Литература — Інше (книжка в генетике)

Цей файл узятий із колекції Medinfo internet internet.

Е-mail: [email protected] or [email protected] or [email protected].

FidoNet 2:5030/434 Andrey Novicov.

Пишемо реферати на замовлення — e-mail: [email protected].

У Medinfo вам найбільша російська колекція медичних рефератів, історій хвороби, літератури, навчальних програм, тестов.

Заходите на internet — Російський медичний сервер для всех!

Якщо століття ХІХ по-праву ввійшов у історію світової цивилизации, як Вік Фізики, то стрімко завершающемуся віці ХХ, у якому нам пощастило жити, цілком імовірно, уготовано місце Століття Біології, і може бути корисними і Століття Генетики.

Справді, за неповних 100 років тому після вторинного відкриття законів Р. Менделя генетика пройшла тріумфальний шлях від натурфилософского розуміння законів наследствености і изменчивости, через експериментальне накопичення фактів формальної генетики до молекулярно-биологическому розумінню сутності гена, його структури та функції. Від теоретичних побудов про гені як абстрактної одиниці спадковості до розуміння його матеріальної природи як фрагмента молекули ДНК, яка кодує аминокислотную структуру білка, до клонування индивидуальных генів, створення докладних генетичних карт людини і тварин, ідентифікації генів, мутації яких пов’язані з важкими на спадкові недуги, розробки методів биотехнологии та генної інженерії, дозволяють цілеспрямовано отримувати організми із наперед заданими спадковими ознаками, і навіть проводити спрямовану корекцію мутантних генів людини, тобто генотерапию спадкових захворювань. Молекулярна генетика значно поглибила наші ставлення до сутності життя, еволюції живої природи, структурно-функціональних механизмах регуляції індивідуального розвитку. Завдяки її успіхам розпочато вирішення глобальних проблем людства, связанных з охороною його генофонда.

Природно, можливість маніпуляції з индивидуальными генами людини і тварин ще недостатня для понимания функції всього геному, осередку вцелом, взаимодії його частин у забезпеченні усього розмаїття механизмов онтогенезу, тобто розвитку однієї клітини до цілого организма. Якщо додати до цього, що у геномі будь-якого виду записана як програма індивідуального розвитку, але задодирована і весь еволюція виду, тобто його філогенез, становится зрозумілим наскільки логічною і методично своєчасної стала Міжнародна наукова програма «Геном людини ». Наряду з програмами й інших видів (лабораторные миші, нематоди) програма Геном людини, розпочата около.

10 років тому я, вже безпосередньо до 2 000 року дозволить повністю расшифровать первинну структуру спіралі ДНК, тобто ідентифікувати все гени людини, їх регуляторні елементи. Захватыающая Одіссея про спадковість, якої є цю програму, безмірале розширить наші уявлення про структуру і функції геному, його еволюції, відкриє горизонти настільки захоплюючого, візможна, і проінвестували щонайменше небезпечного спрямованого впливу особи на одне геном рослин, тварин і звинувачують, що особливо ризиковано, на власний геном. Важливо усвідомити, що це завтрешний день фундаментальної науки витратило не віддалені абстракції, але день сегоднешний. Вона настав і став реальним незалежно ми, і, а то й бути щодо нього готовим концептуально і методически, то пройде крім нас.

Предлгаемая вашій увазі книга, справді, є введення у молекулярну генетику спадкових хвороб Паркінсона й розрахована досить широку аудиторію медиків та біологів. Більшість з вже полягавшишихся фахівців у цих галузях — це реальна змога самоосвіти, якої, на жаль, з роками так часто пренебрегаем, заплутавшись в повсякденних турботах. Для студентів биофаков і особливо студентів-медиків — цю книжку справді може розглядатися як навчального посібника по молекулярным основам медичної генетики. Проте, й у перші місця і інших, по глибоке переконання авторів, багато років жив віддавшиших впровадженню досягнень молекулярної біології в медицинскуюя практику, книга може бути як довідкового руководства з генетики людини. Справді, жодна клінічна дисципліна (крім, то, можливо, служби організації охорони здоров’я) не мислима сьогодні без знань і звільнення певних навичок з генетики. Жоден біолог, зайнятий питаннями спадковості, изменчивости, онтогенезу чи еволюції незалежно від конкретного біологічного об'єкта, неспроможна ігнорувати людини, як одного з поки небагатьох біологічних видів з цілком розшифрованої структурою геному. Швидко що набирає сили молекулярная медицина, преподование азів якій вочевидь не досить палестинцям не припиняти лікарів, насправді є принципово новий якісний рівень у розумінні питань етіології, патогенезу, отже, і лікування багатьох хвороб, як спадкової моногенной, і мультифакториальной природы.

На думку, як сучасний лікар і специалист-биолог, а й кожен освічена людина сьогодні повинен знати про тріумф Міжнародного Наукового Співтовариства выполненді програми Геном людини, у яких успішно расшифровываются все гени людини, кожен із яких, будучи виділеним з організму, що проклонированным може у ролі лікувального препарату для генотерапії. Про те, що сьогодні ідентифіковано на генетичних картах понад п’ять 000 структурних генів і більше 60 000 поки невідомих значеннєвих і анонімних ДНК послідовностей. Про те, що навіть за 5 років по його перших успішних спроб запровадження чужорідних маркерних генів у клітини людини in vivo, число вже схвалених для клінічних випробувань програм з генної терапії наследственных захворювань досягло понад сто! Ці підсумки видаються особливо впечетляющими з урахуванням, що до даних Усімирної Організації Охорони Здоров’я близько 2,4% всіх новорожденных на земній кулі має ті чи інші спадковими порушеннями; близько сорока% ранньої дитячої смертності і инвалидности з дитинства обумовлені спадкової патологиїй. Слід згадати про досягнення молекулярної генетики у розшифруванні спадкових чинників таких бичів людства як ішемія серця, атеросклероз, діабет, онкологические і інфекційних захворювань. Адекватно сприймати яка відбувається очах революцію у біології й у медицине, вміти скористатися її привабливими плодами й уникнути небезпечні людства спокус — ось що необхідно сегодня клініках і лікарях, і біологам, і повноваження представникам інших суміжних спеціальностей, і освіченій человеку.

Саме ця мета, ця надзавдання, поставлена перед даноіншої монографією, восполняющей, на думку авторів, намітившишийся у вітчизняній наукову літературу прогалину у сфері молекулярных аспектів медичної генетики і генетики человека.

Окремі огляди, монографії (Шишкін, Калінін, 1993), переводна література із молекулярної біології і навіть обстоятельные зведення, що підбивають щорічні підсумки робіт з программе.

" Геном людини «досить фрагментарні і стосуються лише відділових аспектів проблем генодиагностики і генотерапіі. Розраховані переважно на фахівців із молекуляріншої біології. Завдання даної монографії як висвітлити сучасне стан справ у молекулярної діагностики та леченді спадкових хвороб методами генної терапії, але, переважно, підготувати читачів, передусім лікарів та біологів, до розуміння й сприйняттю цієї методично і концептуально досить складною обасти генетики.

Досягнення поставленої мети нам уявлялося логичным розпочати виклад матеріалу з описи структури та совремінних методів аналізу ДНК, з загальних поглядів на її клонировании, секвенировании, геномних библитеках (Глава I).

Глава II повністю присвячена структурі геному людини, новому розумінні поняття «ген », генним сімействам, вариабильным структурам геному. Генетичні карти, принципи їх построения, функціональне і позиційне картування, молекулярні маркери, сучасні досягнення у розробці фізичних і хромосомних карт чоловіки й в картировании генів, відповідальнаных за спадкові захворювання розглянуті в Главі III.

Глава IV повністю присвячена опису молекулярних методів детекции як вже мутаційних змін — у структурних генах, і методів сканування гаданих мутацій впределенных генів. Опис прямих методів ідентифікації мутаций доповнені непрямими методами, заснованими на молекулярном маркуванні мутантних генів. Всі ці методи, як прямі, і непрямі, становлять основу молекулярної діагностики моногенных спадкових хвороб, широко используются в генетиці людини в побудові генетичних карт, дослідженні проблем филогенеза, в популяційної гентике й у геномної дактилоскопії, тобто для ідентифікації личности.

Докладному аналізу внутрішніх (ендогенних) чинників мутагенеза, і навіть принципам популяционного аналізу мутацій присвячена Главі Y. Основні підходи, використовувані при изученді експресії генів у модельних безклітинних системах, лише на рівні окремих клітин та цілих організмів наведені у Главе.

VI. Принципи молекулярної діагностики спадкових болезз нею й, зокрема, пренатальної діагностики, і навіть особенности виявлення гетерозиготного носительства у сім'ях выского ризику, викладені у Главі VII. Невелика за величиною, але важлива також і розуміння принципів генної терапии.

Глава VIII стосується штучного створення генетичних моделей спадкових захворювань, зокрема базі трансгенних живоных. Описано використовувані у своїй методи спрямованого перенесення чужорідних генів у эукариотические системи. У Главі IX викладено основи генотерапії наследственных захворювань, розглянуті методи доставки чужорідної ДНК у клітини людини in vitro і in vivo, переваги та нестатки існуючих векторних систем (фізичних, хіміческих і біологічних), їх конструювання, преспективы створення «ідеальних «векторних систем. Коротко розглянуті підсумки вже проведених випробувань по генотерапії тих заболеваний, котрим Програми клінічних випробувань вже одобрены або є на стадії експерименту. У заключній главі (Глава X) ми вважали доцільним підвести некоторые результати і докладніше розглянути молекулярну диагностику трьох груп спадкових захворювань: (1) достаточале повно вивчену групу лизосомных хвороб накопления;

(2) хвороби експансії (переважно нейродегенеративні захворювання), викликані цілком новим раніше невідомим типом про «динамічних «мутацій і (3) найчастіші, соціально значимі спадкові захворювання, по пренатальної діагностиці яких молекулярними методами вже нагромаджено досить великий досвід у нашої лабораторії та інших медико-генетичних центрах России.

Отже, запропонована монографія розрахована досить широке коло читачів, але, передусім, на медиків і биологов, і навіть фахівців суміжних професій. Нам хотілося б, що вона буде особливо корисною для студентів мідіцинских інститутів власності та академій, лікарів курсів підвищення квалификации, співробітників медико-генетичних консультацій і центрів, і навіть для студетнов-биологов, чимало з яких, як свідчить наш досвід, поповнюють ряди спеціалізованих диагностических лабораторій, медико-генетичних центрів — і институтов.

ГЛАВА III.

ГЕНЕТИЧНІ КАРТИ, ПОЗИЦІЙНЕ КЛОНИРОВАНИЕ.

Розділ 3.1 Класифікація генетичних карт, оцінка сцепления.

Генетичні карти визначають хромосомну тотожністьность і взаємна розташування різних компонентів геному щодо одне одного. Можливість побудови таких карт обумовлена двома фундаментальними характеристиками геному: лінійним характером локалізації генів у хромосомах (це впределяется лінійністю молекули ДНК) і відносній стабильностью розташування облигатных елементів геному в пределах виду. При побудові генетичних карт використовують різні підходи. Передусім, до них належить аналіз генетического зчеплення з урахуванням визначення частот мейотической рекомбінації в інформативних сім'ях й вивчення особливостей наслідування ознак, зчеплених з маркерными хромосомними перебудовами. По-друге, дослідження експресії генів чи пошук специфічних послідовностей ДНК у клітинних гинувридах, містять лише деякі з геному людини — одну чи кілька хромосом чи його фрагменти. Нерідко із метою використовують механічний сортинг цілих хромосом і навіть їхнього відносно невеликих участковв. Ці прийоми дозволяють прив’язати картируемый ген до визначеної хромосомі і навіть до якогось фрагмента хромосоми. З допомогою комплексу весьмало тонких методів хромосомного аналізу, передусім, методов гібридизації in situ (див. Главу I) вдається картировать окремі гени на хромосомах людини часто з точністю до одного бенду. І, нарешті, методами молекулярного аналізу здійснюють фізичне картування последовательностей.

ДНК, локалізованих в специфічних ділянках хромосом. Потім проводять ідентифікацію у тих послідовностях транскрибируемых областей, тобто генів, із наступною ізоляцією і клонуванням відповідних повнорозмірних молекул кДНК. Кожен із розглянутих етапів аналізу структури геномало завершується побудовою карт генів, різняться по единицам виміру відстаней між окремими елементами цих карт, масштабам, за насиченістю чи ступеня деталізації в різних ділянках геному. Відповідно розрізняють карти зчеплення, генетичні карти, цитогенетические карти индивидуальных хромосом і її фізичне чи молекулярні карти впределенных ділянок ДНК. Для повної молекулярної идентификации окремих елементів геному, тобто визначення їхніх границь, структури та нуклеотидної послідовності, необхідно суміщення всіх типів карток у місцях локалізації цих элементов.

