Микробная утилізація полиароматических углеводородов

РефератДопомога в написанніДізнатися вартістьмоєї роботи

Микробная утилізація полиароматических углеводородов (реферат, курсова, диплом, контрольна)

1.Реферат.

Робота присвячена актуальною проблемою сучасної екологічної біотехнології - мікробної утилізації полиароматических вуглеводнів (ПАУ). У межах роботи проведено: пошук і освоєння селекція штамів ПАУрезистентних грибів, добір поживних середовищ і адаптація до них відібраних штамів, досліджені процеси деструкції суміші ПАУ грибами Trichoderma linorum і Phanerochaete chrysosporium, і навіть процес фотолиза суміші ПАУ. Запропоновано модифікація середовища Ван-Итерсона виділення і селекції грибов-деструкторов целюлози, резистентних до ПАУ.

2.Содержание.

Введение

… … 3.1.Актуальность проблеми… … 3.2.Состояние розробки проблеми… … 3.3.Научная новизна роботи… …

4.Аналитический огляд… … 4.1.Вредные ароматні вещества-аналоги компонентів деревини… … 4.1.1.Химический склад парламенту й структура деревини… 4.1.1.1.Целлюлоза… … 4.1.1.2.Лигнин… … 4.1.1.3.Экстрактивные речовини… … 4.1.2.Карбонизация деревини. Процеси освіти конденсованих ароматичних систем… … 4.1.3.Полиароматические сполуки кам’яновугільної смоли… 4.2.Лигнин і ПАУ-разрушающие мікроорганізми…. 4.2.1.Воздействие грибів білої гниття… … 4.2.2.Воздействие грибів м’якої гниття… … 4.2.3.Действие бактерій… …

5.Цели і завдання дослідження… …

6.Патентный пошук… …

7.Экспериментальная частина… … 7.1.Материалы і методи… … 7.1.1.Материалы… … 7.1.1.1.Штаммы мікроорганізмів… … 7.1.1.2.Питательные середовища… … 7.1.1.3.Субстраты… … 7.1.1.4.Пробы… … 7.1.2.Методы… … 7.1.2.1.Выделение культур микромицетов… … 7.1.2.2.Изучение морфологічних і физиологобіохімічних властивостей микромицетов… … 7.1.2.3.Отбор штаммов-деструкторов ПАУ… … 7.1.2.4.Твердофазное культивування мікроорганізмів… 7.1.2.5.Фотолитическая обробка субстратів… … 7.1.2.6.Определение ПАУ у твердій фазі… … 7.2.Результаты і обговорення… … 7.2.1.Направленный пошук микромицетов-деструкторов ПАУ… 7.2.2.Микробная деструкція суміші ПАУ… … 7.2.3.Применение опромінення ((=257,3 нм) для предобработки ПАУ-содержащих субстратів… … 7.2.4.Происхождение микроорганизмов-деструкторов ПАУ… 7.2.5.Анализ можливість створення систем по утилізації твердих ПАУ-содержащих відходів… …

8.Стандартизация… …

9.Охрана праці та оточуючої середовища… … 9.1.Характеристика небезпечних і шкідливих виробничих чинників… 9.2.Пожаробезопасность… … 9.3.Санитария і гігієна… … 9.4.Безопасная робота у лабораторії… … 9.5.Меры першої допомоги при нещасних випадків в лабораторії… 9.6.Охрана оточуючої середовища… …

10.Технико-экономическая оцінка результатів дослідження… 10.1.Анализ можливості реалізації результатів дослідження… 10.1.1.Сегментация ринку… … 10.1.2.Позиционирование товару… … 10.2.Расчет витрат за проведення дослідницької роботи… 10.2.1.Расчет поточних витрат… … 10.2.2.Расчет витрат за проведення додаткових работ…

11.Выводы і пропозиції… …

12.Список використаної літератури… …

Введение

3.1.Актуальность проблемы.

Інтенсивне розвиток хімічної промисловості та обробній промисловості призвело до інтенсивному нагромадженню у природних біоценозах значних кількостей токсичних речовин, що, на свій чергу, зумовило розвиток досліджень у сфері охорони довкілля. Головний значення до вивчення проблеми екологічну безпеку грає біотехнологія, бо всі основні реакції детоксикації чи часткової хімічної модифікації токсичного субстрату пов’язані з метаболической активністю микроорганизмов.

Разом про те, у вирішенні екологічних проблем аж до останнього часу (5−7 років тому я) домінувало традиційне напряммоніторинг об'єктів довкілля та визначення ГДК экотоксикантов. Сьогодні роботи з використанню штамівдеструкторів экотоксикантов в про очисні споруди /1/, але питання біодеградації токсичних речовин у природних біоценозах (биоремедиации) і шляхом створення промислових технологій, дозволяють очищати природні ландшафти від техногенних забруднень розроблено недостаточно.

Серед веществ-экотоксикантов полиароматические сполуки є одним з чільних місць по утраті, наносимому навколишньому середовищі. Спектр цих речовин надзвичайно різноманітний. Їх утилізація зводиться переважно до поховання на спеціальних полігонах. Токсичність, канцерогенність і мутагенность цих речовин загальновідома /2/.

Всі ці речовини мають у своєму своїй структурі бензольное кільце, що міститься в природному полімері лигнине, що є, поряд з целюлозою, однією з основних компонентів деревини. Показано /3/, що грунтові мікроорганізми здатні руйнувати лигнин і розмикати, яке у його структуру, бензольное кільце. Цілком можливо, що з цих мікроорганізмів, у процесі селекції можуть придбати здатність утилізувати ПАУ ролі косубстратов чи єдиних джерел вуглецю і энергии.

У цьому представляється перспективної селекція древоразрушающих мікроорганізмів у створення штамівдеструкторів ароматичних экотоксикантов, здатних руйнувати ці речовини у природних біоценозах й управління промислових очисних сооружениях.

3.2.Состояние розробки проблемы.

У Росії її та СНД: У Росії її та СНД (здебільшого Україні) активно роботи з пошуку штаммов-деструкторов відходів коксохімічної промисловості /4/. Вивчаються молекулярнобіологічні аспекти деструкції ПАУ. Слід зазначити, що більшість робіт виконано з допомогою бактерій роду Pseudomonas. Даних про використання грибів у процесах детоксикації у вітчизняній літературі обмаль. Процесам биоремедиации техногенно забруднених територій як і не приділяють уваги (з за м’якого екологічного законодательства).

У країнах: Аналіз доступною літератури показав, що у навіть Європі (особливо у ФРН) ведуться численні дослідження по біодеградації полиароматических экотоксикантов у природних біоценозах. /5−7/. Можна виокремити такі підходи до розв’язання проблеми, у світі яких ведуться разработки:

1.В грунт одноразово чи через певні інтервали вноситься суспензія мікроорганізмів, які розкладають речовинизагрязнители.

2.В грунт вноситься спеціальна живильне середовище, що містить азот, фосфор, мікроелементи і стимулятори зростання мікроорганізмів. У склад суміші входять добавки, які б солюбилизации гидрофобных сполук. З використанням таких середовищ ґрунтова мікрофлора розкладає экотоксиканты значно швидше. Дослідники ФРН активно разработывают цей напрям /8/.

3.Совместно використовуються живильні середовища проживання і мікроорганізми і/або виробляється предобработка субстрату. Американські вчені показали ефективність предобработки экотоксикантов УФ-светом з подальшим утилізацією грибом Phanerochaete chrysosporium і запатентували цей процес /9/.

У і країнах Європи досліджені процеси руйнації таких конденсованих систем як нафталін, антрацен, фенантрен, пирен і др./10,11/. Досліджені генетичні аспекти деградації ароматичних экотоксикантов /12,13/. Проте дослідження носять вузько спеціалізований характер-изучаются процеси деструкції одного речовини (у разі суміші досліджується лише сумарне зміст речовин або число компонентів, не що перевищує 3−5). Дані процесам, що йде при біодеградації і фотолизе багатокомпонентних (більш десятьох речовин) сумішей полиароматических вуглеводнів відсутні як і вітчизняної і зарубіжної литературе.

Резюмуючи перелічене вище можна сказати, що сьогодні у Росії і близько розвинених інших країнах ведуться інтенсивні дослідження у сфері біодеградації техногенних забруднювачів біоценозів, причому основна роль процесах детоксикації відводиться грибам білої гниття (особливо Phanerochaete chrysosporium) і бактеріям роду Pseudomonas. Дані про використання для деструкції полиароматических речовин грибів не які стосуються базидиомицетам носять уривчастий характер /14/. Даних про процеси що відбуваються при деструкції багатокомпонентних сумішей экотоксикантов (10 і більше компонентів) у доступній літературі не оказалось.

3.3.Научная новизна работы.

Запропоновано модифікована середовище Ван-Итерсона виділення і селекції ПАУ-резистентных грибних культур; вперше вивчений процес деструкції суміші ПАУ, що з 16-ти речовин грибами Trichoderma lignorum і Phanerochaete chrysosporium. Вивчений процес фотолиза суміші ПАУ що з 16-ти веществ.

4.Аналитический обзор

4.1.ПАУ-производные компонентів древесины.

4.1.1.Химический склад парламенту й структура древесины.

4.1.1.1.Целлюлоза.

Основний компонент деревини є целюлоза, її вміст у деревині різних порід варіюється від 34,2% (Chlorophora excelsa Benth. et Hock.f.) до 61,6% (Pinus strobus L.), загалом їхньому частку у рослинних тканинах доводиться 30−50% сухого речовини. Крім целюлози, деревина містить низку інших полісахаридів: гемицеллюлозу, крохмаль, пектинові речовини, і навіть різні органічні сполуки, такі як лигнин, воску, кора, смоли тощо. /15/.

Рослинні тканини деревини є поєднання клітин різноманітної форми, мають складне будова целюлозної стінки, що з 3-х верств /16/. Первинні клітинні стінки сусідніх клітин з'єднані між собою когезивным межклеточным веществом-срединной платівкою. У період зростання серединна платівка на 2/3 складається з пектиновых речовин, потім відбувається її лигнификация /17/.

Вторинна клітинна стінка найбільш стовщена і утворить більшу частину клітинної стінки. Вона головним чином із целюлози і становить безліч концентричных верств паралельно розташованих уздовж осі микрофибрилл целюлози. Вторинний шар визначає форму клітини, і її механічні властивості /18/. Товщина третинної стінки сягає 70−80 нм. Через високого змісту лігніну вона міцна і хімічно стійка /19/.

За сучасними даними макромолекула целлюлозы-это лінійний полімер (-D глюкопиранозы з (-1,4-гликозидными зв’язками між мономерами. Макромолекула целюлози є стереорегулярный высокоориентированный кристалічний полімер з різноманітною ступенем полімеризації (ступінь полімеризації дорівнює числу глюкозных залишків). Ступінь полімеризації варіюється залежно від походження: від 15 до 14 000 .Так, для целлюлозных волокон бавовнику, ступінь полімеризації дорівнює 13 000…14 000, для деревної целлюлозы-8000 /20/ .Щодо хімічного складу целюлози відповідає формулі (С6 Н10 О5) n. Елементарним ланкою макромолекули є ангидроцеллобиоза, що є основним продуктом розщеплення целюлози микробными ферментами /21/. Олігосахаридипродукти ферментативного гидролиза-(ди, три, тетрамеры D-глюкозы) розчиняються у воді. Проте сама целюлоза не розчиняється в простих розчинниках. Її можна розчинити або у комплексних розчинниках з урахуванням солей металів (реактив Швейцера), або у неводних сумішах органічних речовин. Можна так ж отримати розчини целюлози, перевівши їх у складний (нітрат, ацетат) чи простий ефір. Однак отримати розчини целюлози, де молекули було б повністю розділені дуже важко. Так молекули нітрату целюлози (ступінь полімеризації 6000), завдяки водневим зв’язкам, утворюють сітку навіть за концентрації в розчині всього 0,1% /22/. Наявність водневих зв’язків зумовлює також важливі властивості целюлози, такі як гігроскопічність, швидкість розчинення, реакційну способность.

У будова деревини, на забезпечення її механічної міцності і взаємодії з микробными ферментами важливе значення мають ділянки целюлози з високим рівнем упорядкованості фибрилл-такие ділянки дістали назву кристалічні, на відміну аморфних ділянок з розхристаною орієнтацією. Аморфна целюлоза, з менш щільною, ніж в кристалічною целюлози, упаковки фибрилл доступніша для хімічних впливів і мікробних ферментов.

