiar T.R. Nitric oxide suppression of apoptosis occurs in association with an inhibition of Bcl-2 cleavage and cytochrome c release // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, 47. P. 31 437−31 441.

78. Kim Y. M., Chung H. T., Simmons R. L., and Billiar T. R. Cellular non-heme iron content is a determinant of nitric oxide-mediated apoptosis, necrosis, and caspase inhibition // J. Biol. Chem. 2000a. Vol. 275, 15. P. 10 954−10 961.

79. Kolesnick R.N., and Kronke M. Regulation of ceramide production and apoptosis // Annu. Rev. Physiol. 1998. Vol. 60. P. 643−665.

80. Kronke M. Functional dichotomy of neutral and acidic sphingomyelinases in tumor necrosis factor signaling // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 267. P. 1 799 718 001.

81. Kwon Y.G., Min J.K., Kim K.M., Lee D.J., Billiar T.R., and Kim Y.M. Sphingosine 1-phosphate protects human umbilical vein endothelial cells from serum-deprived apoptosis by nitric oxide production // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, 14. P. 10 627−10 633.

82. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, 259. P. 680−685.

83. Lancaster J.R., and Hibbs J.B. EPR demonstration of iron-nitrosyl complex formation by cytotoxic activated macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87, 3. P. 1223−1227.

84. Lee J.T., Xu J., Lee J.M., Ku G., Han X., Yang D.I., Chen S., Hsu C.Y. Amyloid-beta peptide induces oligodendrocyte death by activating the neutral sphingomyelinase-ceramide pathway // J. Cell Biol. 2004. Vol. 164, 1. P. 123 131.

85. Levrand S., Vannay-Bouchiche C., Pesse B., Pacher P., Feihl F., Waeber B., and Liaudet L. Peroxynitrite is a major trigger of cardiomyocyte apoptosis in vitro and in vivo // Free Radic. Biol. Med. 2006. Vol. 41. P. 886−895.

86. Li J., Billiar T.R., Talanian R.V., and Kim Y.M. Nitric oxide reversibly inhibits seven members of the caspase family via S-nitrosylation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 240. P. 419−424.

87. Li C.Q., and Wogan G.N. Nitric oxide as a modulator of apoptosis // Cancer Lett. 2005. Vol. 226, l.P. 1−15.

88. Lin K. T., Xue J.Y., Nomen M., Spur B., and Wong P. Y. Peroxynitrite-induced apoptosis in HL-60 cells // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270, 28. P. 1 648 716 490.

89. Liu B., and Hannun Y.A. Inhibition of the neutral magnesium-dependent sphingomyelinase by glutathione // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 1 628 116 287.

90. Liu B., Andrieu-Abadiei N., Levadei T., Zhang P., Obeid L.M., Hannun Y.A. Glutathione regulation of neutral sphingomyelinase in tumor necrosis factor-a-induced cell death // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 11 313−11 320.

91. Liu L., and Stamler J.S. NO: an inhibitor of cell death. // Cell Death Differ. 1999. Vol. 6, 10. P. 937−942.

92. Liu P., Xu B., Quilley J., and Wong P.Y. Peroxynitrite attenuates hepatic ischemia-reperfusion injury // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. Vol. 279. P. C1970-C1977. in

93. Lowry O.H., Rosebrogh N.G., Farr A.L. Protein measurement with folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265−275.

94. Lukivskaya O., Patsenker E., Lis R., and Buko V.U. Inhibition of inducible nitric oxide synthase activity prevents liver recovery in rat thioacetamide-induced fibrosis reversal // Eur. J. Clin. Invest. 2008. Vol. 38, 5. P. 317−325.

95. Mangoura D., and Dawson G. J. Neurochem. Programmed cell death in cortical chick embryo astrocytes is associated with activation of protein kinase PK60 and ceramide formation // 1998. Vol. 70. P. 130−138.

96. Marchesini N., and Hannun Y.A. Acid and neutral sphingomyelinases: roles and mechanisms of regulation // Biochem. Cell Biol. 2004. Vol. 82. P. 27−44.

