Секвенування (Генна інженерія)

ОГЛАВЛЕНИЕ Введение …3 1. Визначення нуклеотидної послідовності модифікованим методом Максама і Гілберта …4 2. Секвенування ДНК методом полимеразного копіювання (метод Сэнгера) …8 3. Филогенетический аналіз геномів вірусів …15 4. Комп’ютерний аналіз генетичних текстів …18 Укладання …22 Список літератури …23.

Розробка методів клонування та засобами визначення послідовності підстав (секвенування) нуклеїнових кислот започаткувала нового етапу розвитку молекулярної біології. Знання первинної структури ділянок геному, виконують певні функції, дозволило ефективно застосувати їхнього дослідження цілий арсенал методів генної інженерії. Ці методи (спрямований мутагенез, рекомбінація in vitro та інших.) дозволяють модифікувати ділянки нуклеотидних послідовностей і досліджувати їх функції на молекулярному рівні. З їхньою допомогою комбінуються ділянки генетичного матеріалу і створюють геноми з новими функциями.

Секвенування нуклеїнових кислот нині стало рутинною методом молекулярної біології. Безсумнівно, у майбутньому з’явиться ще досконаліші автоматичні секвенатори, що сприятиме різкого збільшення кількості розшифрованих последовательностей.

Завдяки знання генетичного коду з’явилася можливість визначати ділянки нуклеотидних послідовностей, які кодують потенційні білки. Цей джерело і сьогодні дає основну інформацію про функціональному будову нуклеотидної последовательности.

1. ВИЗНАЧЕННЯ НУКЛЕОТИДНОЇ ПОСЛІДОВНОСТІ МОДИФІКОВАНИМ МЕТОДОМ.

МАКСАМА І ГИЛБЕРТА.

Швидкий прогрес, що простежувався останніми роками у різноманітних галузях молекулярної біології, багато чому обумовлений появою ефективного методу визначення первинної структури ДНК. Цей метод, запропонований в 1977 р. Максамом і Гилбертом, грунтується на селективною хімічної модифікації різних типів гетероциклических підстав у складі ДНК з наступним розщепленням межнуклеотидных зв’язків в модифікованих ланках. Реакції селективною модифікації в кожному типу гетероциклических підстав проводяться в такий спосіб, щоб у кожній молекулі ДНК загалом модифицировалось лише одна ланка такого типу. Оскільки всі ланки такого типу у складі молекули еквівалентні і реагують з модифицирующим агентом з швидкостями, то сумі кожне ланка цього виявиться частково модифікованим. Подальша обробка ДНК вторинним аміном чи лугом призводить до отщеплению модифікованих гетероциклических підстав від ланцюга ДНК й розрив полинуклеотидной ланцюзі у місцях відщіплення гетероциклов (рис. 1).

Модифікації піддають ДНК, 32Р-меченные по 5 «-концевому нуклеотидному ланці. Радіоактивна мітка вводиться фосфорилированием з допомогою [pic]-32РАТР і Т4-полинуклеотидкиназы. Отже, внаслідок хімічної деградації виходить набір фрагментів ДНК різної довжини. Довжини цих фрагментів відповідають становищу мономерных ланок того типу, який піддавався модифікації. Кінцева радіоактивна мітка служить точкою відліку щодо довжини продуктів хімічної деградації ДНК (рис. 2).

Набір отриманих фрагментів фракционируется электрофорезом в ПААГ, що дозволяє розділяти олиго (поли) нуклеотиди, відмінні за довжиною всього одне мономерное ланка. Послідовність нуклеотидів в ДНК читається безпосередньо з радиоавтографа геля.

Метод Максама і Гілберта, розроблений для аналізу первинної структури досить довгих ДНК, прийнятний і для коротких (8 — 16 звенных) оли-годезоксирибонуклеотидов. Але цього разі реакції хімічної модифікації проводять у жорсткіших умовах (збільшуючи час і температуру реакції) з метою підвищення ступеня модификации.

[pic].

Малюнок 1.1 Відщеплення модифікованих ланок від ланцюга ДНК після обробки вторинним аміном чи щелочью.

[pic].

Малюнок 2 Хімічна деградація ДНК.

Набір реакцій, що застосовуються розщеплення ДНК по мономерным ланкам певного типу досить великий і постійно поповнюється: залишками гуанина — обробка диметилсульфатом (рис. 3); залишками аденіну і гуанина — апуринизация 50%-ной мурашиною кислотою (по Бартону); по залишкам аденіну і цитозина — розщеплення гетероциклических підстав під дією 1,2 зв. гидроксида натрію і з залишкам тимидина і цитозина — обробка гидразином (рис. 4).