Надмолекулярна структура целюлози представлена елементарними фибриллами чи мицеллами, діаметр яких складає 10нм. Мицеллы. своєю чергою, об'єднують у микрофибриллы діаметром 25 нм. Останні формують целлюлозные волокна. Щільно упаковані фібрили утворюють подобу кристалічною грати, забезпечуючи міцність рослинної клітини, взаємодію Космосу з аморфним матриксом, що містить інші полісахариди і органічні вещества.

4.1.1.2.Лигнин.

Поруч із целюлозою, важливий компонент рослинної тканини є лигнин. Лигнинодне із найбільш стійких і дуже поширених органічних полімерів у природі. Він накопичується в клітинної стінки й у проміжках між целлюлозными волокнами, що дає деревині додаткову міцність і опірність хімічним воздействиям.

До складу деревини входить від 17,6% (Populus tremuloides Michx.) до 39,8% (Lophira alata Bauks. ex Gaertu.f.) лігніну /15/. Зміст лігніну у різних тканинах рослин різний і варіюється від 5% до 30% /23/.

Лигнинскладний тривимірний полімер фенольной природи, в якому оксифенилпропановые мономери з'єднані між собою ефірними і З зв’язками /24/. Роль мономерів грають різні оксифенилпропановые спирти: конифериловый (в деревині хвойних дерев), синановый (в деревині листяних рослин) і nкумаровый (в трав’янистих рослинах) /Рис.1./.

[pic][pic] [pic].

Рис. 1.

Структуру лігніну, на відміну від целюлози, не можна описати простий комбінацією одній або кількох мономерных одиниць із одним типом зв’язку. У зв’язку з цим структура лігніну предмет моделювання. Остання модель, побудована з урахуванням інформації отриманої щодо соснового (Pinus taeda) лігніну, включає 94 одиниці (загальна молекулярна маса більш 17 000) / 15 /. У лигнине можна нарахувати дванадцять типів зв’язків, причому понад 50 відсотків% їх це (-(-4 і (-(-4 зв’язку /24/. Нині загальноприйнята концепція яка стверджує, що структура лігніну є результатом випадкового поєднання попередників. Поруч із цієї концепцією існують гіпотези упорядкованого будівлі лігніну, проте експериментальні факти свідчать на користь поглядів на неупорядоченном будову макромолекули лигнина.

Важливою здатністю лігніну є його спроможність утворювати тісну асоціацію з полисахаридными частинами клітинної стінкилигноцеллюлозные чи лигноуглеводные комплекси, в формуванні яких головну роль виконують ковалентные зв’язку. Вважається, що з лигнином хімічно пов’язані полиозы, хоча зв’язку з целюлозою не повністю исключаентся. Фрагменти полиоз в лигноуглеводных комплексах представлені залишками ксилана і маннана. З деревини листяних порід виділяли лигнин-ксилановые комплекси /25,26/, та якщо з деревини хвойных-лигнин-маннановые і лигнин-ксилановые /27−31/.

На електронних микрофотографиях ялинового лигнин-полиозного комплексу видно, що полиозы впроваджено у лигнин, а як і сильно закручені і перевиті разом із. Найчастіше з лигнином пов’язані бічні відгалуження полиозланки арабинозы, галактозы і 4-Ометилглюкуроновой кислоти. Показано, що лигноуглеводные комплекси багаті саме цими цукрами /28,32/.

При вплив мікроорганізмів на деревину лигнин, асоційований з полісахариди клітинної стінки, є основною перешкодою на дію мікробних ферментів на целюлозу рослинних тканей.

4.1.1.3.Экстрактивные вещества.

Экстрактивные речовини грають величезну роль життя дерева і зумовлюють багато властивостей деревини (колір, запах, резистентність до фитопатогенам тощо.). При нормальних умов частка цих речовин становить середньому трохи більше 5%, причому у різних видів їхній вміст неоднаково, так наприклад, у деревині Pinus abies міститься 2,22%, а деревині Populus tremula — 4,53%. Штучно зміст экстрактивных речовин, у сосні різних видів може доводитися до 15%. Після обробітку дерева перед рубкою гербіцидом паракваном чи подібними сполуками в стовбурі з’являються зони, просочені смолою (стовбурової осмол)/15/.

Щодо хімічного складу экстрактивных речовин надзвичайно різноманітний, однак у світлі даної роботи нас цікавлять їх ароматична фракция.

Ароматичні терпены. Зміст ароматичних терпенів в деревині хвойних порід мізерно і єдиним прикладом сполук що така є представник класу монотерпенов (-цимол (рис. 2.).

Рис. 2.

Лиственные породи багатшими ароматичними терпенами: в деревині видів Ulmus, Celtis і Zelkowa знайдено 5 видів ароматичних сесквитерпенов, серед найбільш цікаві лацинилен Проте й 7- гидроксикадаленаль, містять нафталиновое ядро (с.рис.2.).

Прості феноли. Серед простих фенолів, виділених їх экстрактивных речовин їли (Picea abies), присутні ванілін, nгидрокси-бензойальдегид, конифериловый альдегид, гваяцилглицерин, nэтилфенол, кониферил і сирингин, а як і крезол та інші феноли. Деякі прості феноли виділили з деревини сосни (види Pinus). З деревини листяних порід Populus і Salix виділили nгидроксибензойную, ванилиновую, бузкову, феруловую кислоти, ванілін, бузковий альдегид.

У екстрактах деревини Quercus alba виявили ряд фенолів, серед яких присувствовали синаповый, конифериловый, бузковий альдегіди, ванілін, пропионгваякол і n-гидроксибензальдегид. У деревині дуба знайдено фенолу, крезолы, гваякол, n-этилфенол, эвгенол та інші фенольные соединения.

Лигнаны. Лигнаны-соединения, які з двох фенилпропановых одиниць, з'єднаних в різний спосіб. Деякі з цих сполук аналогічні димерным структурам, присутнім в макромолекуле лігніну. Багато лигнаны, характерні для екстрактах деревини видів Picea, Pinus, Larix і Tusida містять цикл тетрагидрофурана, наприклад пинорезинол, лариццирезинол, конидендрин і лиовил. Існують також і нециклические структури з (-(зв’язками між структурними одиницями (секоизоларицирезинол) і шестичленные цикли (изоларицирезинол, конидендрин, пликатин). З деревини Thuja plicata виділено пликатинафтол-лигнан, у якому нафталиновое ядро (рис. 3.)/15/.

Рис. 3.

4.1.2.Карбонизация деревини. Процеси освіти конденсованих ароматичних систем.

Після загибелі дерева деревина або розкладається мікроорганізмами або, у деяких природні умови перетворюється в викопну древесину.

Розрізняють два типу процесу освіти викопній деревини: силикатизацию (скам'яніння) і карбонизацию (углификацию). У цьому світлі нашої роботи цікаві хімічні процеси, що відбуваються при карбонизации деревини. Розглянемо їх понад подробно.

Хімічний аналіз зразків давньої і викопній деревини свідчить про зменшення зміст полісахаридів та зростання кількості негидролизуемого залишку зі збільшенням віку і її ступеня деградації. У відносно молодих, але дуже деградованих зразків виявили присутність микроорганизмов.

З результатів досліджень древніх зразків дуба, і навіть зразків берези, ясена і сосни видно, що у ступінь деградації впливають оточуючі умови, особливо у ранніх стадіях. Деякі старі зразки (віком 8500 років) містили більше полиоз, ніж молоді (віком 900 лет).

По збільшення відносного змісту целюлози в зразках деградированной деревини видно, що перетворення розпочинаються з полиоз. Швидше руйнуються легкорозчинні полиозы, зокрема пентозаны, ніж труднорастворимые. Масова частка полиоз, розчинних в 5%-ным КІН в ядровой деревині сучасного зразка дуба, становила 22,4%, а зразку віком 8500 років становить 12,4%, тогда як масова частка полиоз, розчинних в 24%-ном КІН, знизилася з 6,1% лише до 5,4% /15/.

Деградація полісахаридів починається на ранніх стадіях процесу, проте певна частина полісахаридів може зберігатися не один мільйон років. У зразку деревини хвойною породи віком 100 млн. років знайшли близько двох% цукрів. З зразка деревини з нижнього крейдяного періоду (140 млн. років тому вони) виділили 1,1% холоцеллюлозы, в гидролизате якої основними цукрами були глюкоза і манноза. У зразку викопній деревини сімейства Protopinaceae, очевидно, ще збереглися невеликі кількості целюлози і полиоз навіть по 180 млн. років, оскільки гідролізати містили глюкозу, маннозу і ксилозу.

Лигнин здатний зберігатися протягом мільйонів років, але водночас може у змінах навіть за щодо короткі часові відтинки. У молекулах лігніну зразків деревини віком 900−4400 років виявили окисні перетворення. Окислювання лігніну зазначалося й у зразках деревини віком 30 млн. років. Лигнин може втрачати 2/3 метоксильных груп. ИК-спектры зразків деревини свідчить про присутність конденсованих кілець, які утворилися головним чином із лігніну. Зі збільшенням віку перетворення лігніну в конденсированные ароматні системи посилюється. Битуминозный вугілля має високе зміст таких систем. Конденсація ароматичних кілець служить причиною збільшення змісту вуглецю у процесі карбонизации. У кінці цього процесу виходить графіт. Ароматичні кільця можуть виникати і з харчів деградації полісахаридів. Відомо, що пировиноградный альдегид може легко ароматизироваться через хінони /33/.

Нині кам’яне вугілля є є основним джерелом ПАУ для промисловості. Отже, ПАУ, выбрасываемые промисловістю в біосферу, похідні деревини древніх судинних растений.

4.1.3.Полиароматические сполуки кам’яновугільної смолы.

Кам’яновугільна смола (креозот) утворюється під час коксовании кам’яного вугілля й є є основним джерелом ПАУ для хімічної промисловості. Саме креозот є є основним джерелом ПАУэкотоксикантов.

У складі кам’яновугільної смоли нами знайшли 16 ПАУ, саме: нафталін, аценафтен, аценафтилен, флуорен, фенантрен, антрацен, флуорантен, пирен, бензантрацен, хризен, бенз[b]флуорантен, бенз[k]флуорантен, бенз[а]пирен, дибензантрацен, бензперилен, инденопирен (Рис. 4.). Найбільше в креозоті міститься фенантрена і флуорантена. Сумарно ці речовини становлять 64% фракції ПАУ. Інші речовини, такі як бенз[а]пирен, хоч і становлять 0,7% фракції ПАУ є найсильнішими канцерогенами.

Хімічно ці речовини є многоядерные ПАУ. Зміст нафталіну в суміші дуже низько. Переважна більшість ПАУтрьох-, чотирьохі більше ядерних соединения.

Рис. 4.ПАУ кам’яновугільної смолы.

4.2.Лигнин і ПАУ-разрушающие микроорганизмы.

Як відзначалося вище, природним резервуаром микроорганизмов-деструкторов ПАУ є грунт і лісова підстилка. Фитопатогенные гриби, вражаючі деревину, також перспективні в плані відбору ПАУ-разрушающих штаммов.

Гриби, руйнують деревину, поділяються чотирма группы:

1.Грибы бурої гниттяналежать до підвідділу базидиомицетов, руйнують, переважно, полісахариди древесины.

2.Грибы білої гниття- - належать до підвідділу базидиомицетов, руйнують, переважно, лигнин, проте можуть руйнувати полисахариды.

3.Грибы м’якої гниттясумчасті і недосконалі гриби, руйнують полісахариди і лигнин.

4.Грибы синявисумчасті і недосконалі гриби, живуть, переважно, з допомогою залишкових білків паренхимных клітинах. Обмежено руйнують полисахариды.

5.Бактерииздатні руйнувати полісахариди і лигнин, проте, їх морфологічні властивості (колоніальний зростання) Демшевського не дозволяє їм в ролі високо ефективних деструкторів при твердофазной ферментации.

Отже, найперспективнішими для відбору ПАУщо руйнують штамів є гриби білою та м’якої гниття (базидиоі аскомицеты). Розглянемо вплив їх ферментних систем на природні ароматні вещества.

4.2.1.Воздействие грибів білої гнили.

Гриби білої гниття виробляють різні ферменти, які б засвоєнню лігніну /34/. Деякі з грибів дають, переважно, лакказу, інші пероксидазу і тирозиназу. Процес вироблення ферментів різний залежно від цього використовується фермент всередині або за межами гиф.