Першим кроком по дорозі побудови генетичних карт является формування груп зчеплення генів, контролюючих різні спадкові ознаки, як дослідження їх взаимного розташування у тих групах. На наступний етап опрероблять відповідність між генетичними групами зчеплення і цитогенетически идентифицируемыми хромосомами чи його фрагментами. Цитогенетическую ідентифікацію хромосом с. проводят з методів диференціальної окраски.

(см. раздел 3.2). Принаймні появи дедалі більшої кількості локализованных ознак ефективність побудови генетичних карт значно зростає, оскільки збільшується кількість маркованих ділянок хромосом отже, появляется можливість комбінованого використання різних експериментальних підходів ще докладного исследования цих участков.

Принципова схема картирования невідомих генів, представлена на Рис. 3.1, входять такі етапи. 1. Вияснение групи зчеплення; 2. Пошук найближчих що фланкують маркерів; 3. Визначення фізичної області (ДНК-последовательности), що включає шуканий ген; 4. Клонування набору фрагментів ДНК, перекрывающих досліджувану область; 5. Выделение від цього набору клонів, містять транскрибируемые.

ДНК-последовательности, може бути відповідні гену або його фрагмента; 6. Аналіз специфічних мРНК і клонирование кДНК-последовательности; 7. Секвенування і ідентифікація самого гена (Wicking, Williamson, 1991).

Розглянемо докладніше цю схему.

Побудова карт зчеплення грунтується на вивченні процессов розбіжності і рекомбінації гомологичных хромосом в мейозе. Генетичні ознаки, локалізовані у різних хромосомах, не зчеплені друг з одним, тобто передаються від своїх батьків дітям незалежно, і частота їх рекомбінації (Q) становить 0.5. Це пов’язано з випадковим характером розбіжності гомологичных хромосом в мейозе під час редукционного розподілу. Гени, локалізовані лише у хромосомі, рекомбинируют з допомогою кроссинговера, тобто з допомогою обміну ділянками гомологичных хромосом у процесі їх спарювання в мейозе (Рис. 3.2). У цьому порядок генів не порушується, але у прийдешнім можуть з’явитися нові комбінації батьківських алелів. Можливість кроссинговера між двома генами зависить від відстані з-поміж них. Чим ближче до гени розташовані друг до друга, тобто що більше вони зчеплені, тим ця вероятность меньше.

Оцінку зчеплення між генами проводять виходячи з статистичного аналізу сегрегації ознак у сім'ях з розгалуженими родоводами. Найчастіше у своїй використовують метод максимального правдоподібності (Kao, 1983), тобто підраховують десятковий логарифм шансів — lod (log of the odds), де (odds) виражаються як ставлення вероятности що спостерігається родоводу за умови, що дві гена зчеплені (0 < Q < 0.5), до тієї ж ймовірності за відсутності зчеплення (Q = 0.5). Якщо значення lod > +3, гени локализованы лише у хромосомі, причому максимально правдоподібна оцінка відповідає максимального значення lod. При значениях lod < -2 гени не зчеплені, тобто локалізовано в разных хромосомах чи різних куточках однієї хромосоми. Статистическую обробку родоводів зазвичай проводять із допомогою комп’ютерних програм, найвідоміші у тому числі программы LIPED, CRIMAP і LINKAGE (Ott, 1985; Ott, 1991;

Terwilliger, Ott, 1994). На генетичних картах зчеплення відстань між генами визначається сантиморганах (сМ).

1 дИВ відповідає 1% рекомбінації. Загальна довжина геному чоголовека у тих одиницях становить близько 3300 дИВ. Сопоставляя цю величину з розміром гаплоидного набору молекул ДНК, можна зрозуміти, що 1 дИВ приблизно еквівалентний 1 мільйону пар нуклеотидів. Такі розрахунки, проте, дуже приблизні, оскільки частоти рекомбінації, отже, і реальна довжина одного дИВ, можуть сильно варіювати в разособистих частинах геному. Існують, звані, гарячих точок рекомбінації, як і райони геному, де рекомбинація пригнічена (центромерные і теломерные ділянки хромосом, блоки конститутивного гетерохроматина та інших.). Звестно також, що частота рекомбінації чоловіки менше, ніж в жінок, отже загальна довжина чоловічого геному, вимірювана в одиницях рекомбінації, становить лише 3000 дИВ. Таким образом, генетичне відстань може дати лише ориентировочную інформацію про фізичному (реальному) відстані, выражаемом в парах нуклеотидов.

Розділ 3.2 Соматическая гібридизація, цитогенетический аналіз, картування анонімних последовательностей ДНК.

На початок 70-ых років побудова генетичних карт чоголовека просувалося дуже повільними темпами. Невеликий раззаходів сімей, період одного покоління, обмежену кількість інформативних родоводів і відсутність методів эффективного цитогенетичного аналізу всіх пар хромосом затрудняло цілеспрямоване картування генів людини. Достаточале сказати, що 1-ї ген людини — ген кольорової сліпоти був картирован на Х-хромосомі в 1911 г., а 1-ї аутосомный генлише у 1968 р. До 1973 г. на хромосомах чоловіка було картировано всього 64 гена, а до 1994 на генетичних картах чолостоліття було локалізовано вже майже 60 000 маркерних ДНК послідовностей, зокрема майже п’ять 000 структурних генів — Рис. 3.3. Настільки стрімкий прогрес в картированді генів людини пов’язані з появою нових технологій у цитогенетике, у клітинних культурах і особливо у молекуляріншої генетике.

Техніка соматичної гібридизації, тобто можливість експериментального конструювання талановитими в розмноженню міжвидових клітинних гібридів, стала однією з потужних інструментів перебування перетинів поміж групами зчеплення і цитогенетически идентифицируемыми хромосомами і навіть їхнього окремими сегментами. Гібридні клони отримують путим штучного злиття культивованих соматичних клеструм різних видів, зокрема, клітин чоловіки й різних гризунів — китайського хом’ячка, миші, пацюки (Шея, 1985).

Культивування таких соматичних гібридів, як з’ясувалося, супроводжується втратою хромосом людини. То існували отримані панелі гібридних клітинних клонів, містять всього одну чи кілька хромосом чоловіки й повний набір хромосом іншого виду. Виявлення людських білків, специфических мРНК чи послідовностей ДНК в клонах позволяет однозначно визначити хромосомну приналежність відповідних генів. У такий спосіб вдалося локалізувати більш 250 аутосомных генів людини (Kao, 1983).

Подальший прогрес у сфері генетичного картирования значною мірою асоціюється з діяльністю багатьох науково-дослідних центрів — і лабораторій зі створення банків клітинних культур, які мають найцікавіші і великі родовідні. Так було в Центрі по Изучению.

Поліморфізму Людини (CEPH) (Париж, Франція) було створено унікальна колекція перевиваемых клітинних культур від усіх членів сімей, багатоступінчасті родовідні яких насчитывают багато десятків і навіть сотні індивідуумів (CEPH-семьи).

(Todd, 1992; Weissenbach et al, 1992). Перевиваемые лінії клеструм одержували доходи з первинних культур, трансфорированных вирусом.

Эпштейн-Барра, після чого такі лимфобластозные клітини становятся «безсмертними », тобто можуть необмежено довго підтримуватися за умов культивування. CEPH-семьи є ідеальні системи для генетичного аналіза спадкових ознак. Через війну дослідження цих клітинних ліній визначено генотипи членів CEPH-семей одночасно по тисячам поліморфних локусів і побудовано відповідні генетичні карти. З іншого боку, спільні зусилля багатьох лабораторій світу було створено Банки Клеточных Культур, у яких підтримуються колекції лимфобластозных ліній клітин, отримані від членів найбільш информативных сімей, у яких спостерігається сегрегація по различным спадковим ознаками, зокрема по моногенным заболеваниям. Матеріал цих ліній як клітинних клонів чи зразків ДНК використовується, зокрема, для аналізу сцепления сегрегирующих генів з такими відомими генетичними маркерами чи із знову описаними полиморфными локусами. Отже, у часто при картировании генів людини буде подолано обмеження, пов’язані із нестачею великих інформативных родословных.

Нарешті, на початку 1970;х років з’явилася реальна возможность точної ідентифікації як всіх хромосом в кариотипі людини, а й їхні окремих сегментів. Це з появою методів диференціального фарбування препаратів метафазных хромосом, які, власне, справили революцію у цитогенетике і хромосомологии. Для отримання дифференциальіншої забарвлення хромосомні препарати забарвлюють деякими флюорохромами, або, після відповідної протеолитической проработки чи нагрівання, — барвником Гимза. У цьому на хромосомах виявляється характерна поперечна исчерченность, звані бэнды, розташування яких специфічно кожної хромосоми. На метафазных хромосомах малою мірою спирализации ідентифікується близько 750 таких смуг, на прометафазных хромосомах 2 500 — 3 000. Отже, величина невеликих бэндов на прометафазных хромосомах відповідає 1 дИВ на цитогенетичних картах чи 1 мільйону пар підстав на фізичних картах. Такі орієнтовні рассчеты, як згадувалося, корисні і при співставленні масштабів різних генетичних карт.

Відповідно до офіційно затвердженої номенклатуре.

(ISCN, 1971) кожна хромосома людини після диференціальної забарвлення можна розділити на сегменти, нумерація яких починається від центромерного району вгору (короткий плече — р), або вниз (довше плече — q) (Рис. 3.4). Смуги у кожному сегменті також пронумеровано в аналогічному порядку. Великі смуги найчастіше поділяються сталася на кілька частин, соответствующих дрібнішим бэндам, выявляемым лише за приблраске малоспирализованных прометафазных хромосом. Запис положения гена на цитогенетической карті включає номер хромосомы, плече, і навіть номер сегмента, бенду та її субъединицы. Наприклад, запис 7q21.1 означає, що ген локалізований в субъединице 1, 1-го бенду 2-го сегмента довгого плеча хромосоми 7.

Така докладна запис особливо зручна при использованді для цитогенетичного картирования методу гібридизації in situ (см. Главу I), що дозволяє локалізувати ген з точностью до одного бенду і навіть у його субъединицы. Основу данного методу, як зазначалося становить гібридизація геномной ДНК цілих хромосом різних стадіях їх спирализации із котрим попередньо міченими специфічними ДНК-зондами.

Джерелом останніх можуть бути геномные послідовникности ДНК, зчеплені з картируемым геном, або кДНК-овые послідовності. Нині з тканеспецифических бібліотек генів виділено близько 20 000 анонімних последовательностей кДНК, які мають понад десять 000 різних генів людини (Sikela, Auffray, 1993). Ці кДНК становлять прирозмірено 10−15% всіх які кодують послідовностей геному. Методом гібридизації in situ вже ідентифіковано понад 2.000 генів, багатьом у тому числі доки знайдено зчеплення з полиморфными маркерами (Poduslo et al., 1991). Такі кодующие послідовності присутні на карті генів людини, та їх ми маємо картами сцепления.

Розділ 3.3 Генетичні індексні маркеры.

Як ми вже відзначали раніше, успішна локалізація неизвестного спадкового ознаки (гена) значною степені визначається присутністю на карті що фланкують марцірів, що є на щодо невеличкому відстані за обидва боки гена. Як генетичних маркерів специфических ділянок хромосом можна використовувати будь-які локализованные у тих ділянках елементи геному із високим рівнем легко ідентифікованої популяційної мінливості чи полиморфизма. Відбір зчеплених з картируемым ознакою генетических маркерів роблять за результатам спільного аналиправо їх сегрегації в інформативних семьях.

Значні успіхи у геномном картировании були связаны з допомогою як генетичних маркерів панівною у багатьох популяціях мінливості по зферментному спектру різних білків. Виявилося, що чимало ферменти в різних індивідуумів, у різних тканинах і різними стадіях онтогенезу можуть міститися у різних изоформах.

Такі варіанти однієї й тієї ж білка звичайно відрізняються по специфічної активності, але мають змінену электрофоретическую рухливість. Популяційний аналіз изоферментов виявив існування поліморфізму для дуже багатьох белковых систем, контрольованих різними генами, локализованными у багатьох хромосомах. Отже, тих хромосом знайшли генетичні маркери, з допомогою яких були идентифицированы відповідні групи сцепления.