Нині широко використовуються дві основні варіанта секвенування по Максаму — Гілберту. У першому їх реакції хімічної модифікації ДНК проводять у розчині, тоді як у другому ДНК попередньо иммобилизуют на твердої фазі (наприклад, ДЭАЭ-целлюлозе). Перший метод більш традиційний, численні модифікації успішно використовувалися для секвенування фрагментів ДНК різних розмірів, зокрема олігонуклеотидів. У той самий час другий метод має низку переваг. Він менш трудомісткий і менше, простіше лідера в освоєнні, дозволяє обмежитися мінімальною набором устаткування. У цілому нині обидва методу забезпечують отримання цілком прийнятні результатів, а вибір однієї з них визначається конкретними умовами лаборатории.

[pic] [pic].

Малюнок 3 Реакція селективного розщеплення залишками гуанина.

[pic].

Малюнок 4 Реакція селективного розщеплення залишками тимидина і цитозина.

2. СЕКВЕНУВАННЯ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОГО КОПИРОВАНИЯ.

(МЕТОД СЭНГЕРА).

Ферментативний синтез олиго (поли)дезоксирибонуклеотидов з допомогою ДНКполимераз, що полягає в копіюванні матричного полинуклеотида знайшов блискуче використання у ролі однієї з цих двох найефективніших методів встановлення первинної структури ДНК. Метод полягає у отриманні блоківкопій полидезоксирибонуклеотида, структура якого вивчається. У цьому обов’язковим є виконання дві умови. По-перше, копіювання проводиться, починаючи з певного мономерного ланки. По-друге, синтез копій слід здійснювати в чотири рази, щоразу зупиняючи його по черзі на якомусь одному з чотирьох мономёрных ланок (A, G, З чи Т), інакше кажучи, прагнуть здобути цілковитий набір «комплементационно що проглядали «копій досліджуваного полинуклеотида, освіту яких припинилося у кожному з місць розташування однієї з чотирьох мономерных ланок нуклеїнової кислоти. Визначення довжини кожної копії дозволяє встановити становище даного мономерного ланки у ланцюги досліджуваного полинуклеотида. Довжина копії визначається фракционированием в полиакриламидном гелі. Цей метод, в такий спосіб, як і і метод, заснований на модифікації підстав дає змогу отримувати інформацію про становищі певного мономерного ланки у ланцюги полинуклеотида прямо після фракционирования.

Для отримання копії досліджуваного полинуклеотида у тому вибирають точку відліку, яка досягається введенням у систему ферментативного синтезу як нуклеозидного компонента олигонуклеотида-затравки. Такий олигонуклеотид переважають у всіх копіях, які виникають внаслідок добудовування його ферментативным шляхом, постійний 5 «-концевым фрагментом, т. е. є точкою відліку. Копіювання з допомогою ДНК-полимеразы у присутності всіх чотирьох дезоксирибонуклеозид-5 «-пирофосфатов (них береться [pic]32Р-меченным) проводять у протягом обмеженого часу. Мета цього етапу — проведення статистично обмеженого синтезу щоб одержати всіх можливих копій, починаючи з початку, добудованій одне, дві, і т. буд. ланок, і включаючи повну копію досліджуваного полинуклеотида. У ідеалі суміш повинна мати всіх можливих полинуклеотиды (рис. 5), синтез яких статистично припиняється десь посередині матричного полинуклеотида в районі ATGCTG матричної послідовності. Насправді різні компоненти суміші є у різних кількостях. Якщо таку суміш далі піддати электрофорезу в полиакриламидном гелі за певних умов, коли швидкість руху пропорційна довжині ланцюга, на электрофореграмме можна знайти серія смуг, які представляють різні олігонуклеотиди. Таке фракціонування звичайно проводять, хоча вона можна використовувати контролю на.

[pic].

Малюнок 5 Використання ферментативного синтезу олиго (поли)дезоксирибонуклеотидов визначення первинної структури ДНК.