В усіх видів диких грибів виявлено комбінована деструкція всіх компонентів деревини. Виявлено фермент, який потребує целлобиозе (продукті розкладання целюлози) для деструкції лігніну за спільної дії з локказой /15/.Этот фермент було названо целлобиозохиноноксиредуктазой. Згодом було показано, що з розкладання лігніну грибом Phanerohaete chrisosporium.(синоним Sporotrichum pulverolentum) наявність целлобиозохиноноксиредуктазы перестав бути необхідним. А наявність лакказы конче потрібне. Мутант гриба, не вырабатывающий цієї фенолоксидазы, неспроможний руйнувати лигнин.

Зміна в лигнине під впливом грибів білої гниття залежить від збільшення змісту карбонильных і карбоксильных груп. Ставлення О/С збільшується, а Н/С знижується. Збільшення змісту кисню відбувається внаслідок окислення (-вуглецевих атомів і окислительной деструкції перетинів поміж (- і (-вуглецевими атомами пропановой ланцюга. Досліди з міченим (14С) лигнином показано, що з дії грибів білої гниття (Coriolus versicolor, Phanerohaete chrysosporium) кінцевий продукт метаболізму СО2 утворюється головним чином із метоксильных груп, і у невеликий ступеня з вуглецю пропановых ланцюгів і ароматичних кілець. Далі здійснюється окислительное розщеплення (-О-4,(-5, (-1 і (-(зв’язків. У цьому виходять мономерные ланки лігніну, які далі руйнуються у вигляді розкриття ароматичного кільця. Проте, ароматні кільця можуть розщеплюватися й у полімері лігніну /15/.

4.2.2.Воздействие грибів м’якої гнили.

Гриби м’якої гниття виробляють ферменти, руйнують все компоненти деревини. Деструкція лігніну грибом Chaetomium globosum до загальної втрати маси деревини 12% залежить від деметилировании. Зі збільшенням втрати маси відбувається подальше розкладання лігніну. Дослідження засвідчили, що заодно немає накопичення ароматичних сполук, отже гриби м’якої гниття руйнують ароматні кільця у самому лигнине й у продуктах.

4.2.3.Действие бактерий.

Здатність різних бактерій руйнувати мономери і попередники лігніну показано в дослідах з модельними сполуками /35,36/. Проте, з морфологічних особливостей бактерії не здатні ефективно розкладати його полімерні формы.

Дослідження з руйнації ПАУ грунтовими бактеріями показали, що псевдомонады є найефективнішими деструкторами цих сполук. Дослідження засвідчили, що ПАУ ефективно розкладаються псевдомонадами за умов глибинної і твердофазной ферментації, в ризосфере рослин /37/.

Дослідження механізмів деструкції ПАУ (фенантрена) культурою Pseudomonas fluorescens показали /4/, що окислювання ПАУ бактеріями відбувається послідовно, тобто ферментна атака спрямована лише з одне кольцо (Рис. 5.).

Рис. 5.Механизм деструкції фенантрена.

Здатність руйнувати природні ароматні речовини наштовхнула дослідників на думка про використанні мікроорганізмів для руйнації ароматичних і полиароматических речовинвідходів хімічної індустрії. У 1990 року американські дослідники показали, що руйнують лигнин гриби білої гниття Phanerohaete chrysosporium здатні також розкладати поліциклічні ароматні вуглеводні до СО2 /38/. Була як і показано здатність бактеріальних штамів розкладати ПАУ /39/. У цей час по мікробної деструкції ПАУ ведуться, практично, у всіх розвинених країн. Показано /40/, що деструкція ПАУ йде послідовно і з гидроксилирования лише одну ароматичного кільця (рис. 6.).

Рис. 6.Гидроксилирование бензольного кільця. Спрощена схема мікробної деструкції нафталина.

Отже прості ПАУ повинні розкладатися мікроорганізмами набагато швидше ніж такі ПАУ як пирен, хризен, 3,4бензпирен і інші. Відповідно до правилом послідовного окислення лише одну ароматичного кільця при деструкції суміші ПАУ має відбуватися накопичення полиядерных речовин, руйнація яких вимагає тривалих термінів інкубації. Правило послідовного окислення діє щодо різноманітних видів микроорганизмов.

5.Цели і завдання исследования.

Метою роботи є підставою вивчення процесів біодеградації суміші шкідливих ПАУ мікроорганізмами, які руйнують деревину й створення на основі високоефективних штаммов-деструкторов зазначених соединений.

Завдання дослідження зводяться к:

1)Поиску в колекціях і виділенню з природних біоценозів микроорганизмов-деструкторов шкідливі речовини і відбір найбільш активних штаммов;

2)Адаптации штамів до місцевих умов культивування (масштабирование процесса);

3)Изучению процесів руйнації багатокомпонентної суміші ПАУ в умовах твердофазной ферментации;

4)Изучению фотолиза ПАУ.

6.Патентный поиск.

Пошук патентної інформації проводився з урахуванням фундаментальної бібліотеки СПбГТИ (ТУ), об'єднаної бібліотеки ВИЗР і ВНИИСХМ, бібліотеки АН, і навіть Російської Національної бібліотеки. Пошук здійснювався за такими напрямами: штаммы-деструкторы ароматичних экотоксикантов, живильні суміші очищення забруднених грунтів, аппаратурное оформлення процесів компостування твердих відходів, методи предобработки відходів. По даним напрямам виявлено наступна инормация:

1.Штамм актиноміцетів Streptomyces rochei, здійснює повному розкладанню 2,4,6-трихлорфенола чи 2,4-дихлорфенола чи 2,6- дихлорфенола, чи 2-хлорфенола: О.с. 1 652 335 СРСР, МКИ5 С12 N 1/20, С12 P. S 13/00/ Головльова Л. А., Заборина О. Е., Перцова Р. Н., Євтушенко Л.И.; Ин-т біохімії і физиол. мікроорганізмів АН СРСР.- № 4 696 431; Заявл. 08.06.89; Опубл. 30.05.91, Бюл. № 20.

2.Методы і установка для [проведення] аэробного ферментативного, зокрема, для компостування органічних матеріалів. Verfahren und Vorrichtung zur aeroben, fermentativen Hydrolyese, insbesondere zur Kompostierung vor organischen Stoffen: Заявка 3 925 905 ФРН, МКИ5 С12М 1/02, СО5 °F 9/04/ Hofmann Hermann, Schnorr Karl Ersnt.-№ 3 925 905.6; Заявл. 04.08.89; Опубл. 28.02.91.

3.Фотолитически посилене мікробне руйнація [речовин] які забруднювали довкілля. Photochemically enhanced microbial degradation of enviromental pollutants: Пат. 5 342 779 США МКИ5 ВО9 В 3/00, D06Н 16/00/ Matsumura Fumio, Katayama Arata; The Regents of the University of California.- № 687 368; Заявл.18.04.91; Опубл. 30.08.94; НКИ 453/262.5.

4.Улучшенная суміш поживних сполук для біологічної очищення загрязненых грунтів і вод. Verbesserte Nahrstoffgemische fur die Bioremediation verschmutzter Boden und Cewasser: Заявка 4 228 168 ФРН, МКИ5 С12N 1/26, С12S 9/00/ Kopp-Holtwiesche Bettinna, Weiss Albricht; Henkel KGaA.-№ 4 228 168.7; Заявл. 25.08.92; Опубл. 03.03.94.

5.Штамм бактерій — деструктор фенолу, бензолу та його галогензамещенных аналогів: Пат. 2 041 943 Росія, МКИ6 C12N 1/12, CO2 °F 3/34/ Зайцев Г. М., Ивойлов В. С; Суровцева Є.Г.; Науч.-произв. підприємство Биотехинвест. — № 92 014 789/13; Заявл. 28.12.92; Опубл. 20.08.95, Бюл. № 23.

7.Экспериментальная часть.

7.1.Материалы і методы.

7.1.1.Материалы.

7.1.1.1.Штаммы микроорганизмов.

У нашій роботі було використано штами мицеллиальных грибів люб’язно надані Ю. С. Оследкиным (ВНИИСХМ, г. Пушкин).

У таблиці № 1 наводиться список видів тварин і номери штамів, а також вказується доступна інформація джерело їх походження (організації і/або географічному і/або екологічному происхождении).

таблиця 1 | | | колекційний/| | |№п/.п |назва штами | |джерело | | | |музейний | | | | |номер штами | | |1 |Trichoderma linorum | 32 |ARRIAМ | |2 |Trichoderma linorum | 37 |ARRIAM | |3 |Trichoderma linorum | 48 |ARRIAM | |4 |Chaetomium elatum Kunze: Fris | 341 |СПбГУ | | |1817 | | | |5 |Chaetomium bainieri Munk 1957 | 344 |СПбГУ | |6 |Chaetomium funicolum Cooke 1873 | 347 |СПбГУ | |7 |Chaetomium coclioides Palliser | 491 |Укр.ИСХМ | | |1910 | | | |9 |Coriolus versicolor | 330 |ВИЗР | | |(L.1753:Fr. 1821) Quelet 1888 | | | | | | |Ленінград- | |10 |Fusarium solani (Martius) Sacc |464 |ський рег., | | |1881 | |грунт | | | | |РФ, | |11 |Fusarium solani (Martius) Sacc |496 |грунт | | |1881 | | | |12 |Phanerochaete chrysosporium | F-20 696|ATCC |.

7.1.1.2.Питательные среды.

Діяльність було використано такі живильні среды:

1.Среда Ван-Итерсона /41/, г/л:

NH4NO3 -0,5.

KH2PO4 -0,5 смужка фільтрувальної папери -1×12 см.

H2O -1 литр

2.Среда Ван-Итерсона модифікована /42/: мінерального складу середовища хоча б, що у класичному варіанті, смужка фільтрувальної папери инпрегнированна речовиною, котрій відбирається штамм-деструктор зміст речовини становить 5% від безлічі смужки бумаги.

3.Среда Чапека /41/, г:

KH2PO4 -1,0.

NaNO3 -3,0.

KCl -0,5.

MgSO4.7H2O -0,5.

FeSO4.7H2O -0,01.

H2O -1 литр

4.Среда Чапека з сахарозой/41/:

Мінеральний склад не змінювалась, добалено 30 г/літр сахарозы.

5.Сусло пивне неохмеленное /41/:

Неохмеленное пивне сусло розлучається вдвічі водогінної водою і стерилизуется.

Для отримання твердих поживних середовищ додавали 2 г/літр агарагара.

7.1.1.3.Субстраты.

7.1.1.4.Пробы.

Діяльність було використано зразки деревини телеграфних стовпів, які піддалися впливу мікроорганізмів (Новгородський регіон), люб’язно предоставленныe Марьяновской Юлією Валентинівною (кафедра МБТ СПбГТИ (ТУ)).

7.1.2.Методы.

7.1.2.1.Выделение культур микромицетов.

Виділення первинних культур велося на модифікованої середовищі Ван-Итерсона. Для усунення сторонніх мікроорганізмів зразок короткий час обпікали у полум'ї спиртівки і поміщали на сприятливе середовище. Мікроорганізми, що перебувають у поверхні, гинули, інші ж мікроби, що перебували всередині зразка зберігали життєздатність. Тривалість інкубації становила 60 діб. Інші умови обумовлюються особо.

Виділення чистих культур велося на агарі Чапека з використанням стандартних мікробіологічних методів /43/.

7.1.2.2.Изучение морфологічних і фізіолого-біохімічних властивостей культур микромицетов.

Для вивчення морфологічних, культуральних і физиологобіохімічних властивостей культур микромицетов використовували стандартні мікробіологічні середовища проживання і методи /41/.

Цитоморфологические спостереження проводили з допомогою загальноприйнятих методів і розчинів барвників /41/.

7.1.2.3.Отбор штаммов-деструкторов ПАУ.

Відбір целлюлолитических штамів мицеллиальных грибів оcуществляли на середовищі Чапека з целюлозою і ПАУ (зміст ПАУ 5% від безлічі целюлозного субстрату). Оцінка зростання здійснювалася визуально.

7.1.2.4.Твердофазное культивування микроорганизмов.

Культивування мицелиальных грибів у твердій фазі проводили в кюветах ємністю 0,5 л і суліях ємністю 30 л.

Зміст середовища в кюветах-250 р, в бутылях-2,5 кг. Перемішування здійснювали вручну: в кюветах-шпателем, в бутлях струшуванням. Періодичність перемішування й інші умови обумовлюються особо.

Культивування мицеллиальных грибів проводилося на спеціально розроблених середовищах, що становлять подрібнену деревину, инпрегнированную ароматичними речовинами і зволожену розчином солей і цукрів. Обсяг зволожуючою рідини становив 200- 400 мл на 1 кг древесины.