Удосконалення молекулярних методів аналізу специфических послідовностей ДНК призвело до виявлення большого числа высокоизменчивых ділянок геному — поліморфних сайтов рестрикції, гипервариабельных мініі микросателлитных послідовностей (см. Главу II) Ця мінливість також бла використана для маркування ділянок хромосом для встановлення точнішого взаєморозташування локусів. Вскоре після виявлення поліморфних сайтів рестрикції були опубліковані теоретичні рассчеты, за якими від 10 до 20 таких локусів, розташованих рівномірно з кожної хромосоме з відривом близько 20 дИВ друг від друга, достатньо визначення хромосомної приналежності генів, відветственных будь-яку тип спадкової изменчивости.

(Botstein et al, 1980). За цією оцінкам близько 200 таких індексных маркерів дозволять побудувати карти зчеплення всім відомих генів виходячи з аналізу сегрегації соответствующих ознак у сім'ях з великою кількістю мутантів. Для опрерозподілу порядку розташування генів на хромосомах з оцінкою генетичних відстаней з-поміж них досить близько 400 рарномерно розподілених поліморфних маркеров.

Ідентифікація в геномі людини значної частини полиморфных сайтів рестрикції й розробка простих методів аналіза індивідуальної мінливості за цими локусам істотно підвищили можливості локалізації невідомих ознак на геномних картах. Вже на 1989 г. були картированы понад 2.000 клонованих послідовностей ДНК, обнаруживающих полиморфизм за довжиною рестрикционных фрагментів (ПДРФ) в различных популяціях (Kidd et al., 1989). Більше 1000 їх типировано в CEPH-коллекциях родоводів. У значною мірою це анонімні послідовності, зв’язок яких із специфическими генами не встановлено. Їх найменування найчастіше відповідають назві відібраного з бібліотеки генів клона. Надалі розробили стандартна генетична номенклатура для позначення використовуваних як марцірів сегментів ДНК з невідомої функцією. Перша літера D, що таке ДНК, потім номер хромосоми, далі P. S для уникальных і Z для повторюваних послідовностей і наприкінці алезаходів, ідентифікуючий даний зонд у районі ДНК.

Застосування поліморфних сайтів рестрикції як генетических маркерів має дві обмеження: порівняно низкая інформативність (частота гетерозигот неспроможна превышает.

50%- див. Глави II, Y) і нерівномірне распределение.

ПДРФ-сайтов по хромосомам. Цих недоліків практично чишены гипервариабельные STR-сайты (ді-, триі тетрануклеатидные повтори). Використання мікроі минисателлитных ДНК послідовностей як індексних генетичних марцірів відкрило нову еру у будівництві карт зчеплення геному чоголовека. Нині робота з ідентифікації высокополиморфных маркерів, перекрывающих весь геном і рівномірно розподілених по хромосомам практично завершенаа.

(Weissenbach et al., 1992; Reed et al., 1994). Цю систему побудовано базі динуклеотидных (C-A)n повторов.

(C-A)n*(G-T)n є найбільш частий клас простих повторів, виявлених у геномі людини (за исключением An* Tn мультимеров). Такі повтори присутні прирозмірено один% колоній з геномних бібліотек, сконструйованих з урахуванням фрагментів довжиною 300 — 500 п.о., утворювані після перетравлення геномної ДНК эндонуклеазой Alu1. Более.

90% їх виявляються полиморфными за кількістю копій в кластере, причому у 70% локусів присутній більше трьох алелів. В.

1992 р. групі французьких вчених під керівництвом Жана.

Вайссенбаха вдалося розробити систему ідентифікації з поміццю ПЛР індивідуальної мінливості у місцях локализации.

(C-A)n повторів і основі створити геномную карту из.

814 высокополиморфных індексних маркерів із середнім расстоянием з-поміж них майже п’ять дИВ, яка дістала название.

Genethon-коллекции микросателлитных маркерів (Weissenbach et al., 1992). І тому були просеквенированы більш 12 000 фрагментів ДНК, виділених з геномної Alu1-библиотеки шляхом її скринінгу poly (dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймери для амплификации підбирали з послідовностей ДНК, окружающих повтори, використовуючи при цьому комп’ютерні программы.

Для подальшого аналізу відібрали близько 3 000.

(C-A)n-сайтов і проведена специфічна ампліфікація їх в чотирьох неродинних CEPH-индивидуумов. На следующем етапі було визначено хромосомная приналежність полутара тисяч найбільш інформативних маркерів шляхом їх ідентификации в панелі з 18 соматичних гібридних клонів, зітримають різні набори хромосом людини. Детальна карта зчеплення індексних маркерів побудована за результатами їхньої генотипирования в колекції 8 найбільших CEPH-родословных.

Запропонована система маркерів перекриває все хромосоми, а сумарне відстань з-поміж них відповідає приблизно 90% всього геному человека.

До 1994 р. число індексних STR-маркеров було збільшено до.

2 066, а середній інтервал між сусідніми локусами зменшений до 2,9 дИВ (Gyapay et al., 1994). Останнім часом перспективи широкомасштабного картирования всього геному людини стаще вагоміші. Групою англійських авторів під руководством Дж. Тодда було розроблено систему автоматичного скринирования 254 динуклеотидных маркерів, перекрывающих весь геном людину з середнім відстанню між сусідніми маркерами близько 14 дИВ. 80% цих повторів відібрали из.

Genethon-коллекции маркерів, інші - з деяких інших источников (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всіх 254 полиморфных сайтів проводили в 39 мультиплексных ПЛР (МПЦР), причому використовувані цих цілей олигопраймеры були мічені чотирма типами флюорохромов, отже аллели навіть однакового молекулярного ваги можна було розрізнити на электрофореграмме за кольором. У кожній із 39 МПЦР скринировали 7 — 9.

STR-сайтов якоїсь конкретної хромосоми. Такі МПЦР-наборы були розроблено всім 22 аутосом й у Х-хромосомы.

Реєстрація алелів всіх STR проводилася автоматичним сканнером з допомогою комп’ютерної програми Genotyper.

Тільки з допомогою одного автоматичного сканера вдається проаналізувати за цією схемою більш 2.5 тисяч генотипів щодня! (Reed et al., 1994). Така система вже нині открывает найширші можливості як для генетичного картирования і шляхом створення докладних карт зчеплення практично будь-яких моногенных захворювань, але, що особливо істотно, вона робить реальної розробку стратегії картирования генів, мутації яких навертають до мультифакториальным заболеваниям, таких як діабет, гіпертонія, інфаркт міокарда, психози і що другое.

Розділ 3.4 Хромосом-специфические бібліотеки генів, пульсуючий гель-электрофорез.

Використовуючи таку розлогу систему молекулярних маркерів і проводячи аналіз зчеплення на колекціях клітинних культур чи матеріалі інформативних родоводів можна досить швидко прив’язати будь-який ознака, особливо моногенный, як до визначеної хромосомі, а й до одному бэнду, впределить найближчі фланкирующие маркери і стати непосередньо до позиционному клонування із єдиною метою виділення, тож ідентифікації самого гена. У цьому важливого значення в картировании генів належить молекулярно-цитогенетическим підходам, що є принципово важливим ланкою для успешного суміщення карт зчеплення і фізичних карт цілих хромосом та його фрагментов.

Точність цитогенетичного картирования визначається ступенем спирализации хромосом, характером використаної мітки і роздільну здатність мікроскопічного оборудования. При картировании на стандартних метафазных хромосомах та використання радіоактивно мічених зондів точність картирования обмежується одним великим бендом і навіть сегментому хромосоми і як близько 5−10 мільйонів п.о. З використанням биотиновой мітки на прометафазных хромосомах точність картирования зростає у середньому у 5−10 раз (до 1 мільйона п.о.), а під час роботи зі спеціально приготовлені і розтягнутими интерфазными хромосомами може становити близько 50 тисяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual, 1992). Тим ні менш, за такої роздільної здатності цитогенетическое картирование дає лише рекомендацію дуже орієнтовні результати і обычно сприймається як 1-ї етап фізичного картирования.

Значно точніші результати досягаються на 2-му етапі - етапі фізичного (рестрикционного) картирования.

Середнє відстань між стандартними сайтами впізнавання на рестрикционных картах коливається не більше від 10 до 20 кб.

Через розбіжностей на два порядку масштабів цитогенетического і молекулярного картирования пряме зіставлення цих типів фізичних карт практично невозможно.

Однією з способів подолання цих труднощів є конструювання хромосом-специфических бібліотек генів. Як згадувалося (см. Глава I, 1.5) на приготування таких бібліотек використовують набори клітинних ліній соматичних гібридов з окремими хромосомами людини або хромосоми, механически відібрані шляхом проточній цитометрии. Для некоторых видів молекулярного клонування зручніше виявилися библиотеки генів, побудовані з субхромосомальных фрагментов.

Одержання таких фрагментів досягається шляхом цілеспрямованоного конструювання соматичних гібридів, містять лише деякі з будь-якої хромосоми людини. Субхромосомные клони можна отримати і з допомогою микроманипуляций, при которых механічно, під медичним наглядом мікроманіпулятора то, можливо вирізаний практично будь-який видимий фрагмент кожної хромосомы.

Розроблено також молекулярні методи виділення з геному та ідентифікації великих фрагментів ДНК, майбутніх зазаходам до одиничним хромосомным бэндам. Це уможливилося після виявлення редкощепящих рестриктаз, ріжуть ДНК на фрагменти довжиною від сотень тисяч мільйон пар нуклеотидов (Estivill, Williamson, 1987).

Іншою важливою кроком по дорозі клонування та якісного аналізу великих субхромосомальных фрагментів ДНК стала розробляються методи їх поділу шляхом гель-электрофореза в пульсирующем полі (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith et al., 1987). Відповідно до стандартними методами електрофорезу під впливом односпрямованого постійного поля була в агарозном чи полиакриламидном гелях вдається разделять фрагменти ДНК розміром трохи більше 3 — 5 десятків килобаз.

Просування великих фрагментів ДНК в гелі при пульсуючому зміні напрямку електричного поля відбувається, по.

— видимому, з допомогою конформационных змін, обумовлених скручуванням і розкручуванням молекул ДНК в останній момент переключения напрями поля. У цьому коротші молекули легше адаптуються до умов і тому рухаються в гелі швидше. Є різноманітні варіанти пульсуючого гель-электрофореза, переважно, пов’язані з геометрическим розташуванням напрямів полів — ортогональный, гексогональный, інверсійний. З використанням будь-якої з цих варіантів можна розділити молекули ДНК розміром от.

50 кб до, ніж 9 мільйонів п.о. Ефективність розділіния фрагментів ДНК залежить тільки від їх розмірів, а й та умовами проведення електрофорезу (напруга, температура буфера, концентрація агарозы, певний час самого імпульсу). У качестве маркерів визначення величини великих молекул ДНК використовують цілі хромосоми дріжджів відомої молекулярної маси. Надалі відбір великих фрагментів ДНК, несучих специфічні послідовності, також може бути осуществлен шляхом блот-гибридизации з ДНК-зондами. Розділені ідентифіковані фрагменти ДНК може бути элюированы з гелю і використовуватимуться рестрикционного картирования, посадуроїння бібліотек генів й у молекулярного клонування з єдиною метою ідентифікації та ізоляції генних послідовностей. Останнім часом для ізоляції великих субхромосомальных пєгментів ДНК широко використовується метод клонування в штучних дріжджових минихромосомах — YAC, і побудови бібліотек генів з урахуванням YAC-векторов.

Розділ 3.5 Позиційне клонування, прогулянка і стрибки по хромосомі, ідентифікація і ізоляція генов.

Ми згадували, що середні розміри гена становлять близько 10−30 кб, варіюючи в межах (см.Глава II.2.

4). Одиниці рекомбінації, розміри цитогенетичних бэндов і субхромосомных фрагментів ДНК вимірюються мільйонами пар нуклеотидів, як і розміри фрагментів ДНК, виділених з допомогою обробки геномної ДНК редкощепящими эндонуклеазами, пульсуючого електрофорезу і клонування в дріжджових минихромосомах. Перехід від результатів цих великих фрагментів до післядовательностям ДНК, порівнянними з розмірами гена, осуществляют з допомогою молекулярного клонування, тобто получения набору фаговых чи космидных клонів, містять відносьтельно невеликі послідовності, насыщаяющие чи підлогуностью що перекривають великий сегмент ДНК, може бути у якому идентифицируемый ген (Рис. 3.5). Потім проводять упорядкування клонів відповідно до взаємним расположениїм инсертированных у яких фрагментів ДНК, здійснюючи одноуременно молекулярний аналіз цих фрагментів із єдиною метою идентификации регуляторних чи які кодують областей генів. Пізніше ми докладніше зупинимося за тими критеріях, з допомогою яких можна розрізнити транскрибируемые і нетранскрибируемые участкі геному. Для молекулярного клонування використовують различные підходи (Iannuzzi, Collins, 1990). Насамперед, це насыщающее клонування, тобто ізоляція з хромосом-специфических бібліотек кілька сотень клонів з єдиною метою картирования різними методами инсертированных у яких фрагментов.