завершающем етапі аналізу. Инкубационную суміш 32Р-меченных олігонуклеотидів різної довжини як комплексів з матричним полинуклеотидом піддають гель-фильтрации видалення дезоксирибонуклеозид-5 «-трифосфатов і аликвоты реакційної суміші реинкубируют з ДНК-полимеразой у різних умовах. Що стосується «мінуссистеми «реинкубацию проводять у присутності лише трьох дезоксирибонуклеозид-5 «-три-фосфатов. Наприклад, в «- А-системе» відсутня dATP й кожна копія в суміші добудовується з допомогою ДНК-полимеразы до місця, у якому наступним мономерным ланкою може бути залишок pdA (тобто. Т в матричному полинуклеотиде). Образующуюся суміш фракционируют з допомогою електрофорезу і виявляють (ауторадиографически) обмежене число смуг (їх кількість дорівнювала кількості Т в матричному полинуклеотиде). Аналогічно проводять копіювання за відсутності інших субстратів: — dGTP, — dCTP чи — dTTP (- G-, — Зі - Т-системы відповідно). Усі чотири ионофореза проводять у полиакриламидном гелі паралельно. Отримані ауторадиограммы дозволяють відразу написати нуклеотидну послідовність, причому читання ланцюга знизу вгору відповідає 5 «[pic]3 «-полярності ланцюга копії. Наприклад, становище найкоротшого олигонуклеотида (в «- Тсистемі «) зазначає, наступний його за довжиною олигонуклеотид закінчується на Т, т. е. що проти смуги, розташованої вище (це смуга в — А-системе), слід записати букву Т. Так само записують далі в послідовності букву, А (виходячи з становища наступного по довжині олигонуклеотида, який був у «- А-системе ») тощо. буд. Відповідний ділянку ланцюзі у матриці читається з урахуванням принципу комплементарності і антипараллельности ланцюгів комплексно матриця — запал. Для перевірки цих даних використовують результати аналізу з допомогою «плюс-системы ». І тут додаткове копіювання (після першого етапу) проводять у присутності ДНК-полимеразы, виділеної з бактериофага Т4, що у відсутність субстратів (нуклеозид-5 «-трифосфатов) виявляє 3 «-экзонуклеазную активність (аналогічну дії ФДЭ зміїного отрути), т. е. отщепляет мононуклеотиды одна одною з 3 «-кінця. У той самий час у присутності субстратів її полімеразна активність в багато разів перевершує экзонуклеазную. Тож якщо в реакційної суміші присутній хоча б тільки дезоксирибонуклеозид-5 «-трифосфат (dATP в «+А-системе »), деградація кожної копії, що виникла на першої стадії аналізу, проходитиме до місця становища, А (Т в матриці). І тут pdA включається багато швидше, ніж видаляється, отже, накопичуються фрагменти, містять на 3 «-кінці ланцюга А. Аналогічно проводять копіювання в присутності лише dGTP, dCTP чи dTTP. Суміші паралельно піддають электрофорезу, як і попереднього разі, й отримують ауторадиограммы, з яких відразу зчитується послідовність 5 «[pic]3 «-напрям, зчитується також знизу вгору). З порівняння фореграмм «плюс- «і «мінуссистем «робиться однозначний висновок про нуклеотидної послідовності в копіях і, отже, в матричному полинуклеотиде.

Нині виділення фрагментів ДНК, створення рекомбінантних генів, а як і пряме секвенування ДНК і кДНК стають загальнодоступними методами завдяки широке впровадження ПЛР (полімеразної ланцюгової реакции).Сущность ПЛР залежить від використанні двох олігонуклеотидівпраймеров, здатних специфічно гибридизоваться з послідовностями нуклеотидів на протилежних кінцях двох ланцюгів ділянки ДНК, як початку для одночасного синтезу комплементарных ланцюгів з протилежних кінців матриці з допомогою термостабильной ДНК-полимеразы. У результаті повторюваних циклів (температурної денатурації ДНК, отжига і энзиматической добудови праймеров) експоненціально збільшується кількість дискретного фрагмента, фланкированного послідовностями нуклеотидів, соответсвующих первинної структурі праймеров.

Придатність методу Сэнгера залежить від можливості отримання одноцепочечных копій клонованих ДНК. З цією метою можна використовувати вектори з урахуванням бактериофага М13. Двухцепочечную чужорідну ДНК можна клонувати в двухцепочечной репликативной формі (РФ) фаговой ДНК, у своїй після трансформації в білкову оболонку буде упаковуватися одна з ланцюгів ДНК. В усіх життєвих вектори типу М13тр використовуються подібні полилинкерные послідовності, для ініціації полимеразных реакцій придатний і той ж універсальний праймер. При амплификации суміші генів (наприклад, сімейства генів) необхідно провести клонування ПЦР-продуктов в вектори типу М13, внаслідок кожен фаг міститиме тільки один вставку. При прямому секвенировании суміші генів спостерігається кілька однаково розташованих смуг у різних доріжках гелю. При амплификации ж одного гена робити пряме секвенування, не вдаючись до проміжного субклонированию.

Вибір оптимального праймера для ПЛР залежить від 5 «- і трьох «-кінцевих послідовностей амплифицируемого фрагмента ДНК. З іншого боку, для вбудовування ПЦР-продукта в полилинкерный сайт вектора М13 в розмірі 5 «-кінець праймеров мають стояти підходящі рестрикционные сайти. У цьому вся разі ПЦР-амплификация із наступною рестрикцией продукту дозволить провести його убудовування в ДНК М13, рестрицированную тим самим ферментом. У різні кінці амплифицируемого фрагмента краще включати сайти до різних рестриктаз, оскільки це дасть можливість уникнути отжига векторної ДНК самої на себе і забезпечить становище клонованої вставки у певному орієнтації (зване спрямоване клонування). При доборі праймеров необхідно враховувати такі чинники. а. Слід переконатися, що амплифицируемое сімейство генів не містить консервативного внутрішнього рестрикционного сайту, ідентичної сайту, включеному в праймер. б. Після включення рестрикционного сайту 5 «- кінець праймера потрібно подовжити, інакше рестриктаза нічого очікувати розщеплювати праймер. Необхідна кожному за ферменту довжина виступає дільниці і час рестрикції зазначені у каталозі фірми New England BioLabs.