Посівної матеріал для кювет вирощували на чашках Петрі за тими ж середовищах. Чашки Петрі засівали суспензією суперечка, отриманої шляхом змиву зволожуючою рідиною з газону 7-суточной культури на агарі Чапека. Для засева сулій використовували вміст кювет, переважають у всіх випадках посівної матеріал вносився у кількості 10% від обсягу ферментаційної среды.

7.1.2.5.Фотолитическая обробка субстратов.

Субстрати поміщали в кюветы, які розташовувалися під джерелом випромінювання з відривом 50−60 див. Щоб уникнути перегріву поверхні субстрату, лампа працювала періодично, не понад чотири години протягом робочого дня.

Як джерела випромінювання використовували газоразрядную лампу ПРК-7 ((max=257,3 нм).

7.1.2.6.Определение ПАУ у твердій фазе.

Експериментальні зразки піддавалися сушінню в термостаті при 105ОС до постійного веса.

Екстракцію ПАУ здійснювали в апараті Сокслета протягом 6 годин. Як экстрагента використовували попередньо очищений від домішок вуглеводнів гексан.

Отриманий екстракт упаривали до невеликого (4−5мл) обсягу. Потім у нього додавали близько 1 г активованого силикагеля (Silpearl) і упаривали насухо. Далі пробу вносили в роздільну колонку з силикагелем і вимивали сторонні домішки 40мл гексана. Потім элюировали фракцію ПАУ 120мл суміші гексан: хлористый метилен (4:1). Фракцію, що містить ПАУ упаривали до обсягу 0,25−1,0мл.

Газхроматографический аналіз сконцентрованих компонентів проводили на хроматографе ''Цвет-570М'' з пламенно-ионизационным детектором на кварцової капілярної колонці (30м, 0,25мм) з нерухомій фазою DB-5 при програмному підвищенні температури від 70 до 320ОС зі швидкістю 4ОС на хвилину. Кількісні дані отримували методом абсолютної градуировки детектора стандартними розчинами ПАУ (''Экрос'', Санкт-Петербург). Градуировку по бенз[а]пирену здійснювали з допомогою ДСО 7064−93.

Ідентифікацію компонентів суміші здійснювали хромато-массспектрометрически на приладі LKB-2091 фірми LKB-BROMMA (Швеція). Хроматографічні умови були ж самі, що у разі кількісного аналізу. Ідентифікацію проводили шляхом порівняння масс-спектров електронного удару з допомогою комп’ютерної информационно-логической системи ''Компас-МС''.

7.2.Результаты і обсуждение.

7.2.1.Направленный пошук микромицетов-деструкторов ПАУ.

Мікробна деструкція экотоксикантов за останні десятиліття стала об'єктом інтенсивних досліджень практично переважають у всіх розвинених країн світу. Ефективність цього процесу визначається першу чергу активністю штамма-деструктора экотоксикантов. Необхідність інтенсифікувати процеси биоремедиации спонукає дослідників як до проведення селекції колекційних штамів, так і для пошуку нових деструкторів /44−46/.

Проведені эколого-таксономические засвідчили, що представники мікрофлори лісової підстилки (роду Alternaria, Cladosporium, Helmintosporium-подобные, Chaetomium та інших.), а як і грунтової мікрофлори (роду Aspergillus, Trichoderma, Penicillium та інших.) здатні розкладати лигниноцеллюлозу і руйнувати ароматні ядра лігніну /34/.

Фитопатогенные гриби як і здатні руйнувати природні аромитические речовини (Fusarium) /34/.

Зазвичай виділення штамів, розкладницьких ту чи іншу речовина, використовують рідкі чи агаризованные середовища, містять це речовина як джерело вуглецю і. Проте, по нашої думки, для биоремедиации варто використовувати мікроорганізми, поєднують в геномі здатність утилізувати як экотоксикант, і целюлозу, що міститься у грунтах і є основним компонентом твердих відходів. Ми вирішили, що найкращою середовищем для відбору микромицетов, що руйнують ПАУ в соокислительных умовах буде середовище Чапека з целюлозою і ПАУ. У ролі критерію відбору використовували загальноприйнятий метод оцінки зростання культур мицеллиальных грибів за влучним висловом його зростання в балах через певні, однакові всім штамів періоди часу. Така методика дозволяє відібрати найбільш резистентні і быстрорастущие штаммы.

Для виділення ПАУ-резистентных целлюлолитиков з природних біоценозів з погляду найбільше придатний середовище модифікована Ван-Итерсона /42/, де смужка фільтрувальної папери була инпрегнированна ПАУ. На середовищі селективно відбираються ПАУрезистентні мікроорганізми. Для відпрацювання методи і з єдиною метою пошуку штаммов-деструкторов ПАУ нами з техногенних біоценозів був виділено ряд микроорганизмов.

З біоценозу звалища старих телеграфних стовпів відібрали 5 проб деревини, має яскраво виражені биоповреждения. Проби поміщали в стерильні пробірки з ватно-марлевыми пробками висушували і зберігали при звичайних условиях.

Виділення первинної культури велося на модифікованої середовищі Ван-Итерсона. Для усунення сторонніх мікроорганізмів зразок короткий час обпікали у полум'ї спиртівки і поміщали на сприятливе середовище. Мікроорганізми, що перебувають у поверхні, гинули, інші ж мікроби, що перебували всередині зразка зберігали життєздатність. Тривалість інкубації становила 60 діб, температура підтримувалася лише на рівні +25ОС.

Ідентифікація велася на сусло-агаре і середовищі Чапека. Було виділено і ідентифіковано 5 штамів: Trichoderma linorum, Trichoderma sp. і трьох представника роду Fusarium. Зберігали штами на модифікованої середовищі Ван-Итерсона. У уникнення плутанини штаммам було присвоєно музейні номери (див. табл. 3.). таблиця 3 |№ | видове | музейний номер* | |в.п. |назва | | | |штами | | |1 |Trichoderma linorum | | | | |Н-1 | |2 |Trichoderma sp. | | | | |Н-2 | |3 |Fusarium sp. | | | | |Н-3 | |4 |Fusarium sp. | | | | |Н-4 | |5 |Fusarium sp. | | | | |Н-5 |.

*МНовгородський рег., 1- порядковий № штамма.

Для проводити дослідження ми використовували культури, виділені з техногенних біоценозів, а як і колекційні, люб’язно надані Оследкиным Ю. С. (разд.). Відбір штамів оcуществляли на середовищі Чапека з целюлозою і ПАУ (зміст ПАУ 5% від безлічі целюлозного субстрату). Оцінка зростання здійснювалася візуально. Результати представлені у таблиці 4.

таблиця 4 | | |коллекцион-|колонизация поверхні | |№ |назва | |субстрату, % | | | |ный/музейны| | | | |і | | |п.п.|штамма | номер | час інкубації, | | | | |добу | | | | штами |3 |6 |9 |12 |15 |20 | |1 |Trichoderma lignorum | 32 |0 |0 |2 |4 |2 |2 | |2 |Trichoderma lignorum | 37 |0 |10 |30 |45 |60 |60 | |3 |Trichoderma lignorum | 48 |0 |0 |10 |10 |10 |10 | |4 |Trichoderma linorum | Н-1 |0 |0 |10 |15 |15 |20 | |5 |Trichoderma sp. | Н-2 |0 |5 |10 |10 |10 |10 | |6 |Chaetomium elatum | 341 |0 |2 |4 |4 |8 |4 | |7 |Chaetomium bainieri | 344 |2 |2 |2 |4 |2 |2 | |8 |Chaetomium funicolum | 347 |0 |4 |4 |6 |4 |2 | |9 |Chaetomium coclioides | 491 |0 |0 |4 |6 |6 |2 | |10 |Coriolus versicolor | 330 |0 |0 |6 |8 |2 |2 | |11 |Fusarium solani | 464 |0 |0 |4 |6 |6 |6 | |12 |Fusarium solani | 496 |0 |0 |2 |2 |2 |2 | |13 |Fusarium sp. | Н-3 |0 |0 |4 |6 |6 |6 | |14 |Fusarium sp. | Н-4 |0 |2 |6 |8 |8 |8 | |15 |Fusarium sp. | Н-5 |0 |0 |6 |6 |6 |6 |.

Практично всі досліджувані мікроорганізми мали здатністю вона зростатиме і утворювати колонії лежить на поверхні субстрату. Проте в більшості культур відсоток заселення поверхні субстрату був незначний (до 10%). Очевидно таким культурам потрібно понад термін адаптації або наявність стимуляторів зростання. Найбільшою швидкістю розвитку і високим рівнем колонізації (до 60% площі субстрату) мав штам Trichoderma lignorum № 37. Характер зростання даного мікроорганізму відповідав каталожному опису й укладався на на початкових етапах освіти невеликих колоній діаметром 1−1,5 мм, поступово які зливаються у єдине ціле і формують поверховий міцелій світло зеленкуватого кольору. Цей штам і він бути відібраний для подальших исследований.

7.2.2.Микробная деструкція суміші ПАУ.

Аналіз літературних даних показав, основна маса робіт по деструкції ПАУ присвячена вивченню деструкції одного речовини чи суміші ПАУ/6,11,14/, що містить трохи більше 5 компонентів. Однак у реальних умов спектр ПАУ-экотоксикантов значно ширшим. Дані деструкції багатокомпонентних сумішей ПАУ у доступній літературі відсутні. Тим більше що вивчення процесів деструкції суміші экотоксикантов має дуже важливого значення і розробити процесів биоремедиации.

Для вивчення деструкції суміші ПАУ нами як модельного субстрату було обрано деревина шпал. Використання цього субстрату значно спрощувало роботу оскільки відпадала необхідність працювати з креозотом непосредственно.

Для приготування ферментаційної середовища субстрат змаліли до фрагментів близько 5 мм зволожували рідкої середовищем Чапека з сахарозой (см. разд.7.1.). Посівної матеріал вирощували в чашках Петрі такий самий середовищі. Обсяг ферментаційної середовища становив 250гр., посівної матеріал вносився у кількості десятьох % від обсягу середовища. Температура культивування становила 25оС, проби відбиралися на 14-те і 20-ті добу інкубації. Зміст ПАУ в експериментальних зразках визначали методом хромато-массспектроскопії (см. разд.7.1.). Результатів аналізу представлені у таблиці 5: таблиця 5 | | зміст ПАУ в зразках, | |речовина |мг/кг | | | контроль| 14 діб | 20 діб | |Нафталін | 22 | 0,4 | 0,1 | |Аценафтен | 7 | 2,2 | 0,4 | |Аценафтилен | 86 | 1,5 | 0,4 | |Флуорен | 86 | 3,1 | 2,9 | |Фенантрен | 1840 | 87 | 43 | |Антрацен | 600 | 24 | 12 | |Флуорантен | 1430 | 350 | 210 | |Пирен | 520 | 100 | 71| |Бензантрацен | 230 | 8 | 2,7| |Хризен | 160 | 22 | 15| |Бенз (b)флуоранте| 45 | 12 | 4,3| |зв | | | | |Бенз (k)флуоранте| 34 | 3,6| 27| |зв | | | | |Бенз (a)пирен |35 |5,9 |2,8 | |Дибензантрацен |18 |2,7 |4,4 | |Бензперилен |10 |4,7 |21 | |Инденопирен |9 |3,4 |16 |.

Аналіз експериментальних даних із деструкції ПАУ, наведені у табл.45 показав, що різні за будовою ПАУ руйнуються Trichoderma lignorum із швидкістю. Прості ПАУ, такі як нафталін, антрацен, фенантрен більшою мірою піддаються деструкції, ніж многоядерные. Літературні /40/ дані свідчать, що мікробна деструкція нафталіну ферментами оксигеназами відбувається послідовно і з гидроксилирования лише одну аромтического кільця (див. рис. 6.).

Відповідно до правилом послідовного окислення лише одного ароматичного кільця складні 4х-5ти ядерні ПАУ меншою ступеня піддаються повного розпаду. Слід зазначити, що у момент відбору проб для аналізу, у субстратах під впливом мікробних ферментів відбуваються складні процеси зміни кількісного співвідношення ПАУ. Можливо той процес обумовлений явищем конденсації частково окислених вуглеводнів. Для перевірки цієї гіпотези було проведено експерименти зі збільшенням терміну культивации.

Дослідження проводили з допомогою раніше описаних методів і середовищ, проте вони внесено деякі изменения:

1.Применялись більші фрагменти, що раніше. Лінійні розміри фрагментів становили 10×10×20 див (кубики).