ДНК та ідентифікації клонів з послідовностями, локализованними в заданому районі. Значно частіше використовується тактика скринирования фаговых, космидных і YAC бібліотек, сконструйованих з субхромосомальных сегментів ДНК, передварительно відібраних виходячи з зчеплення з различными.

ДНК-маркерами. У цьому методи виділення субхромосомальных сегментів ДНК можуть бути дуже різними. Подальший пошук в бібліотеках генів клонів, містять транскрибируемые послідовності ДНК, здійснюють досить трудомісткими методами, які отримали назва «прогулянки «і «стрибків «по хромосоме.

" Прогулянка «по хромосомі чи ковзне зондирование.

(Рис. 3.6). залежить від послідовному відборі клонів, зітримають частково перекрывающиеся фрагменти ДНК з определенного району геному (Rommens et al., 1989). У першому етапі проводять скринінг бібліотеки з допомогою маркерной ДНК, сцепленній з геном. Після перебування позитивних клонів останні самі служать зондами для ізоляції інших клонів, містять перекрывающиеся послідовності ДНК. Таким проразом, щоразу відібраний фрагмент використовують у качестве скринирующего ДНК-зонда на подальше пошуку. У результате получют набір клонованих фрагментів ДНК, підлогуностью перекрывающих область пошуку гена. Група подібних клонів називається «контигов ». З допомогою фізичного картирования инсертированной ДНК у різних клонах вдається точно встановити ступінь перекривання між сусідніми фрагментами і впорядкувати становище клонів в «контигах » .

При скринировании космидных бібліотек з виявленням кожної нової клона до дільниці ДНК, повністю перекрытому отобранными зондами, загалом додається близько 20 кб. Таким способом, проте, рідко вдається пройти більш 200 — 300 кб щодо одного напрямі через наявність у геномі повторюваних як важко клонируемых послідовностей ДНК.

Для подолання цих обмежень і прискорення процесу пошуку генних послідовностей американським исследователем Фрэнком Коллинзом, нині президентом Програми Геном Человека, розробили метод «стрибків «по хромосомі. Цей метод дозволяє ізолювати фрагменти ДНК, віддалені в геноме друг від друга на сотні тисяч нуклеотидів (довжина стрибка), не ізолюючи у своїй все проміжні последовательности.

ДНК (Collins, Weissman, 1984). Як бачимо на представленої схемою (Рис. 3.7), стрибки починаються зі стартового зонда, тобто із послідовності, гибридизующейся зі зчепленим з геном ДНК-маркером. Попередньо геномная ДНК переваривается редкощепящей рестриктазой, у результаті утворюються великі фрагменти ДНК, відповідні за довжиною одному прыжку. Потім, ці фрагменти перетворюються на кільцеву форму з допомогою штучного приєднання до кінців невеликого маркерного гена. У цьому кінці рестрикционных фрагментів зближуються. Кільцеві молекули ДНК розрізають среднещепящими рестриктазами і з пулу відносно невеликих фрагментов.

ДНК відбирають ті, які містять маркерный ген, а, следовательно, і оцінили оточуючі його кінцеві ділянки вихідних великих фрагментів. Відібрані послідовності клонируют в фаговых чи космидных вектори, одержуючи бібліотеку генів кінцівых ділянок. Потім у цій бібліотеці проводять скринінг клоновий, містять стартовий зонд. Тільки цих клонах комплементарные зонду послідовності з'єднані маркерным геном з послідовностями ДНК, віддаленими від стартового ділянки пошуку на довжину стрибка. За необхідності проміжні пєгменти ДНК також може бути клоновані з допомогою метода ковзаючого зондирования.

Зупинимося тепер у тих критеріях, якими можна відрізнити сегменти ДНК, є частинами генів, від будь-яких інших послідовностей (Рис. 3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;

Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,.

1992). Умовно вони можна розділити втричі групи. У першій групі досліджують структурні особливості генних послідовностей. Друга ж група критеріїв полягає в пошуку функціональних ділянок генів. У третьому разі аналізують характер нуклеотидних послідовностей тестіруемых фрагментів ДНК. Діагностику структурних ділянок геновий здійснюють шляхом гібридизації з ДНК-зондами чи прямим скринуванням кДНК-овых бібліотек. Функціональна диагностика генів включає уловлювання экзонов (exon trapping), промоторных ділянок, поли-A сигнальних послідовностей, і навіть перенесення генів у інші конструкції й ідентифікації у яких відповідних транскриптів. І, нарешті, пошук генів може бути здійснений шляхом прямого секвенування великих фрагментів ДНК з наступним комп’ютерним аналізом нуклеотидной послідовності і зіставленням її з присутствующими в базах даних були ідентифіковані генами інших напрямів живих существ.

Як зазначено раніше, які кодують області генів, представлені у геномі унікальними послідовностями, досить консервативні у процесі еволюції. Існує великий відсоток гомології у структурі ДНК між однаковими генами в різних видів ссавців. У цьому факті грунтується, так званий зоо-блот — скринінг клонованих последовательностей, які містять повторів, але дають перехресну гібридизацію з геномної ДНК, виділеної із різних видів животных — приматів, сільськогосподарських тварин, гризунів, птахів, рептилій. Клони, містять консервативні последовательности, піддають подальшому аналізу на присутність у инсертированных фрагментах ДНК CpG острівців, часто маркирующих 5 «-фланкирующие області генів хребетних, особливо геновий домашнього господарства (см. Главу II, 2.4), і досліджують наличие відкритих рамок зчитуванняORF (open reading frames).

Подальший пошук генів у вужчому інтервалі може бути здійснений з допомогою комп’ютерного аналізу відповідної нуклеотидної послідовності ДНК. З іншого боку, все клонированные ДНК від цього інтервалу може бути відразу использованы для аналізу РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).

Важливим доказом приналежності клонованої ДНК гену є ідентифікація гомологичных РНК транскриптів в тканинах, де можна припустити експресію цього гена. Для цього він проводять гібридизацію вже відібраних за двома критеріям клонів ДНК із тотальною мРНК, виділеної з цих тканин, і навіть скринируют відповідні кДНК-овые библиотечи. Для генів спадкових захворювань з невідомим первинним біохімічним дефектом бібліотеки конструюють з уражених органів прокуратури та тканин. При виявленні послідовникностей кДНК, гибридизующихся з геномными зондами, їх, своєю чергою, використовують із зондування бібліотеки й виявлення всіх клонів з перекрывающимися послідовностями кДНК. На жаль, для генів з низькому рівні експресії гибридизация може дати позитивних результатов.

Виділені клони, задовольняють переліченим критуриям, запросто містять послідовності ДНК, є частинами гена. Проте, завжди є велика небезпека вибору якогось іншого гена (чи псевдогена), локалізованийного у тій області ДНК. Тому потрібні додаткові докази ідентичності обраної послідовності ДНК специфічного гену. Такі докази може бути получены, наприклад, щодо нуклеотидної послідовникности кДНК і зіставленні її з амінокислотною последовательностью кодованого цим геном білка. Вагомим доказательством на користь правильності проведеної ідентифікації гена то, можливо виявлення мутантних варіантів алелів в ізольованих послідовностях ДНК в хворих, котрі страждають відповідним на захворювання. Приміром, при ідентифікації гена муковісцидозу, у 70% хворих на клонируемой кДНК послідовності було виявлено однотипна мутація — делеция трьох нуклеотидів — delF508. Нарешті, решающим аргументом правильності ідентифікації потрібного гена является успішно здійснена з його за допомогою генокоррекция первинного біохімічного дефекту, виконана на соответствующих культурах мутантних клітин, чи отримання стійкого терапевтичного ефекту в трансгенних тварин — біологічних моделей даного спадкового заболевания.

Визначення розміру молекул мРНК, гибридизующихся з геномными клонами, дає оцінку сумарною величини гена. Ця оцінка має важливого значення для реконструирования полноразмірною кДНК. Її клонування, по суті, означає идентификаию гена, оскільки дозволяє визначити межу в геномной.

ДНК, охарактеризувати його экзонно-интронную структуру і регуляторные елементи. Знаючи первинну нуклеотидну последовательность кДНК, з упевненістю прогнозувати аминокислотну послідовність відповідного білка отже визначити первинне біохімічне ланка в патогенезе відповідного спадкового заболевания.

Описаний спосіб вивчення молекулярних і біохімічних основ спадкових захворювань отримав назву зворотної генетики, а процес на відміну традиційного шляху від білка до гену, з так званого функціонального клонування, було названо позиційним клонуванням, тим паче, термін зворотної генетики вже використовувався раніше позначення методу аналізу функції гена шляхом спрямованого запровадження нього мутацій (Collins, 1992).

Можливість використання функціонального клонування залежить від доступності інформації про білковому продукті і/або про головну функцію відповідного гена. Для переважної більшинства моногенных хвороб визначення первинного биохимического дефекту є дуже складне завдання недостатнє розуміння функціонування величезної кількості клітинних ферментів, складнощів їх взаємодії, низьких концентрацій, відсутності ефективних методів виділенония і очищення а, найчастіше, навіть через брак даних про клітинах — мішенях, у яких слід шукати первинний биохимический дефект. Тому на згадуваній тлі зростання даних про структуру геному чеовека і, про насиченості генами і анонімними ДНК маркерами окремих хромосом та його сегментів, реальні соотошения функціонального і позиційного клонування в ідентифікації генів, відповідальних за спадкові захворювання, швидко змінюється убік безусловного домінування последнего.

Успіх позиційного клонування визначається возможностями картирования гена, у своїй функція гена досліджується вже саме його ідентифікації і клонування. На рис. 3.8 представлена загальна схема позиційного клонування, заимствованная із роботи Коллінза (Collins, 1992). Зазвичай, перебування становища невідомого гена на карті зчеплення використовують 100 — 200 поліморфних маркерів. Після виявлення хромосомної приналежності картируемого гена точніша локализациия може бути встановлена з допомогою принезбираного відбору додаткових індексних маркерів з определенного цитогенетичного сегмента. Картування гена, впределяющего спадкове захворювання, то, можливо значительале прискорений за наявності в якогось хворого цитогенетически видимої структурної перебудови у сфері локалізації цього гена, найчастіше делеции чи транслокации. Хоча такі пациенты, зазвичай, трапляються нечасто, але опис самаго випадку може виключити необхідність картирования гена шляхом послідовного аналізу його зчеплення з генетическими маркерами цілого геному і дозволить перейти непосередньо до молекулярному клонування. Саме такою проразом були ідентифіковані гени хронічного грануломатоза, міопатії Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоти, нійрофиброматоза I, аниридии та інших спадкових болезней.

З іншого боку, часом вдається виключити длительный процес молекулярного клонування, використовуючи метод.

" кандидатного гена ". Розробка методів, які полегшують нахождение транскрибируемых областей геному, уловлювання экзонов і регуляторних ділянок генів, секвенування і картування методами гібридизації in situ великої кількості анонімних кДНК послідовностей, ізольованих з тканеспецифических бібліотек, це у комплексі призводить до значительному збільшення ступеня насиченості різних сегментів хромосом відомими генними послідовностями, серед доторых і здійснюють пошук гена-кандидата. Велика роль цих міжнародних дослідженнях належить також мутантным генетичним лініях тварин, що моделює різні спадкові заболевания людини (див Глава VIII). Значне подібність нуклеотидных послідовностей які кодують ділянок гомологичных генів ссавців і вагу людини, наявність значної частини консервативних груп зчеплення з наборами ідентичних генів дозволяють успішно вести паралельні дослідження геномів людини тощо тварин, значно що прискорюють эффективность пошуку істини та молекулярного аналізу індивідуальних генів людини (Dietrich et al., 1994; Copeland et al, 1993).

Молекулярна ідентифікація генів відкриває широкі змогу аналізу тканеспецифической регуляції їх експресії у розвитку організму всіх рівнях від транскрипції до трансляції. Следуюшим етапом молекулярного аналізу є генотипирование мутацій як дослідження тих порушень у структурі, локалізації чи ферментативної активности відповідних білків, які творяться у результаті змін нуклеотидних послідовностей ДНК. Ці дві проблеми докладніше висвітлені у наступних розділах книги.

Зазначимо лише, що на даний час таких досліджень стали возожны багатьом сотень спадкових захворювань людини, котрим ідентифіковані геномные последовательности ДНК, відповідні генам, і проклонированы підлогуноразмерные кДНК-последовательности.

Розділ 3.6 Каталог генів і генних хвороб МакКьюсика.

Міжнародна програма «Геном людини » .