97. Mathias S., Younes A., Kan C., Orlow I., Joseph C., and Kolesnik R. Activation of the sphingomyelin signaling pathway in intact EL4 cells and in a cell-free system by IL-1 beta// Science. 1993. Vol. 259. P. 519−522.

98. Matthews N., Neale M.L., Jackson S.K., and Stark J.M. Tumour cell killing by tumour necrosis factor: inhibition by anaerobic conditions, free-radical scavengers and inhibitors of arachidonate metabolism // Immunology. 1987. Vol. 62. P. 153−155.

99. Maurer B.J., Metelista L.S., Seeger R. C, Cabot M.C., and Reynolds C.P. Increase of ceramide and induction of mixed apoptosis/necrosis by N-(4hydroxyphenyl)-retinamide in neuroblastoma cell lines // J. Natl. Cancer Inst. 1999. Vol. 91. P. 1138−1146.

100. Merrill A.H. De novo sphingolipid biosynthesis: a necessary, but dangerous, pathway // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, 29. P. 25 843−25 846.

101. Messmer U.K., Reimer D. M., Reed J.C., and Brune B. Nitric oxide induced poly (ADP-ribose) polymerase cleavage in RAW 264.7 macrophage apoptosis is blocked by Bcl-2 // FEBS Lett. 1996. Vol. 384, 2. P. 162−166.

102. McDaniel M.L., Corbett J.A., Kwon G., and Hill J.R. A role for nitric oxide and other inflammatory mediators in cytokine-induced pancreatic beta-cell dysfunction and destruction // Adv. Exp. Med. Biol. 1997. Vol. 426. P. 313−319.

103. Miles A.M., Bohle D.S., Glassbrenner P.A., Hansert B., Wink D.A., and Grisham M.B. Modulation of superoxide-dependent oxidation and hydroxylation reactions by nitric oxide // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 407.

104. Minamiyama Y., Takemura S., Imaoka S., Funae Y., Tanimoto Y., and Inoue M. Irreversible inhibition of cytochrome P450 by nitric oxide // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. Vol. 283. P. 1479−1485.

105. Mogami K., Kishi H., and Kobayashi S. Sphingomyelinase causes endothelium-dependent vasorelaxation through endothelial nitric oxide production without cytosolic Ca (2+) elevation // FEBS Lett. 2005. Vol. 579. P. 393−397.

106. Moncada S., and Higgs A. The L-arginine-nitric oxide pathway //N. Engl. J. Med. 1993. Vol. 329. P. 2002−2012.

107. Mulsch A., Mordvintcev P.I., Vanin A.F., Busse R. Formation and release of dinitrosyl iron complexes by endothelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 196, 3. P. 1303−1308.

108. Nikolova-Karakashian M.N., and Rozenova K.A. Ceramide in stress response // Adv. Exp. Med. Biol. 2010. Vol. 688. P. 86−108.

109. Okazaki T., Bell R.M., and Hannun Y.A. Sphingomyelin turnover induced by vitamin D3 in HL-60 cells. Role in cell differentiation // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 19 076−19 080.

110. Pacher P., Beckman J.S., and Liaudet L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease // Physiol. Rev. 2007. Vol. 87. P. 315−424.

111. Pahan K., Sheikh F.G., Khan M., Namboodiri A.M., and Singh I. Sphingomyelinase and ceramide stimulate the expression of inducible nitric-oxide synthase in rat primary astrocytes // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 2591−2600.

112. Patel H.H., and Insel P.A. Lipid rafts and caveolae and their role in compartmentation of redox signaling // Antioxid. Redox. Signal. 2009. Vol. 11. P. 1357−1372.

113. Pautz A., Franzen R., Dorsch S., Boddinghaus B., Briner V.A., Pfeilschifter, J. and Huwiler, A. Cross-talk between nitric oxide and superoxide determines ceramide formation and apoptosis in glomerular cells // Kidney Int. 2002. Vol. 61. P. 790−796.

114. Perrotta C., De Palma C., and Clementi E. Nitric oxide and sphingolipids: mechanisms of interaction and role in cellular pathophysiology // Biol. Chem. 2008. Vol. 389. P. 1391−1397.