Перед секвенированием двухцепочечную рекомбинантную ДНК М13 необхідно перекласти на одноцепочечную форму. І тому її вводять шляхом трансформації в компетентні клітини E. сoli. Бляшки, містять одноцепочечные рекомбинантные фаги, необхідно виколоти, наростити в бактеріальної культури і депротеинизировать.

Потім переносять культуру в микроцентрифужную пробірку на 1,5 мл і центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g протягом п’яти хвилин. Переносять 1 мл супернатанта (що містить чистий фаг) на другу пробірку на 1,5 мл, додають 200 мкл полиэтиленгликоля і инкубируют при кімнатної температурі принаймні 15 хвилин. Збирають фаг центрифугированием протягом 5 хвилин при 12 000 g і відбирають супернатант. Швидко повторюють центрифугування і повністю видаляють все сліди супернатанта. Потім в облогу беруть ДНК ацетатом натрію, промивають її 70%-ным етанолом і висушують під вакуумом. Розчиняють ДНК за 30 я мкл води. Отримана ДНК є одноцепочечную матрицю для секвенирования.

Нижче приведено конкретна методика секвенирования:

Материалы.

• 5 x реакційний буфер: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl.

• Буфер для розведення ферменту: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ДТТ, 0,5 мг/мл БСА.

• 5 x суміш для мечения: по 7,5 мкМ dGTP, dCTP, dTTP.

• Суміш для ddG-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddGTP, 50 мМ NaCl.

• Суміш для ddA-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddATP, 50 мМ NaCl.

• Суміш для ddC-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddCTP, 50 мМ NaCl.

• Суміш для ddT-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ ddTTP, 50 мМ NaCl.

• Стоп-раствор: 90% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синій, 0,05% ксилолцианол.

• Універсальний праймер для секвенування — 40 (0,5 пмоль/ мкл).

• [35S]dATP[pic]S (1 мКи/37 МБк в 100 мкл) (Amersham, UK; у складі набору не входит).

• 0,1 М ДТТ.

Методика.

Усі реактиви додають з допомогою диспенсера на 2 мкл Hamilton (PB600), з'єднаний з адаптером і шприцом 1710 з газовим затвором. Суміш для мечения попередньо розбавляють до п’яти раз.

1. Для кожної секвенируемой матриці змішують в микроцен-трифужной пробірці на 1,5 мл щоб одержати праймерной суміші 6 мкл води, 1 мкл універсального праймера і 2 мкл реакційного буфера.

2. Розмічають микроплашку Falcon 3911. У верхньої її частки завдають номери клонів, а зліва, згори донизу, — літери TCGA.

3. На дно кожної осередки завдають 2 мкл праймерной суміші, на бічні стінки — по 2 мкл розчину секвенируемой матриці і центрифугируют плашку. Накривають її плівкою Saran® і кришкою і вміщують у водяну лазню з температурою 70 °C п’ять хв. Охолоджують плашку на столі (цей час відбувається відпал праймера і ДНК М13).

4. Поки плашка охолоджується, готують суміш для мечения. І тому в микроцентрифужную пробірку на 1,5 мл вносять 0,5 мкл 35S-dATP, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 2 мкл розлученою суміші для мечения і 3,5 мкл воды.

5. Розмічають поликарбонатную микроплашку Techne 96® як і, як першу плашку, й у осередки у низці «Т «вносять по 2 мкл суміші для ddTтерминации. Так вносять суміш для терминации в осередки інших лав і поміщають плашку в термостат для микроплашек з температурою 42 °C.

6. Після охолодження плашки (п. 3) за тридцяти хв додають до суміші для мечения (кожної матриці) послідовно 1,77 мкл буфера для розведення ферменту і 0,22 мкл ферменту Sequenase® II. (Це дозволяє утримувати фермент Sequenase® II поза холодильника мінімальне время.).

7. По 2 мкл цю суміш завдають відпочивати стінку осередків, містять праймерную суміш, і центрифугируют плашку для перемішування компонентів. Включають секундомер.

8. Через 2 хв починають переносити розчин з осередків першої плашки на відповідні осередки попередньо нагрітої і вміщеній в термостат поликарбонатной плашки. І тому використовують звичайну микропипетку, швидко змінюючи наконечники після кожної осередки (пам'ятаєте, що використані наконечники радиоактивны).

9. Коли перенесений розчин з останнього осередки, включають секундомір й у наконечник на шприці Hamilton набирають стоп-раствор.

10. Через 5 хв завдають по 5 мкл стоп-раствора відпочивати стінку кожної чарунки й центрифугируют плашку. Після центрифугування плашку, закриту кришкою, можна зберігати в морозильнику і до застосування (при — 20° С 35S-продукты можна зберігати протягом недели).