Величезний внесок у систематизацію і узагальнення інформації про генетичних картах хромосом людини, локалізації і функциях окремих генів, і структурі геному загалом, вносять дослідження, проведені протягом 30 років в.

Університеті Джона Хопкінса в Балтиморі під керівництвом професора Віктора МакКьюсика. Результатом цих досліджень є систематичне, з 2-х-годичным інтервалом між останніми п’ятьма публікаціями, видання енциклопедій, содержащих зведені даних про всіх картированных генах чоловіки й що з ними спадкових хворобах під названием:

" Менделевсое успадкування в людини: каталог людських генів і генетичних хвороб «(«Mendelian inheritance in man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes ». Ці видання містять сучасні хромоcомные карти генів чоловіки й кожному за локусу обобщенные як окремих статей інформацію про характері наследования, функціях і розмірах генів; методах їх картирования та ідентифікації; кодованих продуктах; мутантних аллелях, полиморфизмах і внутригенных повтори; фенотипических проявлениях мутацій, їхнього нерозривного зв’язку зі спадковими захворюваннями, і навіть про природу основного дефекту, включаючи патогенез і патофізіологію захворювання. Усі статті обладнані вичерпними літературними посиланнями. Cводные таблиці по картированным локусам з різними типом спадковості й по генам наследственных захворювань складено або у відповідність до їх хромосомной локалізацією, або у алфавітному порядку за названиям генів чи з найменувань відповідних генних болезній. Окремо представлені дані про клонованим генам, котрим відомий первинний молекулярний дефект. У цьому кількість різних ідентифікованих мутантних варіантів до різних генів коливається від однієї за кілька сотен.

Видання містять також список доступних мутантних клітинних линий.

Кожному локалізованому менделирующему локусу у цій енциклопедії присвоєно шестизначний номер (MIM), перша цифра якого визначає характер наслідування: 1 — для аутосомно-доминантных генів, 2 — для аутосомно-рецессивных, 3 і 4- для генів, локалізованих в Xй у Y-хромосомах, соответственно, 5 — для мітохондріальних генів. Чотири цифри, такі після точки безпосередньо за шестизначним номером, призначені для кодування різних мутантних вариантів даного локусу. Видання випускаються як і друкованої формі, і у комп’ютерному варіанті (OMIM) на дискетах чи компакт-дисках. У разі вони обладнані программами, що дозволяє здійснювати пошук за якою позиції і проводити постійне відновлення енциклопедії поточної информацией. Програми OMIM сумісні коїться з іншими базами генетических даних, насамперед, з GDB (Genome Data Base), що містить повну інформацію (включаючи последовательности.

ДНК) про картированных генах, ДНК-маркерах і ДНК-зондах людини, в тому числі з GenBank — повної базою даних усіх піднятих ізвестных нуклеотидних gоследовательностей ДНК.

У цьому 11-ом виданні енциклопедії МакКьюсика зітримаються інформацію про 6678 картированных менделирующих локусах людини (McKusick, 1994). У тому числі 4458 генів з аутосомно-доминантным характером наслідування, 1730 — з аутосомно-рецессивным, 412 генів локалізовано в Ікс-хромосомі, 19 — в.

Y-хромосомі і 59 — в мітохондріальній ДНК. Для чем.

2800 картированных генів визначено функція. З моногенными захворюваннями пов’язано 770 картированных локусів, а загальна кількість нозологічних форм, котрим гени картированы, включає 933 захворювання. У цьому більш 420 генів спадкових хвороб вже клоновані й у кожного з цих генів описано від однієї за кілька сотень мутантних варіантів алелів, що характеризуються різним фенотипическим проявлением.

Різні хромосоми та його ділянки картированы з різною мірою деталізації. На найбільшої за величиною хромосоме.

1 картировано вдвічі нижча генів, ніж Х-хромосомі (200 и.

400 відповідно). Щільність вже картированных генів у різних хромосомах дуже нерівномірна. Так, хромосома 19 зітримає 178 генів, тоді як хромосома 13 лише 40, у своїй перша більше другий. Хромосоми 17 і 18 приблизно рівні за величиною, але першої вже картировано 180 генів, але в сотрійлише 26. На хромосомі 2 картировано приблизно стільки ж генів (близько 175), як і втричі менше її за величиною хромосомі 17. Существеные розбіжності у числі картированних генів відзначаються і усередині різних ділянок хромосом. Приміром, 19 з 43 генів хромосоми 21 локалізовано у сегменті 21q22.3, котрий становить лише 20% довгого плеча. Проласть 9q34 займає 10% хромосоми 9, але містить 27% генів ;

38 з 141 (Antonarakis, 1994). Кількість таких прикладів нерівномірного розподілу картированных генів по хромосомамс то, можливо значно увеличено.

Більше 10 років тому був майже повністю просеквенирован митохондриальный геном (Anderson et al., 1981), який складається из.

16 569 нуклеотидів і у якому 37 генів, 22 з яких цей гени транспортних РНК, 2 гена рибосомальной РНК і 13 белковых генів, які кодують субьединицы комплексів окисного фосфорилювання (OXPHOS). Слід зазначити, що 56 субьединиць цього технологічного комплексу кодується ядерними генами (McKusick:

1994). Мітохондріальна ДНК дуже щільно насичена кодирующими ділянками, оскільки мітохондріальні гени не містять інтронов і мають надзвичайно обмежені розміри некодирующих фланкирующих ДНК. Нині описано досить багато болезней, що з мутаціями в митохондриальном геномі, й вони розвиваються внаслідок порушень у системі окислительного фосфорилирования.

Ми згадували у тому, що на даний час проклонировано близько 20 000 анонімних послідовностей кДНК, виділених з тканеспецифических бібліотек генів і представляющих близько 10−15% всіх генів людини. Хоча цих последовательностей ми маємо картами генів, секвенування, зіпоставляння з комп’ютерними базами даних, і гібридизація in situ дозволять вже у вже найближчим часом здійснити їхню ідентификацию і локалізацію (McKusick, Amberger, 1993).

Слід зазначити, кожен картированный ген і полиморфный локус власними силами автоматично стають точками відліку в геномі, тобто молекулярними маркерами. Поруч із, триває інтенсивне насичення геному новими молікулярными маркерами типу STS (sequence tagged sites) і мікросателлитными повторами типу STR (short tandem repeats).

(cм. Главу II). У вересні 1994 р Genome Database (GDB) включалу 6691 STR-сайтов і трьох 752 їх (56%) мали рівень гетерозиготности більш 60%. Карти зчеплення для індексних маркеров сконструйовані, переважно, за результатами генотипирования сорока CEPH референтних сімей (см. Глава II, 2.3).

Середнє відстань між сусідніми маркерами варіює від 2 дИВ для хромосоми 21 до 5 дИВ найбільш великих хромосом з дуже малим числом ділянок в геномі з відстанню між маркерами великим, ніж 10 дИВ. GDB містить 672 гена, локализованных картами зчеплення індексних маркерів, від кількості 3485 клонованих генів (Guapay et al., 1994). Создані останніми роками досить докладні геномные карти зчеплення молекулярних маркерів в масштабах 13, 0; 5,0 і такж 2,9 сантиморганид; автоматизація процесу генотипирования маркерних микросателлитных (STR) алелів; велика кількість вже картированных структурних генів, анонімних ДНК-последовательностей значно спрощують і, прискорюють процес генетичного картирования. Якщо 1992 р. у розпорядженні иследователей були лише 814 динуклеотидных поліморфних сайтів (Weissenbach et al., 1992), то вже безпосередньо до травня 1994 р. їх кількість зросла до 3 300 (Guyapay et al., 1994), а під кінець року — до 5 000- 6 000 (Shmitt, Goodfellow, 1994). Так само все швидше наростає число молекулярних маркерів й у геномі лабораторних мишей (Service, 1994). За всією видимости, чоловік і лабораторна миша будуть першими млекопитающими з цілком розшифрованими геномами.

Картування генів чоловіки й з’ясування первинної нуклеотидной послідовності людського геному становлять основні, взаємозалежні завдання Міжнародної программы.

" Геном Людини ". Офіційно ця наукова програму з доліїм провідних молекулярно-генетичних лабораторій США, Західіншої Європи, же Росії та Японії оформилася в 1990 р. Проте, задовго до придбання офіційного статусу, у країнах відбувалися важливі молекулярні дослідження з вивченню генома чоловіки й картированию його генів. Історія отечественіншої програми почалася 1987 р. Її ініціатором і безперечним лідером багато років було академік А. А. Баев. За його наполяганню в 1989 г. вона почала одна з головних Государственных науково-технічних програм СРСР. Основні розділи програмних засобів як, і в усьому світі включають три головні напрями наукових досліджень про: 1. Картування і секвенування геному; 2. Структурно-функціональне вивчення геному; 3. Медичну генетику і генотерапию (Баев, 1990;

1994).

Передбачалося, що його розділ програми, касающийся секвенування всього геному, тобто з’ясування первичіншої послідовності всієї молекули ДНК однієї клітини чолостоліття завдовжки близько 1,5 метрів, що з 3.5×10!9 нуклеотидов, буде завершено вже безпосередньо до 2 005 року. Проте, серйозні технічні вдосконалення цього трудомісткого процесу, його автоматизація та різке зниження (від 1 $ США за крок у 1990 р. до 0,2 $ в 1995 р.) подають надію, що ця гігантська молекула, несуча інформацію про всієї программе індивідуального розвитку людини її еволюції буде цілком розшифровано вже безпосередньо до 2 000 року ! (Marshall, 1995).

Природно, що врешті-решт цієї роботи будуть идентифицированы і всі гени людини, тобто буде визначено їх кількість, взаєморозташування на генетичної карті і структурно-функциональные особливості. Передбачається, що осуществление цього проекту, крім колосальних теоретичних узагальнень для фундаментальних наук, надасть значний вплив розуміння патогенезу, попередження і лікування спадкових хвороб, значно прискорить дослідження молекулярних механізмів, що у основі розвитку дуже багатьох моногенных порушень, сприятиме більш еффективному пошуку генетичних основ мультифакторіальних заболеваний і спадкової схильності до таких широдо поширеним хворобам людину, як атеросклероз, ишемія серця, психіатричні і онкологічні заболевания.

ГЛАВА X.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ.

МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Розділ 10.1. Хромосомная локалізація та принципи классификации генів спадкових болезней.

Розділ 8.1 Хромосомная локалізація та принципи классифи;

На цей час на хромосомах людини картироваоднак, близько 800 генів, мутації яких призводять до різним спадковим захворюванням. Кількість моногенных заболеваний, котрим відома локалізація контролюючого гена, ще більше й наближається до 950 з допомогою існування авлельных серій, тобто груп хвороб, клінічно дужеличающихся друг від друга, але обумовлених мутаціями щодо одного й тому самому гені (см. Глава IV). Всім цих захворювань принципиально можлива пренатальна діагностика з допомогою непрямих методів молекулярного аналізу (см. Главу VII).

Більше половини картированных генів клонировано і охарактеризовано методами молекулярного аналізу. До кожного з цих генів описані мутантні варіанти серед відповідних груп хворих, причому кількість ідентифікованих алелів у різних генах може коливатися від однієї за кілька зітен (см.ниже). Молекулярне генотипирование мутації позволяет встановлювати прямий пренатальную діагностику відповідного спадкового захворювання на сім'ях високого риска.

(см. Главу VII).

Кількість генів спадкових хвороб, локалізованих з кожної хромосомі наведено на Рис. 10.1. У середньому, на каждой із них 1995 р. ідентифіковано близько тридцяти таких структурных генів. Привертає увагу нерівномірний характер розподілу цих генів. Так, хромосоми 1 і 2 мають приблизно однакові розміри (хромосома 2 навіть дещо крупніша), проте, число вже картированных генів, що з спадковими захворюваннями, на хромосомі 1 в 3 разу меньше, ніж хромосомі 2. Найбільше таких генів (больше.

100) картировано на Х-хромосомі. Це, очевидно, можна пояснити гемизиготным проявом мутацій генів Х-хромосомы в компаунде гоносом ХУ чоловіки. Разом про те, аналіз приведенных даних (Рис. 10.1) свідчить і про феномен разособистої насиченості різних хромосом структурними генами. Наибольшая щільність структурних генів властива хромосомам.

1, 3, 7, 9, 17, 22, Х. Значно менші - хромосомам 2,.

13, 18, 21, У (Antonarakis, 1994). Не випадково, дисбаланс неяких із хромосом 2-ї групи часто сумісний із постнатальным розвитком (синдром Дауна — трисомия 21; синдром Эдвардса.