2.При формуванні середовища в ферментаційних ємностях обсягом 10 літрів було виконано розведення просякнутих креозотом кубиків чистими кубиками, тріскою і тирсою у відсотковому співвідношенні 1:1.

Посівної матеріал вносився у кількості 10%. Температура інкубації становила 28ОС. Субстрат періодично зволожували розведеним водогінної водою неохмеленным пивним суслом (2% сахаров).

Культура Trichoderma lignorum № 37 активно колонізує поверхню кубиків, причому початкова прикріплення й активна розмноження починається з чистих, які містять ПАУ кубиків. Така послідовність, очевидно, пов’язані з адаптацією культури та накопиченням серед активних ферментів. Наприкінці 20-х діб культура колонізує до70% поверхні субстрата.

Відбір проб проводився на 30-ті і 40-ве добу інкубації. Визначення змісту ПАУ в зразках проводили відповідно до раннє зазначеним методом. Результатів аналізу представлені у таблиці 6:

таблиця 6 | |зміст ПАУ в зразках, мг/кг | |речовина | | |тримання ПАУ |контроль |30 діб |40 діб | |Нафталін |7 |3,8 |0,42 | |Аценафтен |16 |2,5 |1,1 | |Аценафтилен |170 |1,7 |0,31 | |Флуорен |337 |8,3 |0,91 | |Фенантрен |797 |1230 |7,4 | |Антрацен |303 |320 |2,1 | |Флуорантен |619 |1450 |9,8 | |Пирен |382 |630 |3,1 | |Бензантрацен |94 |37 |7,9 | |Хризен |50 |42 |3,8 | |Бенз (b)флуоранте|5,5 |29 |0,87 | |зв | | | | |Бенз (k)флуоранте|23,5 |39 |0,94 | |зв | | | | |Бенз (a)пирен |15 |9,6 |0,29 | |Дибензантрацен |3,5 |24 |0,99 | |Бензперилен |10 |69 |0,32 | |Инденопирен |1 |49 |1,3 |.

Як очевидно з представлених даних на 30-ті добу процесу мікробної деструкції зберігається накопичення ПАУ, відзначене раннє. Збільшується кількісний вміст инденопирена (контрольний образец-1 мг/кг, 30-ті добу- 49 мг/кг), бензперилена, дибензантрацена і бенз[к]флуорантена. У порівняні з раннє отриманими результатами на 30-ті добу виявлено додаткове збільшення змісту бенз[в]флуорантена (вп'ятеро), незначне збільшення пірена, флуорантена і антрацену. Це перерозподілом речовини між компонентами суміші ПАУ у процесі мікробної переробки нафти та меншою швидкістю деструкції, зумовленої переходом до більшим фрагментами субстратукубикам.

Певне ще руйнації ПАУ потрібно понад термін ферментації. Результат аналізів проб відібраних по закінченні 40 діб переконливо показав, що тільки зміст инденопирена зберігається колишньому рівні (контрольний образец-1 мг/кг, 40-ві сутки-1,3 мг/кг). Зміст решти компонентів суміші під кінець 40-х діб різко знизилося й сягнуло свого мінімальних значень. На 40-ві добу інкубації зникає, відзначене раннє явище накопичення полиядернях компонентів суміші, що з конденсацією продуктів часткової деструкции.

Паралельно нами було старанно вивчене процес деструкції суміші ПАУ грибом Phanerochaete chrysosporium. Цей мікроорганізм є найперспективнішим серед микромицетов деструктором ароматичних ксенобіотиків, йому присвячено дуже багато робіт. Проте відомостей по деструкції їм багатокомпонентних сумішей ПАУ у літературі як і немає. У цьому мало сенс вивчити даний питання. Відповідно до раннє описаними методиками було старанно вивчене процес деструкції ПАУ. Як субстрату використовували кубики, аналіз змісту ПАУ проводили методом хромато-масс-спектроскопии. Результати дослідження представлені у таблиці 7.

Відповідно до наведених експериментальних даних, гриб Phanerochaete chrysosporium активно руйнує ПАУ. Причому важливо відзначити, що раннеее бачимо явище перерозподілу ПАУ зберігається у разі Phanerochaete chrysosporium (инденопирен, бензперилен, дибензантрацен). Разом про те під кінець 40-х діб зміст ПАУ в субстраті різко снижается.

Отже підтверджується принцип послідовного окислення ПАУ і спільність механізмів деструкції цих речовин у різних микроорганизмов.

таблиця 7 | |зміст, | |речовина |мг/кг | | |контроль |30 діб |40 діб | |Нафталін |7 |2,1 |1,1 | |Аценафтен |16 |1,2 |1,9 | |Аценафтилен |170 |0,98 |0,54 | |Флуорен |337 |2,9 |0,82 | |Фенантрен |779 |790 |14 | |Антрацен |303 |190 |5,4 | |Флуорантен |619 |840 |210 | |Пирен |382 |280 |64 | |Бензантрацен |94 |23 |11 | |Хризен |50 |30 |32 | |Бенз (b)флуоранте|5,5 |5,7 |9,4 | |зв | | | | |Бенз (k)флуоранте|23,5 |36 |20 | |зв | | | | |Бенз (a)пирен |15 |4,4 |0,49 | |Дибензантрацен |3,5 |8,3 |9,5 | |Бензперилен |10 |17 |3,8 | |Инденопирен |1 |21 |7,9 |.

7.2.3.Применение опромінення ((=257,3 нм) для предобработки ПАУмістять субстратов.

У природні умови ПАУ розкладаються під впливом комплексу численних чинників: мікробної деструкції кліматичних умов та інших. Сонячний світло безсумнівно повинен впливати на ПАУ. Для перевірки цього припущення нами було створено лабораторна установка (рис. 3.) з газоразрядной лампою ПРК-7 ((=257,3 нм). Кюветы з подрібненими фрагментами просякнутої креозотом деревини (фрагменти 5 мм) поміщали в кюветы і піддавали опроміненню. Щоб уникнути перегріву поверхні субстрату установка працювала періодично, трохи більше 4-х годин на добу. Проби відбирали після закінчення 16-ти і 20-ти годин опромінення. Аналіз змісту ПАУ проводили за методикою, описаної раннє. Результати експериментів представлені у таблиці 8: таблиця 8 | |зміст, | |речовина |мг/кг | | |контроль |16 годин |24 години | |Нафталін |22 |0,26 |0,10 | |Аценафтен |7 |0,58 |0,76 | |Аценафтилен |86 |0,40 |0,52 | |Флуорен |86 |14 |8,9 | |Фенантрен |1840 |140 |93 | |Антрацен |600 |24 |24 | |Флуорантен |1430 |640 |110 | |Пирен |520 |490 |27 | |Бензантрацен |230 |3 |9,9 | |Хризен |160 |24 |41 | |Бенз (b)флуоранте|45 |24 |23 | |зв | | | | |Бенз (k)флуоранте|34 |13 |14 | |зв | | | | |Бенз (a)пирен |35 |7,3 |4 | |Дибензантрацен |18 |5,8 |5,3 | |Бензперилен |10 |16 |6,5 | |Инденопирен |9 |14 |21 |.

З таблиці 8 видно, що під впливом ультрафіолетового випромінювання відбувається деструкція ПАУ. Зафіксовано зниження змісту нафталіну, антрацену, флуорена і фенантрена в 10−20 раз. Зміст аценафтилена зменшилась у 170 раз. Аналогічно ведуть себе більшість компонентів смеси.

Слід зазначити, що знайдене нами явище фотолиза ПАУ добре збігаються з раннє опублікованими даними. Так французькі дослідники показали сприятливий вплив фотолитической деструкції антрацену та її перетворення на антрахинон для наступної деструкції асоціацією морських мікроорганізмів /47/. Автори відзначають, що руйнація 50% антрахинона в глибинних умовах відбувається поза 10 діб. Аналіз продуктів розпаду показав наявність слідових кількостей бензойної і фталевої кислот (рис. 7.).

Рис. 7.Процесс фотолитической деструкції антрацена.

Слід зазначити, що окислювання антрацену та її перетворення на антрахинон, ймовірно, є який ініціює чинником для наступної мікробної деструкции.

Аналіз експериментальних даних показує, що бензперилен і инденопирен є стійкими до дії опромінення. Аналогічна картина була і при мікробної деструкції ПАУ. Повидимому, це явище, знайдене при деструкції ПАУ різними методами, можна пояснити збільшенням реакційної здібності продуктів фотолитической і мікробної деструкції ПАУ.

З раннє наведених даних видно, що початковим загальної стадією розкладання ароматичного кільця є його окислювання. У подальшому таких структур, як, наприклад о-оксибензойная кислота, продукт розкладання нафталіну, легко входять у реакції приєднання з складнішими продуктами деструкції, наприклад, з окисленої формою пірена, з і накопиченням у системі инденопирена (рис. 8.):

Рис. 8.Образование инденопирена.

Висловлене припущення й імовірний механізм перебігу реакцій між продуктами деструкції потребує додаткової експериментальної перевірці. Проте, явище фотолитической деструкції ПАУ можна використовуватиме предобработки цих речовин під час проведення їх мікробної утилизации.

7.2.4.Происхождение микроорганизмов-деструкторов ПАУ.

Інтенсивне промислове вплив на довкілля почалося порівняно нещодавно у ХІХ столітті. Вочевидь, що з настільки стислий період часу було неможливо еволюціонувати ферментні системи, здатні руйнувати ПАУ. Проте літературні дані /4,6,11,14,37,/ і наші власні експерименти показують, що сучасні мікроорганізми такий здатністю мають, тобто у їх геномі вже сьогодні є гени деструкції цих веществ.

Швидше за все, що перших мікроорганізмів, що руйнують ПАУ слід зарахувати до епосі появи перших судинних рослин, які містять лігнін в клітинної стінці - деревоподібних папороті. Вік найдавніших папоротникообразных становить близько 380 млн. років (кінець Силурійського періоду) /48/. Деревина сучасних рослин містить низку речовин, що мають у собі нафталиновое ядро /15/. Під впливом сонячного світла, і мікроорганізмів (власні дані), і навіть при горінні біомаси /49/, можуть утворюватися (внаслідок процесів конденсації) складніші ПАУ. У такий спосіб Землі були всі умови для природного відбору микроорганизмов-деструкторов ПАУ, природним резервуаром є грунт і лісова підстилка. Логічно припустити, що це мікроорганізми, після інтродукції можуть придбати здатність руйнувати полиароматические речовини і феноли. Що стосується низькою субстратной специфічності ферментної системи мікроорганізму можливо руйнація ароматичних экотоксикантов-ксенобиотиков (нитротолуолы, нитрофенолы, хлорфенолы ит.д.).

7.2.5.Анализ можливість створення систем по утилізації твердих ПАУмістять отходов.

У зв’язку з погіршенням екологічної обстановки перед дослідниками постало завдання розробки методів утилізації шкідливих відходів виробництва та комунального хозяйства.

Запропоновані нами методи фотолитической предобработки техногенних, ПАУ містять субстратів, та його мікробної деструкції дозволяють створити провадження з утилізації комунальних відходів, містять ПАУ. Прикладом їх є листовий опад у містах, загрязненнй як ПАУ, і мастилами, смолами і рідкими нафтопродуктами. Предобработку фотолизом можна проводити без особливих витрат витримуючи субстрати на спеціальних майданчиках. Влітку для якісної предобработки буде досить 4−5 сонячних днів. Далі субстрати переміщують у ферментаційні ангари і вносять увлажняющую середовище, й посівної матеріал. Инкубацию ведуть при температурі 20−30ОС протягом 40−60-ти діб (залежно від ГДК экотоксикантов). Виробничий процес бажано ведуть у тепле сезон (із травня до жовтня) позаяк у цей період непотрібен витрачати енергію на обігрів ферментаційних ангарів. У процесі ферментації утворюється компост, яке можна використовувати як почвообразователь. Схема установки із переробки ПАУ містять відходів представлена малюнку 9:

Рис. 9.Схема установки по утилізації ПАУ містять отходов.

8.Стандартизация.

Діяльність використовувалися матеріали, прилади, устаткування, посуд, відповідальні державною мовою і галузевим стандартам. Перелік стандартів приведено в таблиці 9:

9.Охрана праці та оточуючої среды.

Заходи, що проводилися розділі ''Охорона праці та довкілля'' дуже важливі, бо їх виконання забезпечує безпечність виконання експериментів в людини й навколишнього среды.