Амплифицированные послідовності нуклеотидів можна побачити у СФсвітлі після фракционирования продуктів ПЛР з допомогою гель-электрофореза вприсутствии бромистого этидия. Найчастіше після ПЛР за наявності 1 — 10 нг ДНК-матрицы виявляється лише одне смуга ДНК очікуваної электрофоретической рухливості. Чутливість і специфічність детекции продуктів амплификации значної збільшуються під час використання різних варіантів ДНК—ДНК-гибридизации з олигонуклеотидами-зондами, мають радіоактивну биотиновую, флюоресцентную чи хемолюминесцентную мітку. Це прискорило проведення цих робіт з мінімально можливим кількістю матеріалу, (наприклад, з одного клітиною, однієї копією гена) без попередньої його очистки.

Як вихідної матриці для ПЛР можна використовувати ДНК (чи кДНК, отримана з допомогою попередньої зворотної транскрипції РНК), виділена що з свежеполученных клітин та тканин, що з заморожених, висушених чи фіксованих препаратів, мають частково деградовані нуклеїнові кислоти, т. е. об'єкти, раніше недоступні для аналізу. Тож з допомогою методів ПЛР була амплифицирована, клонирована і секвенирована ДНК єгипетську мумію, продемонстровано можливість аналізу специфічних ділянок ДНК за наявності одного волосу, клітини, сперматозоїда з метою ідентифікації особи і статі хозяина.

Серповидно-клеточная анемія, [pic]-талассемия, діабет, ревматоїдний артрит, м’язова дистрофія, фенілкетонурія, гемофілія, дефіцит [pic]- антитрипсина — ось далебі неповний список генетичних захворювань, які можна виявлено на ранніх стадіях розвитку ембріона з допомогою ПЛР Розроблено також підходи до раннього виявлення і прогнозу онкологічних заболеваний.

3. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛІЗУ ГЕНОМІВ ВИРУСОВ.

Филогенетический аналіз молекулярних даних одна із підходів до теоретичного вивченню структури та функції генетичних макромолекул (РНК, ДНК, білків) та його еволюційного перетворення. Основна мета філогенетичного аналізу — вивчення еволюційного порядку дивергенції послідовностей генів і білків чи його частин, і навіть відновлення списків еволюційних подій (замін нуклеотидів, делеций і вставок) в предковых лініях цих макромолекул.

Основним інструментом філогенетичного аналізу є порівняння близьких структурою чи з функції генів чи білків, і, порівняння їх первинних последовательностей.

Найважливішим властивістю функціонально значимих структур макромолекул був частиною їхнього еволюційний консерватизм. Чим менший функціональна важливість окремих ділянок генів, то більше вписувалося вони теж мають тенденцію до еволюційної мінливості. Приміром, псевдогены очевидно повністю втратили функціональну активність. Їх характерний швидкий накопичення під час еволюції різних замін, делеций і вставок, що руйнують вихідну структуру гена. З іншого боку, гистоны Н4, які відіграють значної ролі в упаковці хроматина, майже змінювалися протягом усього еволюції животных.

Консервативність генів дає змоги виявити віддалене кревність поміж їхніми представниками, давно разошедшимися під час еволюції і які виконують іноді різні функції. Проте задля філогенетичного аналізу необхідне й наявність певного рівня мінливості генів. Мутації, делеции і вставки є свого роду знаками, внаслідок чого вдається відновити шляху еволюції сучасних форм макромолекул. Гени з різною величиною консервативності придатні з вивчення різних еволюційних рівнів. Дуже консервативні гени та його продукти (гистоны, тРНК) не можна, наприклад, використовуватиме дослідження еволюції загонів, а також дрібніших таксонов, але успішно можна застосовувати щодо вивчення еволюції більших таксонов. Дуже вариабельные гени, навпаки, дають хороше дозвіл тільки пізніх еволюційних этапах.

Останнім часом метод полімеразної ланцюгову реакцію (ПЛР) з наступним аналізом нуклеотидної послідовності широко використовується для точної ідентифікації вірусів й універсального визначення їх кревності щодо інших штамів. Для порівняльної характеристики геномів різних штамів вірусів також проводять рестрикционный аналіз ПЦР-продуктов. Зазвичай для побудови філогенетичного дерева використовуються дані послідовностей нуклеїнових кислот. Філіпченкове дерево дуже чітко показує кревність між вірусами, якщо аналізується дуже багато изолятов. Для цих цілей є багато комп’ютерних програм. Найпопулярніші пакети програмPHYLIP (PHYLogeny Inference Package), PAUP (Phylogentic Analysis Using Parsimong), CLUSTAL і MEGA.

Для філогенетичного аналізу особливо цікаві РНК-содержащие віруси, що є як гетерогенні популяції. Їх геном більш генетично пластичний, ніж геном ДНК-содержащих вирусов.

Так, геном вірусу сказу, яка ставиться до роду Lyssavirus сімейства Rhabdoviridae, представлений одноцепочечной негативної РНК довжиною близько 12 000 пар підстав (п.о), яка кодує п’ять основних белков.