— трисомия 18; синдром Патау — трисомия 13). Очевидно, це пов’язано з порівняно низькою щільністю структурних генів у цих хромосомах, ні з відсутністю них генів, контролюючих ранні стадії розвитку. Навпаки, сравнительале слабка насиченість відомими генами хромосом 2 і 15 разом із рідкістю їх дисбалансу навіть у абортном материале, можна розглядати на користь наявності у цих хромосомах.

" ранніх генів ", контролюючих початкові стадії онтогенезу людини: гаметогенез, ранній ембріогенез. Мутації таких геновий відкидаються селекцією вже в цих ранніх стадіях, а потому не виявляються постнатально. Стрімке зростання даных про генетичної інформації, закладеною у кожної хромосомі, розподілі у ній структурних і регуляторних генів, їх взаємодії з надмолекулярными структурами хромосом (гетерохроматином), межхромосомных взаємодію і феномен геномного імпринтингу відкриває широкі можливості на новому методичному і концептуальному рівні підійти до проблеми хромосомного (геномного) контролю ранніх стадій розвитку чолостоліття — основну проблему цитогенетики розвитку млекопитающих.

(Баранов, 1984; 1990; 1992; Dyban, Baranov, 1987).

Інше становище, яке варто згадати в ввідна частину цієї глави стосується специфічності мутаційних повреждений кожного структурного гена. Як зазначалося ранее.

(см. Глава V), попри наявність загальних закономірностей в мутаційних процесах, спектр мутацій кожному за гена, рарале як самі структурні гени — унікальні. Причини цієї унікальності криються у особливостях первинної структури ДНК кожного гена, зокрема, обогащенности CG нуклеотидами, його розмірах, наявності прямих і звернених повторів, присутствии всередині гена ДНК послідовностей, гомологичных позагенним ділянкам, що далі міг приводть щодо порушень процесів рекомбінації в мейозе тощо. До кожного ідентифіковану гена, мутації якого призводять до спадковим заболеваниям, розроблено ефективні методи молекулярної діагностики, зазвичай, створені задля генотипирование найчастіших мутацій цього гена. Рідше тих ж цілей використовується непрямой метод діагностики з допомогою молекулярних маркеров.

(см. Глава YII).

Цитогенетические карти є одне із шппсобов однозначної і обьективной систематизації генів. Для практичних цілей медико-генетичного консультування і диференціальної діагностики моногенных захворювань така класифікація який завжди зручна, бо за складанні карт генів неможливо враховується інформація про особливості кодируемых генами продуктів або про фенотипическом прояві мутантных алелів. У медицинскихх цілях черезвычайно важливо уявити про групах генів, які кодують функциональа й структурно родинні білки, або що контролюють заболевания саме таким клінічної картиною. Проте, які завжди класифікація по клінічним параметрами може бути однозначно за низкою причин. По-перше, велике число моногенных спадкових захворювань носить синдромальный характері і, найчастіше, вдається виділити групу провідних клінічних симптомів. По-друге, багато хвороби вирізняються високим рівнем фенотипической гетерогенності, пов’язаної чибо зі специфікою мутаційних ушкоджень, або із розбіжностями в оточуючих умовах і/або в генетичному тлі (див. Главу.

IV). З іншого боку, багато хвороби, викликані мутаціями в разных генах, можуть протікати аналогічно і, базуючись лише з клінічних симптоми, важко провести дифференциальную діагностику подібних захворювань. Тому найбільш обьективная класифікація моногенных спадкових хвороб з такими відомими первинними біохімічними дефектами проводиться з урахуванням класифікації відповідних генопродуктов з учетому їхньої участі у певних метаболічних циклах.

У цьому заключній главі спробуємо проиллюстрировать ряд прикладів теоретичні становища, викладеноные у роки розділах. Для прикладу буде приведено стислі молекулярно-генетические характеристики деяких класів добре вивчених і поширених моногенних спадкових хвороб. Більшість цих завболеваний у тому мірою вивчаються у наукных центрах Росії, які діагностика в медико-генетичних центрах країни проводиться як по клінічним параметрам, але й обов’язковим урахуванням результатів молекулярного і/або біохімічного обследования.

Розділ 10.2. Метаболічні дефекти лизосомных ферментов. Хвороби накопления.

Як приклад найповніше й всебічно вивченийных захворювань ми вибрали групу хвороб, обумовлених спадковими дефектами лизосомальных гидролаз. У Табл.

10.1 представлені даних про успадкування і народження чизосомных хвороб, хромосомної локалізації і структурі соответствующих генів, кодованих ними продуктах і идентифицированних мутантних аллелях. Дани також посилання основні работи із картування відповідних генів, їх клонування та ідентифікації мажорних (тобто частих) мутаций.

Таблиця складена за матеріалами Каталогу спадкових болезней У. МакКьюсика 1994 г.(McKusik, 1994) і доповнена необходимыми літературними данными.

Таблиця 10.1 Молекулярно-генетические основи лизосомных болезней.

(N) — примітки, представлені у кінці таблицы).

——————————-T———————T———————————-T———————- ————- Синдроми 1), номер по¦Встречаемость,¦Типы і кількість му- ¦Литература.

¦ МакКьюсику; хромосом-¦белок, размеры¦таций 5), мажорні мута¦(локализация і структура¦ ная локалізація; ген ¦в аминокисло- ¦циив дужках вказані ¦генов, клонирование кДНК,¦ 2);размеры 3); экзоны¦тах 4) ¦частоти алелів у б-ных¦идентификация мутацій). ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ N-ацетил-альфа-D-га- ¦Дуже рідко 6)¦Миссенс — 2: ¦Wang et al., 1990 ¦ лактозаминидазы деф.;¦ ¦E325KШіндлера болезнь¦Desnick, 1991.

¦ Шиндлера;Канзаки б-нь¦Ацетилгалактоз¦R329W — Канзаки болезнь¦

¦ 104 170; 22q11; ¦аминидаза, аль-¦ ¦

¦ NAGA.2; кДНК-2.2 кб ¦фа-N-; 411¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Ангиокератома Фабрі; ¦1: 40 000 ¦Миссенс -31;делеции (від¦ Bishop et al., 1988 ¦ дистопический липидоз¦ ¦1 зв. до неск.экз.) -11;¦ Kornreich et al., 1990 ¦ 301 500; Xq22; ¦Галактозидаза ¦сплайс.-5 (їх 3 з ¦ Davies et al., 1993 ¦ GLA.50; 12 кб, 7 экз.¦альфа; 429¦дел.экз); инс., дупл.-3 ¦ Eng et al., 1993 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Аспартилглюкозамину- ¦Більше 100 случ¦Миссенс -5; делеции -4;¦Ikonen et al., 1991 ¦ рия, ¦у Фінляндії ¦инсерции -2; ¦Ikonen et al., 1992 ¦ 208 400; 4q23-q27; ¦Аспартилглюкоз¦C163S — мажорна мута- ¦

¦ AGA.11; ¦аминидаза; 346¦ция у Фінляндії (98%) ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Вольмана б-нь;гиперхо¦Более 70 случ.¦Делеция 72 н., возникшая¦Anderson et al., 1991 ¦ лестерин-гипертригли-¦ ¦внаслідок сплайсинго¦Anderson et al., 1994 ¦ церидемия, ¦Лизосомальная ¦виття мутаціїобнаружена¦Maslen et al, 1993 ¦ 278 000; 10q24-q25; ¦кисле липаза ¦у два случаях;миссенс -2;¦Klima et al., 1993 ¦ LIPA.4; 36 кб;10 экз.¦-A ¦инсерция 1 зв. — 1. ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Галактосиалидоз, ¦Преим.в Японии¦Делеция экз.7 (сплайс.)¦Galjard et al., 1988 ¦

¦Протективный ¦-мажорна у взрослsх в ¦Wiegant et al., 1991 ¦ 256 540; 20q13.1; ¦білок бета га-¦Японии; миссенс -6; ¦Takano et al., 1991 ¦ PPGB.7; мРНК — 2 кб ¦лактозидазы452¦F412V — у два випадках ¦Zhou et al., 1991 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Ганглиозидоз GMI; му-¦Неизвестно ¦Миссенс -10; дуплик.-2;¦Oshima et al., 1988 ¦ кополисахаридоз 1YB, ¦ ¦I51T і R201C-мажорные в¦Noshimoto et al., 1991 ¦ 230 500; 3p21.33; ¦Галактозидаза ¦у Японії, R482H і W273L¦Suzuki et. al., 1993 ¦ GLB1.12; кДНК — 2кб ¦бета-1; 677¦мажорные у Європі ¦Mosna et al., 1992 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Ганглиозидоз GM2-I, ¦1: 300 000; у¦Миссенс-34;дел.-8;инс.-¦Proia et al., 1987 ¦ варіанти B, B1 і псев-¦евреев 1:3 000¦2;сплайс.-8; Мажорные: у¦Myerowitz et al., 1988 ¦ до AB;Тея-Сакса б-знь¦Гексозаминида-¦евреев-инс.4 н.-70%, спл¦Arpaia et al., 1988 ¦ 272 800; 15q23-q24; ¦за A, альфа ¦айс.-20%;G269S-взр.-20%¦Navon et al., 1989 ¦ HEXA.52; 35 кб, 14экз¦ 529¦не євреї - R247W — 32% ¦Triggs-Raine et al., 1992¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Ганглиозидоз GM2, тип¦1: 300 000 ¦Миссенс -5; делеции -2;¦Proia: 1988.

¦ II, Зандхоффа хвороба,¦ ¦инсерции — 2; Мажорные:¦Neote et al., 1990 ¦ 268 800; 5q13; ¦Гексозаминида-¦16-кб делеция 1−5 экз.-¦Wakamatusi et al., 1992 ¦ HEXB.9; 40 кб, 14экз.¦за B, бета; 556¦27%;делеция 50кб; P417K¦McInnes et al., 1992 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Ганглиозидоз-GM2, AB ¦Дуже рідко ¦Миссенс -3: C107R; ¦Heng et al., 1993 ¦ варіант, ¦ ¦R169P; C138R (1 пациент¦Schroder et al., 1993 ¦ 272 750; q31.3-q33.1;¦GM2-активатор-¦гомозиготен) ¦

¦ GM2A.3; ¦ный білок; 193¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Гоше хвороба; глико- ¦1:600 у.е.вреев¦Миссенс -30;инс.-1;деле¦Sorge et al., 1985 ¦ сфинголипидоз, ¦ізол. в Швеции¦ции-3;сплайс.-1; Мажор-¦Sorge et al., 1987 ¦ 230 800; 1q21; ¦Глюкоцеребро- ¦ные (98%):N370S, L444P,¦Beutler et al., 1992 ¦ GBA.36; ¦зидаза; 644¦R463C, 84insG;IVS2+1 G-A¦Horowitz et al., 1994 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Лейкодистрофия глобо-¦1: 50 000 в ¦Нонсенс мутация: E369TER¦Zlotogora et al., 1990 ¦ ид-клеточная, Краббе,¦Швеции ¦ ¦Sakai et al., 1994 ¦ 245 200; 14q21-q31; ¦Галактозилцера¦ ¦

¦ GALC.1; кДНК -3.78 кб¦мидаза 669¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Лейкодистрофия ¦1: 100 000 ¦Миссенс -7; делеции -2;¦Stein et al., 1989 ¦ метахроматическая, ¦ ¦сплайс. -2; регулят. -1¦Polten et al., 1991 ¦ 250 100; 22q13.31-qter¦Арилсульфатаза¦Мажорные:P426L і сплайс¦

¦ ARSA.12; 8 экз¦A 507¦2 -70%, регулят. — 1−2%¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Лейкодистрофия позначка- ¦Рідко ¦Миссенс -4: T23I, T216I,¦Rorman et al., 1992 ¦ хроматична, SAP1 ¦ ¦C241S, F385C; ¦Wenger et al., 1989 ¦ деф.; Гоше б-нь, ¦ ¦инсерция 33 зв. -1; ¦

¦ 176 801; 10q21-q22; ¦Просапозин ¦регуляторна мутація в ¦

¦ PSAP.6; 20 кб, 13экз.¦ 511¦инициирующем кодоне -1 ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Лизосомальной кислої ¦ ¦ ¦Pohlmann et al., 1988 ¦ фосфатазы деф., ¦Кисла фосфату¦ ¦

¦ 171 650; 11p12-p11; ¦за 2, лизосом-¦ ¦

¦ ACP2.; кДНК-2.1 кб ¦ная 423¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Липидоз сфингомиелино¦Редко ¦Миссенс — 8; делеции -3¦Quintern et al., 1989 ¦ вый;Ниманна-Пика бо- ¦ ¦Мажорные:тип A євреї: ¦Levran et al., 1991 ¦ лезнь, тип A/B, ¦ ¦R496L, L302P, дел.1н.P330¦Schuchman et al., 1992 ¦ 257 200; 11p15.4-p15.1¦Сфингомиелина-¦в комплексі 65%; тип B ¦Suchi et al., 1992 ¦ ¦ SMPD1.11; ¦за 629¦Сев.Африка R608del->80%¦Takahashi et al., 1992 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Ниманна-Пика болезнь,¦Очень рідко ¦ ¦Carstea et al., 1993 ¦ тип З, ¦ ¦ ¦Kurimasa et al, 1993 ¦ 257 220; 18p; ¦ ¦ ¦

¦ NPC.; ¦ ¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Ниманна-Пика болезнь,¦Очень рідко ¦ ¦Winsor et al., 1978 ¦ тип D, ¦ ¦ ¦

¦ 257 250; ¦ ¦ ¦

¦

¦ ¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Маннозидоз, альфа B, ¦50−100 випадків¦ ¦Kaneda et al., 1987 ¦ лизосомальный, ¦Лизосомальная ¦ ¦

¦ 248 500; 19p13.2-q12;¦альфа-D-манно-¦ ¦

¦ MANB.; ¦зидаза B ¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Маннозидоз, бета, ¦Дуже рідко ¦ ¦Lundin, 1987.