115. Perrotta C., and Clementi E. Biological roles of Acid and neutral sphingomyelinases and their regulation by nitric oxide // Physiology (Bethesda). 2010. Vol. 25. P. 64−71.

116. Pettus B.J., Chalfant C.E., and Hannun Y.A. Ceramide in apoptosis: an overview and current perspectives // Biochim. Biophys. Acta. 2002. Vol. 1585. P. 114−125.

117. Pilane C.M., and LaBelle E.F. NO induced apoptosis of vascular smooth muscle cells accompanied by ceramide increase // J. Cell. Physiol. 2004. Vol. 199. P. 310−315.

118. Quillet-Mary A., Jaffrezon J.P., Mansat V., Bordier C., Naval J. and Laurent G.I. Implication of mitochondrial hydrogen peroxide generation in ceramide-induced apoptosis // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, 34. P. 21 388−21 391.

119. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxynitriteinduced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide // Arch. Biochem. Biophys. 1991. Vol. 288. P. 481−487.

120. Radi R., Cassina A., Hodara R. Nitric oxide and peroxynitrite interactions with mitochondria // Biol. Chem. 2002. Vol. J83. P. 401−409.

121. Raghuram N., Fortenberry J.D., Owens M.L., and Brown L.A. Effects of exogenous nitric oxide and hyperoxia on lung fibroblast viability and DNA fragmentation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 262. P. 685−691.

122. Raha S., and Robinson B.H. Mitochondria, oxygen free radicals, disease and ageing // Trends. Biochem. Sci. 2000. Vol. 25. P. 502−508.

123. Rao B.G., and Spence M.W. Sphingomyelinase activity at pH 7.4 in human brain and a comparison to activity at pH 5.0 // J. Lipid Res. 1976. Vol. 17. P. 506−515.

124. Richter C. Biophysical consequences of lipid peroxidation in membranes // Chem. Phys. Lipids. 1987. Vol. 44. P. 175−189.

125. Salgo M.G., Squadrito G.L., and Pryor W. A. Peroxynitrite causes apoptosis in rat thymocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 215, 3. P. 1111−1118.

126. Sastry P. S., and Rao K.S. Apoptosis and the nervous system // J. Neurochem. 2000. Vol. 74. P. 1−20.

127. Schuchman E.H., Suchi M., Takahashi T., Sandhoff K., and Desnick R.J. Human acid sphingomyelinase. Isolation, nucleotide sequence and expression of the full-length and alternatively spliced cDNAs // J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266, 13. P. 8531−8539.

128. Schutze S., Potthoff K., Machleidt T., Dorge J., Berkovic D., Wiegmann K, and Kronke M. TNF-alfa activates NF-kappa B by phosphatidylcholine-specific phospholipase C-induced «acidic» sphingomyelin breakdown // Cell. 1992. Vol. 71, 5. P. 765−776.

129. Shaul P.W. and Anderson R.G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction // Am. J. Physiol. 1998. Vol. 275. P. L843-L851.

130. Singh I., Pahan K., Khan M, Singh A.K. Cytokine-mediated induction of ceramide production is redox-sensitive // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. P. 20 354−20 362.

131. Sosnowski J., Stetter-Neel C., Cole D., Durham J.P., and Mawhinney M.G. Protein kinase C mediated anti-proliferative glucocorticoid-sphinganine synergism in cultured Pollard III prostate tumor cells // J. Urol. 1997. Vol. 158, 1. P. 269−274.

132. Takeda Y, Tashima M, Takahashi A, Uchiyama T, Okazaki T. Ceramide generation in nitric oxide-induced apoptosis. Activation of magnesium-dependent neutral sphingomyelinase via caspase-3 // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, 15. P. 10 654−10 560.

133. Teoh N., Dela Pena A., and Farrell G. Hepatic ischemic preconditioning in mice is associated with activation of NF-kappaB, p38 kinase, and cell cycle entry // Hepatology. 2002. Vol. 36. P. 94−102.

134. Teoh N.C., and Farrell G.C. Hepatic ischemia reperfusion injury: pathogenic mechanisms and basis for hepatoprotection // J. Gastroenterol. Hepatol. 2003. Vol. 18. P. 891−902.