Бєлки поділяються втричі функціональні групи: оболонкові (G, M) нуклеокапсидный (N) і РНК-полимеразный комплекс, що з L і NS білків. Бєлки N, NS і L разом із вирионной РНК утворюють нуклеокапсид, який оточений мембраною, що містить трансмембранный гликопротеин G, відповідальний за антигенні властивості вірусу. Існування псевдогена (між G і L цистронами, є характерною рисою вірусу сказу від вірусу везикулярного стоматита.

N-ген лиссавирусов, як показало клонування і секвенування, є найбільш консервативним за своєю структурою із усіх генів вірусу бешенства.

Mannen K. et al, 1991 р. визначили велику залежність відмінностей у N-гене від географічної локалізації, ніж від хазяйської специфічності. У Онтаріо вірус сказу, який описаний як «Арктичний» тип, розділили чотирма основних типи. Ці типи филогенетически розгалужуються на дві основні галузі, одній із яких становить один тип, друга три основних типи, що проект відбиває історичне пересування вірусу у регіоні від середини до кінця 50-х рр. Епізоотія пересувалася на південь Онтаріо з півночі та Квебеку. Зміни у послідовності N-гена, певних для 4-х вірусних типів, можуть представляти генетичний маркер ще суттєвих змін у інших частинах вірусного генома.

Kissi et al представили перше порівняння між генотипами і молекулярними відмінностями N-гена всередині першого генотипу. Филогенетический аналіз гена нуклеопротеина 82-х лиссавирусов підтвердив існування шести генотипів лиссавирусов, і виділив ізоляти сказу першого генотипу в окремі генетичні лінії. Ізоляти з не меншою ніж 80% нуклеотидної і 92% амінокислотною гомологией ставляться до різним генотипам. Два коротких регіону з 400 нуклеотидів, які кодують аминоконец N-протеина, і 93 нуклеотида, які кодують N-NS-регион, можна використовувати визначення географічного розподілу основних вірусних ліній. Виявлено два регіону, мають найменший рівень гомології: ділянку довжиною 199 пар підстав (нуклеотиди від 1080-го до 1278-го) і більше протяжний фрагмент, розташований між 99-му і 405-м нуклеотидами. Філіпченкове дерево побудували, використовуючи пакет програм MEGA. З їхньою допомогою отримали дерево з гілками, делящимися на 6 кластерів, які відповідають шести генотипам. Порівняння изолятов показало, що у генетичному плані найближчими виявилися 4-й і 5-ї генотипи, які мають рівень відмінностей становив 79,8% (нуклеотидный рівень) і 93,3% (амінокислотний рівень) [Duvenhage virus (4) і EBL1(5)]. Усередині генотипу 1 найменше подібність серед изолятов з Азії та Латинської Америки — 83,3%; і найбільше подібність в изолятах з Африки та Латинській Америки — 92,2%.

Филогенетический аналіз изолятов 1-го генотипу вірусу бешенства.

Kissi et al. ідентифікували 11 филогенетических ліній, узятих відповідно до їх географічним походженням і виглядом хазяїна: Африка 1а, Африка 1 В, Африка 2, Африка 3, Азія, Арктика, Европа/Средний Схід, Латинська Америка 1 і 2 і ще дві групи вакцинних штамів. Філіпченкове дерево будувалося виходячи з порівняння фрагмента чи цілого N-гена.

Цей аналіз дозволив точніше визначити циркуляцію по зонам і можливість установити походження і розповсюдження сказу декому ліній, які, можливо, сталися незалежно у цьому континенті від різних попередників. Хоча циркуляція африканських вірусів 1а і 1 В більш відмінно від вірусів, поширених у Європі і Середньому Сході, проте нею виявлено генетична зв’язок з-поміж них, що свідчить про загальному предке.

З’ясовано, що накопичення більшості нейтральних мутацій в географічно розділених вірусних популяціях призвело до значним розходженням в нуклеотидної послідовності гена нуклеопротеина.

При дослідженні гена нуклеопротеина одинадцяти вірусів сказу японськими вченими виявили 9 окремих кластерів по гомології менш 90% регіону N-гена. Цим вони підтвердили дані філогенетичного аналізу, отримані Kissi et al.

Отже, варіанти вірусу сказу, згруповані в відповідність до їх географічним розподілом, можна використовувати на дослідження еволюційного розвитку вірусу бешенства.

Принципи й фізичні методи ОТ-ПЦР.

Обратно-транскриптазная ПЛР і двох этапов:

1- синтез комплементарної ДНК з допомогою ферменту оборотної транскриптази і затравки.

2- ампліфікація гена або його фрагментів з допомогою ферменту термостабильной ДНК-полимеразы і коротких олигонуклеотидных 20−30- членных запалів (праймеров), комплементарных 3 «- концевым послідовностям антипаралельных ланцюгів ДНК гена. повторюючи стадії денатурації, отжига праймеров і полімеризації (добудова праймеров).

30−35 разів на 2−3 години отримують мільйони копій специфічного ділянки геному вірусів і бактерий.