¦

¦Лизосомальная ¦ ¦

¦ 248 510; chr.4?; ¦бета маннози- ¦ ¦

¦ MANB1.; ¦даза ¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ MASA синдром (сложная¦Редко ¦ ¦SchranderStumpel ¦ спастическая парапле-¦ ¦ ¦et al., 1990.

¦ ¦ гія), 303 350; Xq28; ¦Маннозосвязыва¦ ¦Rosenthal et al., 1992 ¦ MASA.; ¦ющий лектин248¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Мукополисахаридоз 1; ¦1:100 000, ¦Нонсенс -4; миссенс -3;¦Scott et al., 1991 ¦ Гурлера синдром;Шейе,¦1:600 000-Шейе¦сплайс. -1; справ. 1н. -1¦Scott et al., 1992 ¦ 252 800; 4p16.3; ¦Альфа-L-идуро-¦Мажорные: W402X (31%), ¦Moskowitz et al., 1993 ¦ IDUA.9; 19 кб, 14экз.¦нидаза 653¦Q70X (15%), P533R (3%) ¦Scott et al., 1993 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Мукополисахаридоз II;¦1:70 000 в Из-¦20% -великі делеции, из¦Wilson et al., 1990 ¦ Хантера синдром, ¦раиле ¦них 4,5% -всього гена; ¦Bunge et al., 1993 ¦ 309 900; Xq28; ¦Идуронат-2- ¦делеции 1−3н-7;миссенс-¦Flomen et al., 1993 ¦ IDS.29; 24 кб, 9 экз.¦сульфатаза 550¦13;нонсенс -4;сплайс.-5¦Hopwood et al., 1993 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Мукополисахаридоз ¦1: 24 000 в ¦ ¦Kresse et al., 1971 ¦ IIIA, Санфилиппо синд-¦Нидерландах ¦ ¦

¦ ром A, 252 900; ¦(всі типи A-D)¦ ¦

¦

¦ ¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Мукополисахаридоз ¦Найчастіше¦ ¦Pande et al., 1992 ¦ IIIB, Санфилиппо синд-¦на півдні Європи ¦ ¦

¦ ром B, 252 920;Chr.17?¦ ¦ ¦

¦

¦ ¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Мукополисахаридоз III¦Редко ¦ ¦Zaremba et al., 1992 ¦ З, Санфилиппо синдром¦ ¦ ¦

¦ З, 252 930;Chr.14 чи ¦ ¦ ¦

¦ 21?; ¦ ¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Мукополисахаридоз III¦Редко ¦ ¦Robertson et al., 1988a ¦ Санфилиппо синдром D,¦N-ацитил-глюко¦ ¦Robertson et al., 1988b ¦ 252 940; 12q14; ¦зоамин-6-суль ¦ ¦

¦ GNS.; ¦фатаза 552¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Мукополисахаридоз IYA¦1: 300 000 ¦Миссенс — 3: N204K, ¦Tomatsu et al., 1991 ¦ Моркио синдром, ¦ ¦A138V, R386C; ¦Tomatsu et al., 1992 ¦ 253 000; 16q24.3; ¦Галактозамин-6¦делеция 2 зв. — 1 ¦Masuno et al., 1993 ¦ GALNS.4; ¦сульфатаза 522¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Мукополисахаридоз YI;¦Редко ¦Миссенс — 4: C137V, ¦Litjens et al., 1989 ¦ Марото-Лами синдром, ¦ ¦C117R, L236P, C405Y; ¦Schuchman et al., 1990 ¦ 253 200; 5q11-q13; ¦Арилсульфатаза¦делеция 1н. — 1 ¦Jin et al., 1992 ¦ ARSB.5; ¦B 533¦ ¦Litjens et al., 1992 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Мукополисахаридоз YII¦Очень рідко ¦Миссенс — 5: A619V, ¦Guise et al., 1985 ¦ Слая синдром, ¦ ¦R382C, R216W, R354W, ¦Oshima et al., 1987 ¦ 253 220, 7q21.11; ¦Бета-глюкуро- ¦R611W ¦Miller et al., 1990 ¦ GUSB.5; 21 кб, 12экз.¦нидаза 651¦ ¦Tomatsu et al., 1991 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Сиалидоз типи I і II;¦50−100 випадків¦ ¦Oohira et al., 1986 ¦ липомукополисахаридоз¦ ¦ ¦Klein et al., 1986 ¦ 256 550; 6p21.3; ¦Нейраминида- ¦ ¦Sasagasako et al., 1993 ¦ NEU.; ¦за-1 ¦ ¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Фукозидоз, ¦30−60 випадків ¦Нонсенс — 5: Q351X-мажор¦Fowler et al., 1986 ¦

¦Фукозидаза аль¦ная (20%), E375X, Q77X,¦Kretz et al., 1992 ¦ 230 000; 1p34; ¦фа-L-1,ткане- ¦W382X, Y211X;делеции -4¦Roychoudhuri et al., 1988¦ FUCA1.10; 23 кб, 8экз¦вая 461¦(экз2−1,1н-3);сплайс.-1¦Seo et al., 1993 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-;

1) — через "; «вказані різні найменування хвороб або аллельные варианты.

2) — після найменування гена через ". «зазначено кількість ідентифікованих мутантних алелів до липня 1994 г.

3) — розміри генів зазначені у килобазах (кб), іноді замість розмірів гена вказані розміри кДНК чи мРНК.

4) — розміри білка зазначені у правом нижньому углу.

5) — при кількості мутацій, меншому 5, усі вони вказуються після знака ": «, при більшій кількості перелічуються тільки типи мутаций.

96) — частоти запозичені із зведеної таблиці Scriver et al., 189.

Скорочення — взр.- дорослі; справ.- делеция; дупл.- дупликация; инс. — инсерция; зв.- нуклеотиди; сплайс. — заміна нуклеотидів в донорном чи акцепторном сайтах сплайсингу чи мутації в интронных проластях, створюють новий сайт сплайсингу; прим.- экзон.

З таблиці 10.1 слід, що з 29 з 31 лизосомных хвороб визначено хромосомная локалізація гена, причому в.

26 випадках — абсолютно однозначно. 23 лизосомных гена клонированы. Для 20 лизосомных захворювань описані різні мутантные аллели, що підтверджує правильність ідентифікація відповідних генів (см. Главу III). Для 12 захворювань наєни мажорні мутації у різних популяціях. Для 8 заболеваний загальна кількість ідентифікованих мутацій доки перевищила шостої і, можливо, мажорні мутації ще будуть идентифицированы.

Спектр мутацій у різних лизосомных генах дуже разнообразен. Так, при хвороби Фабрі поруч із явним переважанням миссенс мутацій виявлено 14 внутригенных перебудов размераме від 0.4 до 8 кб, чимало з яких мають точки розриву в экзоне 2 — області локалізації значної частини Alu-повторов.

Сам ген GLA містить 12 різних Alu-элементов, складающих близько тридцяти% його довжини. У місцях розривів часто обнаруживаются короткі прямі і звернені 2−6 нуклеотидные повторы.

Однією з можливих механізмів виникнення структурних перестроек у цьому гені то, можливо незаконна Alu-Alu рекомбинация чи, ймовірніше, рекомбінація між короткіми повторами. Участь Alu-элементов передбачається також за виникненні 16-кб делеции промоторной області й перших 5-и экзонов гена HEXB — мажорній мутації при хвороби Зандхоффа.

Порушення процесу рекомбінації є, очевидно, причиной виникнення дуже великої великих, а також дрібніших делеций в IDS-гене при синдромі Хантера. Висока концентрация CpG динуклеотидов сприймається як можливий эндогенный механізм виникнення мажорній серед євреїв-ашкеназі мутації P330FS в гені SPDM1 при хвороби Ниманна-Пика типу B, оскільки ця делеция виникає у районі, де з десяти залишків 9 становлять цистеины.

Делеции цілих экзонов чи инсерции интронных областей виникають порівняно часто внаслідок точковых мутацій в донорних чи акцепторных сайтах сплайсингу. Прикладами виявляються мажорна у Японії сплайсинговая мутація, супроводжується делецией 7-го экзона генаPPGB, яка веде до галактосиалидозу і сплайсинговая мутація IVS2+1, що зумовлює вирізання экзона 2 гена GBA при хвороби Гоше. Поява внаслідок точковой мутації в интронной області нового сайту сплайсингу він може супроводжуватися структурними перебудовами. Такова, зокрема, природа 33-нуклеотидной инсерции в гені PSAP при метахроматической лейкодистрофии, зумовленої дефицитом.

SAP1; 24-кб инсерции в гені HEXB при хвороби Зандхоффа и.

5-нуклеотидной инсерции в гені IDUA при синдромі Шейе. Важливо, що такі мутації сумісні із заснуванням незначної частини функціонально активних мРНК, наслідком є щодо м’якше протягом відповідних форм заболеваний.

У окремих випадках виникненню мутацій може призвести до наявність псевдогена. Молекулярний аналіз псевдогена, тісно зчепленого з геном GBA, показав, що, по крайнього заходу, 4 мутації, виявлені у пацієнтів із болезнью.

Гоше, є у нормі в псевдогене. Це 2 мажорні мутации — L444P і IVS2+1 і ще 2 миссенс мутації в 10-му экзоне.

(A456P і V460V). Таке подібність безсумнівно свідчить про фундаментальну роль псевдогена освіти мутацій в.

GBA-гене. У той самий час саме собою присутність псевдогена перестав бути мутагенным чинником, якщо сам ген та її псевдоген локалізовано у різних хромосомах, як, наприклад, у разі генів GM2A і FUCA1, псевдогены яких у хромосомі 3 й області 2q31-q32, соответственно.

Для двох лизосомных хвороб — фукозидоза і синдрома.

Гурлера, мажорными є нонсенс мутації. Понад те, при фукосидозе всі відомі на сьогодні мутації приводят до повній відсутності продукту FUCA1-гена. Так, поруч із мажорній мутацією Q351X, представленої у 20% хромосом в хворих фукосидозом, описані ще чотирьох нонсенс мутації і 4 справіции зі зсувом рамки зчитування. При синдромі Гурлера дві мажорні нонсенс мутації - W402X і Q70X, становлять около.

50% всіх відомих мутантних алелів гена IDUA. З іншого боку, у своїй захворюванні зареєстровані ще чотирьох мінорні за частотою нонсенс мутації і одну делеция зі зсувом рамки считывания. 3 миссенс мутації і интронная мутація, створює дополнителный сайт сплайсингу в гені IDUA, не призводять до підлогуному блоку синтезу идуронидазы і як реалізуються як синдрома.

Шейе. До речі, що обидві захворювання — синдром Гурлера і синдром Шейе, є класичний приклад фенотипического розмаїття, обумовленого існуванням аллельных серій (см. Главу IV). Такий спектр вкрай важких мутацій не можна пояснити лише підвищеної частотою їх возникновения. Більш імовірним представляється те, що кодируемые FUCA1- і IDUA-генами білки виявляють определенну опірність невеликим ушкодженням і зберігають функціональну активність за певних амінокислотних заміни, тобто миссенс аллели у тих генах проявляються як нейтральні мутації і призводять до розвитку заболеваний.