9.1.Характеристика небезпечних і шкідливих виробничих факторов.

Відповідно до /50/, небезпечні й шкідливі виробничі чинники діляться ми такі групи: фізичні, хімічні, біологічні і психофізичні. До фізичним небезпечним i шкідливим виробничим чинникам відносять електрику, ультрафіолетове випромінювання. Група хімічних небезпечних і шкідливих виробничих факторів, і їх вплив на людини представлені у таблиці 10, яка складена відповідно до /1,51,52,53/.

Біологічні небезпечні й шкідливі виробничі чинники відсутні, оскільки використовувані мікроорганізми є непатогенными.

9.2.Пожаробезопасность.

Оскільки ми можемо розрахувати пожежну навантаження, не можна визначити категорію приміщення по /54/. Відповідно до ПУЭ-85 /55/, клас вибухонебезпечною зони лабораторії В-1б. На випадок пожежної небезпеки до лабораторій є кошти огнетушения: вогнегасники марки ОХЛ- 10, ОУ-2, ящик з піском, азбестові ковдри. З метою електробезпеки все прилади до лабораторій заземлены.

Характеристика фізико-хімічних, пожаровзрывоопасных і токсичних властивостей сировини, готового продукту і відходів производства.

таблиця 10.

| |Фізико-хімічні властивості |Пожаровзрывоопасные властивості /52/ |Токсичні властивості | | |речовини /51/ | | | | | | | | |Температура|Пределы поширення | | | | | | | | | |, tо З |полум'я | | | | | |Агрега|Темпер|Темпер|Плот| | |Температурны|Концентрационн| | Клас| | |Вещест-|т-ное |а-тура|а-тура|-нос|Вспы|Само-|е, tоС |ые, про. % | | |ПДКр| |ва |состоя|кипени|плавле|ть, |шки |воспл| | | |опасно|.з | | |ние |я, |- | | |а- | | |Характер действия|сти |мг/м| | | | | |кг/м| | | | |на | |3 | | | | | |3 | | | | | | | | | | |tоС |ния, | | |менен| | | | |організм |/53 / |/ | | | | |tоС | | |іє |нижни|верхн|нижний|верхни|человека / 2 / | |53/ | | | | | | | | |і |ий | |і | | | | | | | | | | | | | | | |Діє на ЦНС | | | |Етанол |ж |78.5 |-114.6|785 |13 |400 |11 |41 |3.6 |17.7 |і печінку |IV |1000| |Нафтали|тв |218 |80.28 |1140|80 |520 |- |- |0.9 |- |Діє на ЦНС,|IV |20 | |зв | | | | | | | | | | |шлунок, нирки. | | | | | | | | | | | | | | |Лейкоцитоз | | | |Антраце|тв |351 |216, 6|1132|121 |472 |- |- |- |- |Фотодерматит, |- |- | |зв | | | | | | | | | | |еритема | | | |Аценафт|тв |270 |92 |1160|- |- |- |- |- |- |Діє на |- |- | |илен | | | | | | | | | | |шкіру, слизову | | | | | | | | | | | | | | |оболонку | | | |Аценафт|тв |279 |96 |831 |- |359 |- |- |12 |- |Діє на |III |10 | |єп | | | | | | | | | | |нирки, печінку | | | |Пирен |тв |392 |149 |1277|- |- |- |- |- |- |Лейкоцитоз, |- |- | | | | | | | | | | | | |порушення функції| | | | | | | | | | | | | | |печінки | | |.

9.3.Санитария і гигиена.

Забезпечення нормальних санітарно-гігієнічних умов у лабораторії необхідне нормальної роботи персоналові та зменшення небезпеки професійних захворювань, і травм.

Задля більшої нормальних метеорологічних умов і чистоти повітря на лабораторії встановлено вытяжная вентиляція 2Ш-НЖ /56/, швидкість руху повітря 0,4 метри в секунду. Відповідно до /57/ необхідно дотримуватися такі правила роботи з припливно-витяжної вентиляцией:

1.Перед початком роботи необхідно перевірити, працює чи вытяжная система і чи є потяг повітря через дверцята шкафа.

2.При про наявність у шафі проміжків між шафою і стінкою чи інших несправностей працювати у вытяжном шафі нельзя.

3.Мотор витяжного вентилятора необхідно включити за 15 хвилин на початок роботи. Клапан відкривають поступово, газову хлопавку на воздуховоде закрывают.

4.Во час дверцята шафи нічого не винні відкриватися більше ніж 1/3 робочого сечения.

Запрещается:

1. Працювати з цілком відкритими дверцами.

2. Просовувати голову всередину шкафа.

3. Користуватися несправними вентиляційними установками.

Задля підтримки теплового равновессия між теплом чоловіки й довкіллям до лабораторій є система центрального отопления.

По завданням зорової роботи лабораторія належить до I-ой групі. Висвітлення поєднане: природне бічне одностороннє (одне вікно) і штучне висвітлення лампами денного світла. Розряд зорових работ-IVв. Освітленість від джерел загального штучного висвітлення 200лк (три газорозрядних лампи) /58/.

Щоб запобігти травм і надання першої медичної допомоги при нещасних випадків, до лабораторій в доступному місці є аптечка У аптечці повинні прагнути бути: перев’язувальні матеріали, 5%-ый спиртової розчин йоду, 2%-ый розчин борної кислоти, 2%-ый розчин гідрокарбонату кальцію, 2%-ый розчин перманганату калію, 2%-ый розчин оцтової кислоти, етиловий спирт, активоване вугілля, серцеві препарати, пластир, джгут, очні піпетки, скляні палички, ножиці. Весь персонал, працював у лабораторії, повинен бути навчений способам надання першої медичної помощи.

9.4.Безопасная робота у лаборатории.

За виконання роботи деякі операції мали потенційної небезпекою. Перелічення й характеристика операцій зведені в таблиці /11/.

Діяльність використовувалися ЛВЖ і горючі рідини, токсичні речовини (суміш ПАУ) культури грибів, і навіть електрообладнання (ваги, ультрафіолетова лампа, хромато-масс-спектрометрический прилад, холодильник, автоклав). Правила роботи з вищеназваними речовинами і приладами наведено ниже.

Правила роботи з ЛВЖ і пальними жидкостями.

1.Вся роботу з ЛВЖ має проводитися лише у вытяжном шафі при відсутності відкритого джерела огня.

2.Переливание ЛВЖ проводиться при відключенні нагрівальних приборов.

3.На робоче місце дозволяється тримати горючі речовини у цьому кількості, що слід у цей момент.

4.Хранить ЛВЖ до лабораторій дозволяється у кількості не перевищує добову потреба (до 2−3 л на людини).

5.ЛВЖ мусить зберігатися в закритих замком металевих ящиках з піском дно якої (шар 4−5 див).

6.Перед початком роботи з ЛВЖ необхідно підготувати кошти гасіння пожара.

7.Работать лише у рукавичках і халате.

Фундаментальна обізнаність із токсичними веществами.

Працюючи з тими речовинами необхідно попередньо вивчити фізико-хімічні властивості, характер дії на чоловіки й дотримуватися особливі заходи предосторожности:

1.Работа з токсичними речовинами повинні проводити за вытяжном шафі, потужність витяжний вентиляції якої забезпечує щонайменше 15-кратный обмін воздуха.

2.Все роботи мають вестися в халаті і гумових перчатках.

3.Токсичные речовини зберігаються у сталевому ящику під замком, на кожної пляшці мусить бути этикетка.

4.Стеклянные колби, банки і той тару з токсичними речовинами не годилося залишати на столе.

5.Наполнение судин слід проводити сифоном чи піпеткою з грушей.

6.После експерименту прилади й посуд старанно знешкоджуються исполнителем.

7.После закінчення роботи необхідно старанно вимити руки, залишки розчинів токсичних речовин злити у спеціальні склянки.

Правила роботи з микроорганизмами.

Бо у роботі використовувалися непатогенні мікроорганізми, під час роботи із нею слід дотримуватися звичайні заходи для безпеки /59/:

1. Працювати лише у спецодягу, робочому місці не їсти, не пити і курить.

2. Після закінчення роботи старанно вимити руки чи прийняти душ.

Посуд мити 2%-ым розчином соди й одержання гарячої водой.

3. Робоча місце обробляти дезінфекційними засобами, етиловим спиртом і стерилізувати бактерицидними лампами.

Фундаментальна обізнаність із электроприборами.

Усі електрообладнання лабораторії має відповідати ПУЭ- 85 /55/.

Працюючи з електроприладами необхідно дотримуватися такі правила:

1.Нельзя працювати з приладами одному человеку.

2.Следить за справністю приладів, штепсельних виделок, розеток, дротів, через відсутність на приладах оголених токоведущих частей.

3.Убедиться перед роботою, що у заземленных приладах включено заземление.

4.Включать прилад дозволяється лише у ту мережу, напруга який відповідає напрузі, позначеному на приборе.

Відповідно до/ / клас приміщення по небезпеки поразки людини електричним струмом — без підвищеної небезпеки .

9.5.Меры першої допомоги при нещасних випадків в лаборатории.

Доврачебная допомога має бути надана постраждалому товаришами для роботи. Согласно/60/ необхідно ухвалити такі меры:

1.При порізах рану промивають 2%-ым розчином перманганату калію, змазують краю рани розчином 5%-ым йоду і накладають стерильну пов’язку. Рану не можна промивати водой.

2. При забиті місця постраждалому треба створити спокій, до забитого місцеві прикладати холодні примочки до приходу врача.

3. При венозному кровотечі накладати давящую пов’язку і, якщо кровотеча не зупиняється, накладається джгут чи закрутка.

4. При хімічних опіках шкіру промивають багатою струменем води, та був обрабатывают:

— при опіках кислотами — слабким розчином питної соди, чи присипають обпалене місце крейдою чи окисом магния;

— при опіках лугами — слабкими розчинами оцтової чи лимонної кислоты.

5.При потраплянні хімічних речовин, у очі слід негайно рясно промити очі струменем воды.

6.При поразку электротоком:

— не можна брати постраждалого голіруч, щоб звільнити враженого струмом, необхідно відключити электроприбор;

— перевірити пульс і дыхание;

— повідомити про все це у найближчий медпункт;

— якщо дихання і пульс є, постраждалого необхідно покласти у зручний становище, дати понюхати нашатирний спирт, якщо пульсу немає, враженого покласти на рівну поверхню й розпочати штучному подиху «рот до рота «із частотою 10−12 вдуваний на хвилину. Другий то вона може робити одночасно масаж серця зі швидкістю 60−70 разів у хвилину. Слід терміново викликати врача.

7.При термічних опіках необхідно вражений ділянку шкіри закрити сухий асептической пов’язкою, цьому можна як або очищати шкіру. Потім звернутися у медпункт.

8.При ингаляционных ураженнях парами і аэрозолями токсичних речовин постраждалого необхідно вивести (винести) на свіжий повітря, звільнити то стягивающей одягу, створити йому абсолютний спокій, покласти горілиць тепло укутати й може викликати врача.

9.6.Охрана оточуючої среды.

У результаті дипломної роботи, у процесі експериментів виникали виробничі відходи. Їх характеристика представленій у таблиці 12.

Бо можливості використання відходів немає, їх слід утилізувати. Розчини реактивів після роботи направлялися залежно від виду в органічний чи неорганічний слив задля її подальшого їх знешкодження і утилізації. Усі небезпечні відходи інституту утилізуються на спеціальному полигоне.

Характеристика виробничих отходов.

таблиця 12 | | | | | | | | |Наиме-нование|Коли-че|Агре-г|Т, |Наименован|Содержа|Приме-чан| |відходу |ство |атное |градусів |не |ние |не | | |м3/ч |перебуваючи| |вред-ных |вред-ны| | | | |-ние | |примі |x | | | | | | |цей |примес-| | | | | | | | | | | | | | | |їй, % | | | | | | | | | | |Відпрацьовані |0.05−0.|Тв. |25 |ПАУ |0.025 |На | |живильні |1 | | | |(масс.)|свалку | |середовища |кг/нед | | | | | | | | | | | | |На | |Відпрацьовані | | | |Суперечки й |0.1- |автокавир| |культури |50 грн |Тв. |25 |вгетативн-|-1% |-ование і| |микроорганиз-|в місяць| | |ый мицелий|(масс.)|затем на | |мов | | | | | |смітник |.

10.Технико-экономическая оцінка результатів исследования.

10.1.Анализ ринку можливої реалізації результатів исследования.

10.1.1.Сегментация рынка.