Аналіз ПЦР-продуктов.

Аликвоты ПЦР-продуктов розрізають відповідними ферментами і поділяють в 1%-м агарозном гелі. Облік результатів проводять за розміру ПЛРпродуктів із допомогою електрофорезу в агарозном гелі. З ж розмірів та відстаней пробігів маркерних ДНК обчислюють розміри досліджуваних фрагментів ДНК.

4. КОМП’ЮТЕРНИЙ АНАЛІЗ ГЕНЕТИЧНИХ ТЕКСТОВ.

Виявлення й аналіз закодованих в послідовностях функціональних сигналів вимагає застосування сучасних методів інформатики — якісних баз даних із сучасними засобами управління, новітніх методів розпізнавання образів, статистичних досліджень, застосування спеціальних алгоритмів задля подолання виникаючих обчислювальних трудностей.

Нині дослідження функціональних властивостей розшифрованих послідовностей нуклеїнових кислот — це нове розділ молекулярної біології, граничащий з інформатикою, з одного боку, та молекулярною біофізикою — з іншого. Можна упевнено сказати, що на даний час аналіз послідовності биополимера дозволяє витягти тільки дуже невелику частку закодованої у ній інформації. У кінцевому підсумку точне виявлення функціональних особливостей в послідовностях нуклеїнових кислот буде можна тільки після детального дослідження відповідних реакцій, здійснюваних нуклеиновобелковыми комплексами.

Для оперативної роботи з послідовностями створюються спеціальні банки даних. У банку в доступному для користувача вигляді зберігається кожна розшифрована послідовність і його паспорт, у якому зазначено різні відомості про неї. Це відомостей про організмі, з яких виділено послідовність, документ, де описана, розташування у ньому регуляторних ділянок та білках, що вона кодує тощо. У цей час створено великі бази даних послідовностей нуклеїнових кислот: «Genbank «(Лос-Аламос, США — понад 34 млн. нуклеотидів), база даних нуклеотидних послідовностей Європейської молекулярнобіологічної лабораторії (EMBL, Гейдельберг, ФРН — понад 34 млн. нуклеотидів) і «Генэкспресс «(СРСР, ВИНИТИ-ИМГ АН СРСР — більш 11 млн. нуклеотидів). Відомі також кілька білкових баз даних, найбільш представницької з якої є MBRF-PIR (США). Ці бази даних поширюються в різних носіях — магнітних стрічках і дисках, на оптичних дисках.

Крім побудови филогенетических древ геномів вірусів комп’ютерний аналіз застосовується у пошуку гомологий, розпізнаванні які кодують областей, функціональних сигналів, фізичному (рестрикционном) картировании молекул ДНК й у передбачення вторинних структур РНК.

Нині у світі створено дуже багато програм (зазвичай організованих в пакети), виділені на аналізу послідовностей нуклеїнових кислот і избавляющих дослідників багатьох трудоёмких рутинних операцій, зокрема: підрахунок числа моно -, ді - і тринуклеотидов, переклад нуклеотидної послідовності в аминокислотную і т.д.

Усі програми умовно діляться на два класу: загального призначення і спеціального. Перші здійснюють ряд_ найпоширеніших операцій зі збирання й аналізу послідовностей й дозволяють: вводити і редагувати нові послідовності, зчитувати з допомогою скануючих пристроїв інформацію безпосередньо з автографів чи гелів ", знаходити ділянки впізнавання эндонуклеаз рестрикції й подавати результати в зручному (табличном чи графічному) вигляді, знаходити ділянки із елементами поворотною і дзеркальній симетрії (паліндроми), транслювати нуклеотидну послідовність в білкову переважають у всіх трьох рамках зчитування, порівнювати дві послідовності методом точкових матриць гомології, порівнювати нову послідовність з усіма даними Ген Банку, знаходити ділянки, збагачені тими чи інші нуклеотидами, вираховуватимуть гіпотетичну температуру плавлення ДНК, здійснювати автоматичну складання секвенированных фрагментів на єдину структуру — молекулу ДНК, транслювати білкову послідовність в нуклеотидну з урахуванням нерівномірності використання кодонов-синонимов, визначати молекулярну масу НК і білків, пророкувати вторинну структуру білків, вираховуватимуть вільну енергію освіти шпильок і др.

Програми спеціального призначення створюються на вирішення більш спеціальних і найчастіше складніших завдань і вельми цікавлять більш вузького кола спеціалістів. Приміром, можуть виконувати ряд функцій: обчислення довжини фрагментів ДНК виходячи з їх электрофоретической рухливості в гелях; вибір гибридизационных зондів; пророцтво вторинної структури РНК; локалізація нуклеотидів в гені, які можна змінені (без зміни амінокислотною послідовності) з метою введення сайту впізнавання эндонуклеазы рестрикції; перебування ділянок з потенційно можливої структурою Z-формы ДНК; виявлення функціонально значимих ділянок в невідомої знову розшифрованої структурі виходячи з раніше виведеного консенсусу (внаслідок порівняльного аналізу кількох відомих структур з однаковою функцією); локалізацію ділянок, які кодують білки, і т.д.