135. Teoh N., Leclercq I., Pena A.D., and Farrell G. Low-dose TNF-alpha protects against hepatic ischemia-reperfusion injury in mice: implications for preconditioning // Hepatology. 2003. Vol. 37. P. 118−128.

136. Tezel G., and Yang X. Caspase-independent component of retinal ganglion cell death, in vitro // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. Vol. 45. P. 4049−4059.

137. Tomiuk S., Hofmann K., Nix M., Zumbansen M., and Stoffel W. Cloned mammalian neutral sphingomyelinase: functions in sphingolipid signaling? // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 3638−3643.

138. Tuttolomondo A., Di Raimondo D., di Sciacca R., Pinto A., and Licata G. Inflammatory cytokines in acute ischemic stroke // Curr. Pharm. Des. 2008. Vol. 14. P. 3574−3589.

139. Uchiyama T., Otani H., OkadaT., Ninomiya H., Kido M., Imamura H., Nogi S., and Kobayashi Y. J. Nitric oxide induces caspase-dependent apoptosis and necrosis in neonatal rat cardiomyocytes // Mol. Cell. Cardiol. 2002. Vol. 34. P. 1049−1061.

140. Van der Veen R.C., and Roberts L.J. Contrasting roles for nitric oxide and peroxynitrite in the peroxidation of myelin lipids // J. Neuroimmunol. 1999. Vol. 95. P. 1−7.

141. Venable M.E., Lee J.Y., Smyth M.J., Bielawska A., and Obeid L.M. Role of ceramide in cellular senescence // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 3 070 130 708.

142. Virag L., Szabo E., Gergely P., Szabo C. Peroxynitrite-induced cytotoxicity: mechanism and opportunities for intervention // Toxicol. Lett. 2003. Vol. 140- 141. P. 113−124.

143. Wajant H., Pfizenmaier K., and Scheurich P. Tumor necrosis factor signaling // Cell Death Differ. 2003. Vol. 10. P. 45−65.

144. Watanabe N., Kuriyama H., Sone H., Neda H., Yamaguchi N., Maeda M., and Niitsu Y. Continuous internalization of tumor necrosis factor receptors in a human myosarcoma cell line // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. P. 10 262−10 266.

145. Won J.S., Im Y.B., Khan M., Singh A.K., and Singh I. The role of neutral sphingomyelinase produced ceramide in lipopolysaccharide-mediated expression of inducible nitric oxide synthase // J. Neurochem. 2004. Vol. 88. P. 583−593.

146. Zarkovic N. 4-hydroxynonenal as a bioactive marker of pathophysiological processes // Mol. Aspects Med. 2003. Vol. 24, 4−5. P. 281−291. 120

147. Zhai S.T., Liu G.Y., Xue F^Sun G.P., Liang L., Chen W., Xu G.D., Li J.J., Yang J., and Liang T.B. Changes of sphingolipids profiles after ischemia-reperfusion injury in the rat liver // Chin. Med. J. 2009. Vol. 122. P. 302 530 302 531.

148. Zaman K., Hanigan M.H., Smith A., Vaughan J., Macdonald T., Jones D.R., Hunt J.F., Gaston B. Endogenous S-nitrosoglutathione modifies 5-lipoxygenase expression in airway epithelial cells // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2006. Vol. 34, 4. P. 387−393.

149. Zhang Y., and Kolesnick R. Signaling through the sphingomyelin pathway // Endocrinology. 1995. Vol. 136. P. 4157−4160.

150. Zhang M., and Chen L. Status of cytokines in ischemia reperfusion induced heart injury // Cardiovasc. Hematol. Disord. Drug Targets. 2008. Vol. 8. P. 161 172.

151. Zhang C., and Li P.L. Membrane raft redox signalosomes in endothelial cells // Free Radic. Res. 2010. Vol. 44. P. 831−842.

152. Zhu C., Xu F., Wang X., Shibata M., Uchiyama Y., Blomgren K., and Hagberg H. Different apoptotic mechanisms are activated in male and female brains after neonatal hypoxia-ischaemia // J. Neurochem. 2006. Vol. 96. P. 1016−1027.

Заполнить форму текущей работой