Потенційним споживачем ідеї є промислове виробництвоутилізація целюлозного сміття. Проблема збереження і переробки виробів і конструкцій з деревини, просякнутої метою консервації різними фунгицидными речовинами, є одним із найважливіших проблем утилізації відходів лігноцелюлозної сировини. Такі вироби відповідно до жорсткими вимогами екологічну безпеку важко утилізувати традиційними методами: спалюванням чи захороненням у грунті, оскільки це викликає інтенсивне забруднення атмосфери чи підгрунтових вод продуктами термічного або хімічної розкладання використовуваних фунгицидных добавок. Найперспективнішими і екологічно безпечними є біотехнологічні методи переробки цього виду відходів, засновані на ферментативної активності микроорганизмов.

Нині дослідження процесів деградації ПАУ мають великий інтерес в учених США, Японії, країн ЄЕС, Росії. Більшість робіт фінансуються хімічними фірмами чи фірмами, які працюють у сфері захисту навколишнього среды.

10.1.2.Позиционирование товара.

Є кілька альтернативних підходів на вирішення цієї проблеми — утилізації комунальних (целлюлозных) отходов:

Варіант № 1. Хімічна .обработка-варка тріскиприготування грунту чи компоста.

Пов’язана із використанням хімічних реагентів, викликають забруднення об'єктів довкілля (кислоти, луги). Технологічний процес варіння целюлози на заводах целлюлознопаперову промисловість передбачає великий витрата технічної води та освіту промислових стоків. Утворюються неутилизированные продуктицелюлоза і лигнин.

Варіант № 2. Примусове спалювання з головою повітря — зола — приготування компостов.

Такий спосіб представляє екологічну небезпека, пов’язану із заснуванням вторинних газоподібних відходів, забруднюючих атмосферу. Метод вимагатиме великих витрат енергоносіїв, дорогого, устаткування по газоочистке продуктів термічної обробки ПАУ.

Варіант № 3. Здрібнення до тирси — обробка — бактеріями — органічний субстрат — приготування компостов.

Він належить до биотехнологическому і передбачає використання анаеробних бактерій Зазначений процес відбувається лише за відсутності кисню і вимагає певних витрат за створення герметичного резервуара. Утворюється значну кількість газів, як-от: метан, сірководень, вуглекислий газ. До який відходить газам будуть додаватися продукти переробки ароматичних вуглеводнів, що використання метану в побутових умовах ролі енергоносія. Потрібні видатки очищення і поділ газов.

Запропонований нами метод переробки древоразрушающими грибами не вимагають великих витрат енергоносіїв, витрати хімічних реагентів. Під час проведення процесу відсутня виділення токсичних газів, що знижує питання про створення систем газоочистки. Збільшується швидкість процесу зменшується кількість виробничих стадій (випадає стадія видалення ПАУ). Отриманий продукт розкладання після перевірки на патогенність і токсичність для риб і тварин то, можливо спрямовано приготування грунтів і компостов.

На базі розробки нашої ідеї існують ряд проблем:

1.Технические: необхідно забезпечити надійну аерацію, перемішування, яке справляло б сильного впливу зростання мікроорганізмів. Необхідно забезпечити очищення відведених від суперечка газів. Необхідно підібрати оптимальні температуру і вологість для зростання микроорганизмов.

2.Социальные:так як виробництво шкідливе, необхідно розробити систему охорони труда.

10.2.Расчет витрат за проведення дослідницької работы.

Витрати для проведення дослідницької роботи можуть бути з поточних і капітальних. Поточні витрати виникають і під час будь-якого дослідження. До їх складу входять: видатки витрачені своєю практикою сировину, матеріали, реактиви, різні види енергії, скляну посуд і прилади, амортизаційні відрахування з вартості лабораторного оборудования.

Капітальних витрат у ході дипломної роботи было.

10.2.1.Расчет поточних затрат.

Витрати сировини, матеріали і реактиви, витрачені на проведення дослідження, кожному за виду ресурсів: n.

Зм=(Pi.Цi, i=1,2,…n, де i=1.

Piвитрата i-го виду матеріальних ресурсів (в натуральних еденицах измерения).

Цiпланово-заготовительная ціна, т.руб.

Результати розрахунку наведені у таблиці 13.

Розрахунок витрат за скляну посуд представлено таблиці 14.

Енергетичні витрати містять у собі Витрати електроенергію, пар, воду, холод, використані на технологічні нужды.

Витрати на электроэнергию:

Зэ=М.Кu.Т.Ц, где.

Мпотужність приладів, КВт;

Кuкоефіцієнт використання устаткування, Кu=0,8;

Тчас устаткування за період виконання дослідження, час;

Цціна 1КВт год електроенергії, т.руб., Ц=0,195 .

Результати розрахунку наведені у таблиці 15.

Витрати інші види енергії: n.

Зв=(Рi Цi, i=1,2,…, n, де i=1.

Рiорієнтовний витрата води (пара, холоду), (в натуральних еденицах).

Цiціна, т.руб., (ціна 1 м³ воды=4,16 т.руб.).

Сума амортизаційних отчислений:

Ф На Т.

А = __________________, где.

100 12.

Фвартість устаткування й приладів, використаних для проводити дослідження, т.руб. ;

Нарічна норма амортизації, На=10%;

Т-время використання приборов.

Результати розрахунку наведені у таблиці 16.

Розрахунок витрат за сировину, матеріали і реактивы.

таблиця 13 | | |Кількість | | | |Наименован-ие|Ед. Ізм. |израсходованны|Цена, |Сума, | | | |x матеріалів |т.руб. |т.руб. | |Етанол |л |10 |20 |200 | |Середовище Чапека |л |2 |12 |24 | |Сахароза |кг |0,2 |48 |9,6 | |Агар-агар |кг |0,04 |360 |14,4 | |Дріжджовий | | | | | |екстракт |кг |0,005 |250 |1,25 | |Сусло пивне | |2 |6 |12 | |неохмеленное |л | | | | |Креозот |кг |0,5 |10 |5 | |Бумагафильтр-| | | | | |овальна |упаковка |1 |5 |5 | |Усього: | | | |271,25 |.

Витрати на скляну посуд таблица14 |Найменування |Ед. Ізм. |Количес-тво |Ціна, т.руб.|Сумма, | | | | | |т.руб. | |Чашки Петрі |прим |100 |1,125 |112,5 | |Піпетки на: 2мл|шт |5 |12 |60 | | | |5 |16 |80 | |5мл | | | | | |Колби | |12 | | | |качалочные на |прим | |40 |480 | |750мл | | | | | |Пробірки на 20 |прим |300 |1,6 |480 | |мл | | | | | |Усього: | | | |1192,5 |.

Амортизаційні відрахування на скляну посуд ухвалюватимуть у розмірі 30% від неї вартості, що становить 357 750 рублей.

Розрахунок витрат за електроенергію таблиця 15 |Найменований| | | | |не |М, кВт |Т, год |Витрата електроенергії, | |обору-дова| | |кВт год | |ния | | | | |Автоклав |6 |20 |120 | |Терези |0,1 |5 |0,5 | |ВЛР-200 | | | | |Шафа |1,6 |40 |64 | |сикатив | | | | |Холодильни|0,18 |3600 |648 | |до | | | | |Газоразряд|0,6 |24 |14,4 | |-ная лампа| | | | |ПРК-7 | | | | |Витяжною |2.5 |10 |25 | |шафу | | | | |Хромато-ма|2 |5 |10 | |сс-спектро| | | | |-метр | | | | |LKB-2091 | | | | |Усього: | | |881,9 |.

Зэ= 0,8 195 881,9=13 757 рублей.

До складу енергетичних витрат крім витрат за електроенергію входять видатки воду. У виконання роботи витрачалося орієнтовно 7 л води щодня, а й за період роботи близько 0,84 м³. Отже витрати на воду становлять 3494 рублей.

Розрахунок амортизаційних відрахувань таблиця 16 |Наименова-ни| | | | | |е |Ф, т.руб. |На, % |Т, міс. |А, т.руб. | |оборудован-и| | | | | |я | | | | | |Автоклав |3500 |10 |0,33 |0,88 | |Терези ВЛР-200|3000 |10 |0,007 |0,18 | |Шафа | | | | | |сикатив |4000 |10 |0,06 |2 | |Холодильник |1500 |10 |5 |62,5 | |Газоразрядна|1500 |10 |0,03 |0,38 | |я лампа | | | | | |ПРК-7 | | | | | |Витяжний | | | | | |шафу |8500 |10 |0,014 |0,99 | |Спиртівка |30 |10 |0,5 |0,13 | |Хромато-масс| | | | | |-спектрометр|1 200 000 |10 |0,007 |70 | |Усього: | | | |137,06 |.

10.2.2.Расчет витрат за проведення додаткових работ.

Для повного завершення досліджень необхідно проведення цілої низки додаткових мероприятий:

1.Оптимизация живильним среды:

— за змістом цукрів (додаткове джерело углерода).

— за змістом дріжджового екстракту (стимулятора роста).

2.Оптимизация параметрів технічної установки.

Розрахунок витрат за сировину, матеріали і реактиви представлено табл.18:

Розрахунок витрат за сировину, матеріали і реактиви. таблиця 18 | | |Кількість | | | |Найменування |Ед. Ізм. |израсходованны|Цена, |Сума, | | | |x матеріалів |т.руб. |т.руб. | |Середовище Чапека |л |400 |12 |4800 | |Сахароза |кг |12 |48 |576 | |Дріжджовий |кг |0,5 |250 |125 | |екстракт | | | | | |Усього: | | | |5501 |.

Розрахунок витрат за скляну посуд представлено таблиці 19.

Витрати на скляну посуд таблиця 19 |Найменування |Ед. Ізм. |Количес-тво |Ціна, т.руб.|Сумма, | | | | | |т.руб. | |Колби | |15 | | | |качалочные на |прим | |40 |600 | |750мл | | | | | |Колба мірна на|шт |2 |20 |40 | |500 мл. | | | | | |Усього: | | | |640 |.

Амортизаційні відрахування на скляну посуд становлять 192 000 рублей.

Розрахунок витрат за електроенергію представлено таблиці 20:

Розрахунок витрат за електроенергію таблиця 20 |Найменування| | | | |обору-довани|М, кВт |Т, год |Витрата електроенергії, | |я | | |кВт год | |Насос-компре|2,5 |7200 |18 000 | |сварок | | | | |Фільтр |1,6 |7200 |11 520 | |відведених | | | | |газів | | | | |Хромато-масс|1,6 |40 |64 | |-спектрометр| | | | |LKB-2091 | | | | |Усього: | | |29 530 |.

Зэ=0,8 195 29 530=4606680 рублей.

На період проведення додаткових робіт необхідно, орієнтовно, 500л води, видатки воду становитимуть 2080 рублей.

Амортизаційні відрахування обладнання для додаткових робіт представлені у таблиці 21:

Розрахунок амортизаційних відрахувань. таблиця 21 |Наименова-ни| | | | | |е |Ф, т.руб. |На, % |Т, міс. |А, т.руб. | |устаткування| | | | | |Фільтр |200 |10 |10 |16,67 | |відведених | | | | | |газів | | | | | |Насос |1500 |10 |10 |125 | |компресор | | | | | |Хромато-масс| | | | | |-спектрометр|1 200 000 |10 |0,007 |70 | |LKB-2091 | | | | | |Ферментацион|2000 |10 |10 |166,67 | |ный ангар | | | | | |Усього: | | | |378,34 |.

Кошторис витрат за проведення додаткових работ.

11.Выводы і предложения.

1.Предложена модифікована середовище Ван-Итерсона що дозволяє селективно відбирати целлюлолитические гриби, резистентні до ПАУ.

2.Выделены і охарактеризовані п’ять штамів ПАУ-резистентных микромицетов, ефективно руйнують забруднені ПАУ лигноцеллюлозные отходы.

3.Исследован процес мікробної деструкції 16-ти компонентної суміші ПАУ. Показано, що гриби Phanerohaete chrysosporium і Trichoderma lignorum ефективно руйнують її компоненты.

4.Исследован процес фотолитической деструкції 16-ти компонентної суміші ПАУ. Показана ефективність використання СФвипромінювання до предобработки ПАУ-содержащих субстратов.

5.Обнаружено явище перерозподілу речовини між компонентами суміші ПАУ. Показано, що цей процес протікає як при мікробної, і при фотолитической деструкції суміші. Запропоновано можливий механізм реакції, що призводить до нагромадженню в суміші багатоядерних ПАУ.

12.Список використаної литературы.