Наприклад представлено меню пакета програм MICROGENIE, у тому числі слід, які функції загального чи спеціального призначення може вибрати дослідник під час роботи з нуклеотидными последовательностями.

Програма загального призначення «COMMON «забезпечує введення послідовності в ЕОМ, і навіть перевірку запроваджених даних в діалоговому режимі. Вони дозволяють також редагувати нуклеотидные послідовності: вводити заміни і вставки, виключати нуклеотиди, вирізати, вбудовувати і об'єднувати нуклеотидные послідовності отже моделювати гібридні і мутантні молекули ДНК. Введення послідовностей на згадку про машини можна проводити вручну з клавіатури, але протягом останнього час створено прилади для автоматичного сканування авторадиограмм і секвенирующих гелів, отриманих під час використання флуоресцентних міток, передачі даних відразу в комп’ютер та наступного аналізу послідовності з допомогою спеціальних програм. У свіжій у видавництві IRL (Оксфорд) книзі «Аналіз сиквенса нуклеотидних кислот і білків «докладно описуються як конструкція скануючих пристроїв, і програми для читання авторадиограмм. Створено програми на відновлення первинних структур високомолекулярних ДНК з урахуванням даних сиквенса фрагментів, отриманих у її Неспецифічному розщепленні (наприклад, ультразвуком,). Спорідненість між будь-який парою фрагментів ДНК виявляється виходячи з збіги послідовності нуклеотидів у тому структурах, причому ці збіжні послідовності і є місцем перекривання і ті два фрагмента можуть бути на більш протяжну структуру. Процес відбору фрагментів і стикування триває до. того часу, поки що не відновлено вся первинна структура досліджуваної ДНК. Однією таких компаній програм є «CONTIG «(існує її варіант для комп’ютера IBM PC), створена до лабораторій Ф. Сангера (Кембридж, Англія). Нижче наводяться основні операції, які дозволяє здійснювати програма «CONTIG » :

1) зберігання сиквенса кожного фрагмента;

2) відбір суміжних фрагментів і складання послідовностей з них;

3) порівняння даних, отриманих під час читання нових авторадиограмм, з роботи вже встановленими последовательностями;

4) об'єднання двох фрагментів з допомогою третього, що становить собою область перекривання первых;

5) пошук ділянок ДНК, комплементарных вже встановленим, що перевіркою правильності складання повної структури ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Метод Максама-Гилберта і метод Сэнгера засновані однією принципі. У першому використовується специфічне розщеплення ДНК, обумовлене природою підстав, у другому — статистичний синтез ДНК, який закінчується якоюабо одному з 4 нуклеотидів. Отже, основою обох методів є отримання повного (статистичного) набору фрагментів ДНК, які кожному з чотирьох нуклеотидов.

Хімічний метод (метод Максама-Гилберта) простіше залучити до тому разі, коли досліджувана ДНК дуже велика (200−500 ланок). У цьому разі, якщо йдеться про секвенировании высокомолекулярной ДНК, краще застосовувати метод полимеразного копіювання (метод Сэнгера), ніж вводити процедуру рестриктазного розщеплення із індивідуальних фрагментів. При энзиматическом секвенировании протяжних одноцепочечных ДНК (наприклад, бактеріофагів) можна використовувати набір олігонуклеотидівзапалів, синтез що у час не вимагають великих витрат часу й праці. Для двутяжевых высокополимерных ДНК найзручніша метод сліпого ензиматичного секвенування із застосуванням універсальної початку (їх випускають багато фірм) і методи обробки даних із допомогою ЕОМ. Хімічний метод також може бути застосований, але нинішнього випадку необхідно вирізати з вектора досліджувані фрагменти ДНК, і це ускладнює всю процедуру.

1. Спекотних А. А. Методи філогенетичного аналізу генів і белков.

//Молек.биология. (Результати науку й техніки. ВІНІТІ; М. 1985) 2. Комп’ютерний аналіз генетичних текстів / А. А. Александров,.

Н.Н.Александров, М. Ю. Бородовский І ДР. М.: Наука. 3. Методи молекулярної генетики та генної інженерії. Відп. ред.

Р.И.Салганник.-Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990. 4. Молекулярна клінічна диагностика. Методы: Пер. З анг. / Під ред.

С.Херрингтона, Дж.Макги. — М.: Світ, 1999. 5. Шабарова З. А., Богданов А. А. Хімія нуклеїнових кислот та його компанентов.

— М.: Хімія, 1978. 6. Шабарова З. А., Богданов А. А., Золотухін О.С. Хімічні основи генної інженерії: Навчальний посібник. — М.: Вид-во МДУ, 1994. 7. Експериментальні методи дослідження білків і нуклеїнових кислот /.

Подред. М. А. Прокофьева. — М.: Вид-во МДУ, 1985.