1.Decolourisaiation of an artificial textile effluent by Phanerochaete chrisosporium /Kirby Niamh, Mc Mullan Geoffrey, Marohant Roger// Biotechnol. Lett. -1995.-17, № 7. — c.761−764. — Англ.

2.Вредные речовини у промисловості, Т.1, 2, 3. / Під ред. Лазарєва Н.В. -М: Хімія, 1976, 1977.

3.Деградация природних полімерів мицелиальными грибамипродуцентами біологічно активних речовин./ В. Г. Бабицкая, В. В. Щерба. // Прикл. Біохімія і мікробіологія. -1991. -27, № 5. — с.687−694.

4.Микробиология, тому 64, № 2, 1995, с.197−200, Л. А. Головльова, З. И. Финкельштеин, Б. П. Баскунов.

5.Monitoring the biological treatment of antracenecontaminated soil in a rotating — drum bioreactor /Banerjee D.K., Fedorak P.M., Hashuimoto A.K., Pickard M.A. //Аррl. Microbiol. And Biotechnol. — 1995. — 43, — с.521−528. — Англ.

6.Naphthalene biosorption in soil /water system of low or hihg sorptive ceparty / Whitman B.E., Mihelcic J.K., Lucking D.R.// Appl. Microbiol. and Biotechnol. -1995. — 43, № 3. — с.539−544. — Англ.

7.Degradation of polycyclic aromatic hyidrocarbons by pyre strains and by defined strain associations: Inhibition phenomena and cometabolism / Bouchez M.T., Vandecastcele J.M., Blanchet D.S. // Appl. Microbiol. and Biotechnol. — 1995. — 43, № 4. — с.156−164. — Англ.

8.Verbesserte Nahrstoffgemische fur die Bioremediation verschmutzter Boden und Gewasser / Holtwiesche Bettina, Weiss Albrichet. — 1992.

9.Phitochemically enhanced microbiol degradation of enviromental pollutants / Matsumura Fumio, Katayama Arata; The Rogents of the University of Califonia. -1991.

10.Isolation and characterization of PAH — degrading soil bacteria. Abstr. Keystone Symp. Environ. Biotechnol., Lark Tahol, Calif March 16- 22, 1995 / Loyd — Jones Gareth, Hunter David W // J.Cell. Biochem. — 1995. — Suppl. 21a. — с.49. — Англ.

11.Metabolism of benz[а]antracene by the filamentous fungus Canninghamella elegans / Cerninglia Care E., Gibson David. T., Dodage Robert H. // Appl. and Environ. Microbiol. — 1994. — 60, № 11. — с.3931 — 3938. — Англ.

12.Sequence and expression of the tol DIH genes involved in the last three steps of toluene degradation by Pseudomonas putida F1 / Lau Peter C.K., Bergeron Helene, Lable Diane, Wang Ying, Broussea Roland, Gibson David T // Gene. — 1994. — 146, № 1. — с.7−13. — Англ.

13.Сarbon source-dependet ihibition of xyl operan expression of the Pseudomonas putida TOL plasmid/ Holtel Andreas Marques Silvia, Mohler Isabel, Jakubzik Ute // J. Bacteriol. — 1994. — 176, № 6. — с.1773- 17 776. — Англ.

14The oxidation of pyrene and benzo[а]purene by nonbasidiomycete soil fungi/ Launen Loren, Pinto Linda, Wiebe Christine, Moore Margo // Can. J. Microbiol. -1995.-41, № 6 — с.477−448. Англ.

15.Древесина (хімія, ультраструктура, реакції): Пер. з анг. / Д. Фенгел, Р. Вегенер; Предисл. А. А. Леоновича // Під. ред. д-ра. техн. наук, проф. А. А. Леоновича — М.: пром-сть, 1988. — 512 с.

16.Роговин З. А. Хімія целюлози.- М.: Хімія, 1972. 519 с.

17.Тарчевский І.А., Марченко Г. Н. Біосинтез і структура целюлози.- М.: Наука, 1985. 279 с.

18.Эриньш В. П. Будова й поліпшуючи властивості деревини як лигнокомпонентной целюлозної системи// Хімія деревини.- 1977. №.- З. 8−25.

19.Preston R.D. Cellulose-microbril-orienting mechanisms in plant cells walls//Planta.-1988.-V.174, № 1.-P. 67−74.

20.Билай Т. І. Біотехнологічні основи трансформації целюлози в белково-ферментные препарати// Біохімія тварин і людини: Респ. Мевжвед. рб. наукової праці/ АН УРСР.- Київ, 1988. Вип. 12.;

З. 42−54.

21.Mullings R. Measurement of sacharification by cellulases//Enzyme and Microb. Technol.-1985.-V.7, № 12.-P. 586.

22.Schurz J. Cellulose solutions of the networt type: characterization and properties// Cell. Chem. and Tecnol.-1977. V.11, P.3−28.

23.Эриньш П. П. Будова й властивості деревини як лигнокомпонентной полімерної системи// Хімія древесины.-1977.-N1.-С. 8−25.

24.Огарков У. І., Кисельов Про. М., Биков У. А. Біотехнологічні напрямку використання рослинного сировини// Біотехнологія.- 1985.-№З.- З. 1−15.

25. Sricscen M., Larsson P. S. and Miksche G. E. Gaschromatographische Analuse von Ligninoxydationsprodukten. VIII. Zur Struktur des Lignins der Fichte// Acta Chem. Scand.-V.27, P. 903−914.

26.Yang H. H., Effland M. J., Kirk T. K. Factors influencing fundal degradation of lignin in a representative lignocellulosic thermomechanical pulp// Biotechnol. Bioeng.- 1980.-V.22, № 1. P. 65−77.

27.Khan A. W., Guiliano З., Ascher M. Comparative degradation of cellulose and sugar formation by three new isolated mesophilic aerobes// Biotechnol. Lett.-1983.-V.5, № 6.-P. 395−399.

28. Israelidies З. J., Grant G. A., Han Y. W. Sugar level, fermentability and acceptability of straw treated with differnt acisd// Appl. Environ. Microbiol.-1978.-V.36, № 1.-P. 43−46.

29. Агабекян Э. Л. Вплив дисперсности соломи на целлюлолитическую активність гриба Asp. terreus 17 p // Микробиол. пром. — 1982. № 3. З. 10−11.

30. Градова М. Б., Касим-заде І. Еге., Винаров А. Ю. Порівняльна оцінка ефективності способів биоконверсии гребенів винограду// Біотехнологія.- 1991. № 1. З. 85−88.

31. Structural properties of cellulose and cellulase reaction mechanism/ P. S. B. Lee, I. H. Kim, D. D. Ryn, H. Taguchi// Biotechnol. Bioeng.-1983.-V.25, № 1.-P. 33−51.

32. Вплив механохимической обробки соломи на якість одержуваних кормових гранул/ Ю. Ю. Каткевич, А. Соммер, З. Чернякова та інших. // Хімія деревини.- 1990. № 5. С.72−78.

33.Механизмы реакції в органічної хімії. Пер. з анг. / П.Сайкс. // Під ред. д-ра хім. наук В. Ф. Травеня — М.:Химия, 1991. — с.448.

34.Микология. Э. Мюллер, В. Лефлер: Пер. с ньому. — М.: Світ, 1995.

35.Determination of accesibity of lignocellulosic substrates to enzymatic degradation by microscopy / Srebotnik Enald, Messner Kurt // EUREM 88: Proc. 9 th Eur. Congr Electron Microsc., York, 4−9 Sept., 1988. Vol. 3. — Bristol; Philadelphia, 1988. — с.107- 110. — Анг. 36. Anaerobic oxidarion of toluene (analogues) to benzoate (analogues) by whole celles and by cell extracts of a denitrifying Thanera sp. / Biegert Thomas, Fachs Georg // Arch. Microbiol. — 1995 — 163, № 6. — с.407−417. — Анг. 37. Плазмиды біодеградації нафталіну в ризосферных бактерії роду Pseudomonas / В. В. Кочетков, В. В. Балашина, Е. А. Мордухова // Мікробіологія тому 66, № 2 1997 стр.211−216, березеньапрель.

38.Wite-rot fungus may degrade aromatic pollutants // Bioprocess. Technol. — 1990. — 12, — с.2−3. -Англ.

39.Aromatic compounds as model substances for enviromental pollutions. Energetic and kinetic calorimetric investigation of mineralization by microorganisms: [Рар.] IUPAC Conf. Chem.Thermodin., Clermont — Frrant, 17−22 Jully, 1994 //Pure and Appl. Chem. — 1995. -67, — с.947−954. — Англ.

40.Бороним А. М., Цой Т. В. Организация і регуляція експресії. Генетика. Т.4. — «Наука», 1989. — с.581−594.

41. Методи селекції продуцентів антибіотиків і ферментів/ Р. А. Жукова, А. Д. Коммунарская, М. И. Прошина та інших. — Л.: Медицина 1978. 160 с.

42.Выделение з природних біоценозів мікроорганізмів целлюлозодеструкторов, резистентних до биоцидным речовин / Козлов Г. В., Марьяновская Ю. В., Калей Я. А., Соколов В. М., Гарабаджиу А. В. // Тез. докл. Научн.-техн. конф-ции. СПбГТИ (ТУ) їм. М.М.СычеваСПб.:Изд.СПбГТИ (ТУ), 1997, с. 126.

43.Борисов Л. Б., Козьмин-Соколов Б.М., Фрейдлін І.С./ Керівництво до лабораторним занять із медичної мікробіології, вірусології і имунологии: Учеб. Посібник. — М.: Медицина, 1993. — 240 з.: ил.

44.Выделение і характеристика мікроорганізмівдеструкторів полициклических ароматичних вуглеводнів / Пунтус І.Ф., Филонов А.Є., Кошелева І.А., Гаязов Р. Р., Карпов А. В., Боронин А. М. // Мкробиология Т.66, № 2, 1997 с.269−272.

45.Funginal oxidotion makes large waste molecules manageable// Bioprocess. Technol.- 1991.-13, № 4.-p. 7.

46.Деструкцiя моно-I полiциклiчних ароматичних вуглеводнiв культурами Pseudomonas fluorescens 1-D биовар II і Bacillus subtilis 2-D/ Думаньська Т.У.// Мiкробiол. Ж.-1995.-57, № 1.-с.95−101.

47.Rontani J.F., Rambeioarisoa E., Jinsti J. Favourable interaction bettween photooxidation and bacterial degradation of antrhacene in sea Water. Chemosphere, 1985, 14, № 11−12, р.1909;1912.

48.Грин М., Стаут У., Тейлор Д. Біологія: В3-х т. Т.1.: Пер. з анг./ Під. ред. Р.Сопера.- М.: Світ, 1993. 368 з., ил.

49.Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in biomass emission by liguid chromatography with fluorescence and chemiluminescensendetection / Gachanjana Anthony N., Worsfold Paul J. // Anal. Proc.- 1992.-29.-p.63−65.

50.ГОСТ 12.0.003−74 Система стандартів безпеки праці. Небезпечні й шкідливі виробничі чинники. Классификация.

51.Справочник хіміка. Основні властивості неорганічних і органічних сполук. -Л, Льон. птд. ДХІ, 1963. Т.2, з. 1168.

52.Пожаровзрывобезопасность речовин і матеріалів і кошти їх гасіння: справ. вид. в 2-х томах. /Під ред. О. Н. Баратова, А. Я. Корольченко. -М: Хімія, 1990;496 с.

53.Беспамятнов Г. П., Кротов Ю. О. Гранично допустимі концентрації хімічних речовин, у навколишньому середовищі. Справочник.-Л.: Хімія, 1985. 528 с.

54.НПБ-ОБ-95. Визначення категорій приміщень та будинків по взрывопожарной та пожежною опасности.

55.Правила устрою електроустановок. -М: Энергоатомиздат, 1985 — 640 с.

56.ГОСТ 12.1.005−88 ССБТ. Загальні санітарно-гігієнічні вимоги до повітрю робочої зоны.

57.ГОСТ 12.4.021−75 ССБТ. Системи вентиляційні. Загальні требования.

58.СНиП II-4−79 Природний і штучне висвітлення. Норми проектування. -М: Стройиздат, 1980.

59.ГОСТ 12.1.008−76 ССБТ. Біологічна безпеку. Загальні вимоги безопасности.

60.Сборник загальних правив і інструкцій технічно безпеки під час роботи у хімічній лабораторії і майстерні. -Л: вид. ЛТИ їм. Лєнсовєта, 1989.

Показати весь текст

Заповнити форму поточною роботою