Відомо, що поширення мутацій в популяциях визначається як, не стільки підвищеної частотого виникнення, але багатьма іншими популяционно-генетическими чинниками й у першу чергу, пов’язані з ефектом засновника (см. Главу V). Типовим наслідком ефекту основателя, як відомо, служить наявність різних мажорних за частотою мутацій однієї й тієї ж гена у пацієнтів різних изолятов і етнічних груп. Така картина спостерігається, зокрема, при ганглиозидозе GMI. Так було в Японії мажорными у своїй захворюванні є миссенс мутації I51T і R201C, тоді як у Європі переважають мутації R482H і W273L. Эффектому засновника можна пояснити високу частоту аспартилглюкозаминурии у Фінляндії, позаяк у 98% випадків у пацієнтів фінського походження захворювання зумовлено присутністю одному й тому ж миссенс мутації C163S, різко зменшує активность аспартилглюкозаминидазы. Цікаво зазначити, що ця мутація в хворих перебуває у сильному нерівноважному зчепленні з іншого миссенс мутацією в AGA-гене — R161Q, являющейся, своєю чергою, на рідкісну форму поліморфізму. Невозможна, проте, виключити можливість комбінованого влияния цих двох мутацій на фенотип.

Яскраві приклади етнічних відмінностей частоті і спектру мажорних мутацій виявляються під час аналізу таких лизосомных болезней накопичення як хвороба Тея-Сакса, Ниманна-Пика і болезнь Гоше. Насамперед, перебіг цих захворювань особливо распростпоранені серед євреїв-ашкеназі, серед що вони зустрічаються вдесятеро частіше, ніж у сусідніх популяціях європейського чи азійського походження. Наявність специфічних мажорних мутаций всім трьох захворювань у 70 — 95% всіх пацієнтів єврейського походження швидше за все не можна пояснити тольдо ефектом засновника. Генетичний дрейф, селективне премайно гетерозигот, характер міграції, соціальні й религиозные особливості, що зумовлюють ассортативность образования подружніх пар — ось тих чинників, які, у всій відимости, лежать у цих відмінностей. У цьому интересно відзначити, що з пацієнтів інших національностей мажорні мутації гомологичных генів, зазвичай, інші, ніж в євреїв-ашкеназі. Так, хвороба Ниманна-Пика типу B часто зустрічається серед його жителів країн, розміщених у західній частині Північної Африки. Проте, в 80% випадків захворювання пов’язані з делецией R608 в SMPD1-гене, яка є мажорній серед евреев-ашкенази.

Приклад лизосомных хвороб може бути добре простежені кореляції між типами мутацій і клінічними особливостями захворювань. Вище згадувалося про аллельных варіантах гена IDUA, призводять або до синдрому Гурлера, чибо до синдрому Шейе. Різні миссенс мутації в гені NAGA приводять до хвороби Шіндлера або до хвороби Канзаки (Табл.

10.1.). Важливе значення для аналізу молекулярних основ патогенезу захворювань мають специфічні мутації з пізньої феєнотипической маніфестацією (звані дорослі формы).

Такі мутації виявлено у генах при болезнях Тея-Сакса і галактосиалидозе. Дуже цікавий випадок різного фенотипического прояви на різному расовому генетческом тлі одному й тому ж мутації - мажорній 16-кб справіции, виявленої у 27% пацієнтів із дитячої формою болезни.

Зандхоффа (McInnes et al., 1992; Sidransky et al., 1994). Зокрема, лише у франко-канадской сім'ї ця мутація хто їмпаунде з миссенс мутацією P417L, описаної вперше у Японії в пацієнта з підліткової формою захворювання, провлялась як доросла форма з м’якою течією заболевания.

Нерідко вдалося проаналізувати молекулярну природу спільного впливу двох алелів одного гена на феєнотип. Приміром, при деяких форм метахроматической лейкодистрофии труднощі молекулярної діагностики захворювання пов’язані з существованем, з так званого, псевдодефицитного аллеля ARSA-гена. Цей поліморфний аллель є у популяциях з досить високої частотою, отже гомозиготы у ній состаляют 1 — 2% від населення. Виявилося, що псевдодефицитный аллель представляє з себе поєднання двох мутацій в цис-положении. Один із них — 3 «-кінцева ругуляуторована мутація у першому сайті після стоп кодона, змінює сигнал полиаденилирования. Інша — миссенс мутація в 6-му экзоне, призводить до втрати сайту N-гликозилирования. Принагідно зауважимо, що з гена ARSA (як і для IDUA-гена) обготівковувружен альтернативний сплайсинг, у результаті якого в фибробластах й печінки утворюються 2 різних типи мРНК, размером 2.1 кб і 3.9 кб, відповідно. У гомозигот по псевдодефіцитному аллелю в фибробластах відсутня 2.1 кб мРНК, у своїй клінічних проявів захворювань не наблюдается.

Проте, за наявності S96 °F мутації в ARSA-гене і натомість псевдодефіцитного аллеля розвивається важка форма лейкодистрофии.

Наприкінці розділу коротко розглянемо стан проблемы генокоррекции лизосомных захворювань. У літературі відсутні повідомлення про успішні клінічні випробування програм генотерапевтического лікування цих захворювань, однако, по крайнього заходу, декому лизосомных хвороб такиє програми вже розроблено й затверджено (см. Главу IX,.

Табл.9.2). Є дані позитивні результати таких досліджень на культурах мутантних клітин та на модельных тварин. Так було в дослідах in vitro було здійснено успешный ретровирусный перенесення нормальної кДНК гена GBA в культурах мутантних фібробластів (Sorge et al., 1987) й у культурах клітин крові пацієнтів із хворобою Гоше (Fink et al., 1990), у результаті було досягнуто корекція глюкоцереброзидазной активності. Така сама корекція метаболическоих дефектов при хвороби Ниманна-Пика і за синдромі Хантера було досягнуто шляхом введення на відповідні мутантні лінії клітин нормальних кДНК генів SMPD1 і IDS відповідно. У цьому активність идуронат-2-сульфатазы після ретровирусной трансдукції in vitro виявилася значно вищий нормальною і рекомбинантный фермент брав активну участь в метаболізмі глюкозамногликанов. Генокоррекция первинного біохімічного дефекта при мукополисахаридозе YII (синдром Слая) була получена як in vitro, шляхом ретровирусного перенесення нормального гена GUSB в мутантні фибробласты людини, і in vivo на собак і мишах. У цьому в хворих собак нормальний белок.

(бета-глюкуронидаза) як экспрессировался, але появлялся в лизосомах і відновлював процессинг специфічних глюкозоаминогликанов (Wolf et al., 1990). Запровадження цього ж гена (GUSB) в мутантні власні стовбурні клітини мишей зумовлювало тривалої експресії бета-глюкуронидазы, зниження лизосомального накопичення у печінці і мозку часткової корекції хвороби у трансгенних тварин (Wolf et al., 1992). У другому експерименті GUBS-кДНК вводили в культивовані мутантні фибробласты шкіри мишей і далі трансдуцированные клітини имплантировали підшкірно мутантным мишам. В усіх тварин наблюдали експресію введеного гена і повний зникнення чизосомальных відкладень у печінці й у мозку (Sly, 1993). Полученные результати підтверджують принципову можливість лікування, по крайнього заходу, деяких лизосомных хвороб з допомогою методів генної терапии.

Розділ 10.3. Хвороби експансії, викликані «динамічноми «мутациями.

Виявлений 1991 р. новим типом про динамических мутацій і з ними спадкові захворювання частково розглядалися нами в Главі IV. Проте їх уникальность, незвичний механізм експресії, особливості наследования, швидке зростання нозологій, обумовлених подібними нарушениями в послідовності ДНК, як і виявилося, досить широка поширеність (см. Табл.9.2) роблять целесообразным їх понад докладний анализ.

Як згадувалося, цей тип мутацій поки знайдено тільки в чоловіки й незареєстрований в жодного виду ссавців чи інших добре вивчених організмів (дрозофіла, нематоди тощо.). Суть мутацій залежить від наростання числа триплетных повторів, розміщених у регуляторної чи яка кодує, отже, і в транслюється частини генів. Вперше такий тип мутації виявили при молекулярному аналізі синдрому фрагильной (ламкою) Х-хромосомы, спадкова передача которій не підпорядковувалася звичайним менделевским законам. У дальньоїшем аналогочные динамічні мутації були описані і за 7 інших спадкових захворюваннях, контрольованих генами, розташованими різними хромосомах — Таблиця 10.2. Разом про те, все наведені нижче нозології випливає низка загальних признаков, дозволяють объеденить в одну самостійну группу. Насамперед, для триплетных повторів, експансія яких блокує функцію гена, характерний виражений популяційний поліморфізм, причому число алелів може варіювати від единиць за кілька десятків. Інший їх особливістю є домінантний тип наслідування, характерний як Х-сцепленных генів, так генів, що є на аутосомах. Особенностью практично всіх хвороб «експансії «є й ефект антиципації (очікування), зміст якої заключается в наростання тяжкості симптомів захворювання на підущих поколіннях, що, як з’ясувалося, є наслідком накопления («експансії «) вихідного числа триплетов коли їх кількість возрстает більше нормального. Характерними тих нозологій є й особливо їх передачі потомству: декому захворювань типова передача по матіринской (Fra-X, миотоническая дистрофія), а інших — переважно за лінією (хорея Гентингтона).

Практично всім «динамічних «мутацій характерно часжение мозку і особливо підкіркових структур, приніж тяжкість захворювання та її початок чітко корелюють із кількістю повторів. Молекулярний аналіз цих генів дозволяє припускати певне подібність механізму експансії триплетів, яка, цілком імовірно, відбувається у митозе, зачіпає частіше аллели з начально великою кількістю повторів, у своїй нерідко сигналом експансії є втрата негомологічного триплета, гаразд разделяюего ланцюжок монотонних повторів. Разом про те, патогенетичні механізми проявления мутацій експансії принципово різні. Що стосується разособистих варіантів FRAX мутацій спостерігається блок експресії відповідних генів внаслідок стабільного метилування області CpG острівця в промоторной частини генів. При миотонической дистрофії порушення експресії, очевидно пов’язані з помилками взаимодествия транскрибируемой нитки ДНК з нуклеосомами. Що стосується інших суто нейродегенеративних заболеваний (хорея Гентингтона, спинально-бульбарная м’язова атрофия та інших.) експресія гена не порушена, проте, утворющийся білковий продукт з незвичайно довгою полиглутаминовой ланцюжком якимось чином порушує процеси нормального метаболизма нервових клітин підкіркових відділів мозга.

Отже, причиною повреждающего дії одних.

" динамічних «мутацій є блок генної експресії, тобто втрата функції (loss-of-function mutation), тоді як інші мутації тієї самої типу, пов’язані з нейродегенративными захворюваннями, ведуть до появи білкових продуктів із анвмальными функціями (мутації типуgain-of-function). Интересно відзначити, крім динамічних мутацій кожному за названого гена виявлено поодинокі точковые мутації, кількість яких украй невелика. Для кожної хвороби «експансії «разработан свій варіант діагностики, заснований на ПЛР. Амплификация області триплетных повторів і подальший электрофоретический аналіз синтезованих продуктів дозволяє опреділити число повторів, тобто провести генотипирование авплекай. Разом про те, при числі повторів більш 200, амплификация з допомогою ПЛР звичайно досягається. У таких випадках розміри ділянки повторів визначаються методом блот-гибридизации з відповідними ДНК зондами. Наприклад, використовуються зонди StB12.3, Ох1.9 чи Ой 0.55 у разі синдрому FRAXA; зонд cDNA25 у разі миотонической дистрофии.

Детальніше з цим цікавою групою захворювань можна ознайомитися у низці оглядів (Willems, 1994; Баранов і др., 1993; Иллариошкин та інших., 1995).

Таблиця 10.2. Хвороби експансії, викликані динамічними мутациями.

———————————-T—————-T———-T——-T———T———T—————— ————— Хвороба, номер по ¦ Ген, лока-¦Триплет¦Норма¦Прему-¦Мута- ¦Литература.

¦ МакКьюсику (MIM) ¦ лизация ¦ ¦ ¦тація ¦ция ¦

¦ ———————————-+—————-+———-+——-+———+———+—————— —————+ Синдром ламкою X-хро- ¦FMR1, FRAXA¦(CGG)n ¦5−50 ¦50−90 ¦>90 ¦Rousseau et al., 1991 ¦ мосомы; 309 550¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Hirst et al., 1991 ¦ ———————————-+—————-+———-+——-+———+———+—————— —————+ Синдром ламкою X-хро- ¦FMR2, FRAXE¦(CGG)n ¦6−25 ¦25−200¦>200 ¦Knight et al., 1994 ¦ мосомы тип 2; 309 548¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ———————————-+—————-+———-+——-+———+———+—————— —————+ Миотоническая дистро- ¦DM, MP-1 ¦(CTG)n ¦5−10 ¦19−30 ¦>30 ¦Shelbourne et al., 1992¦ фия; 160 900¦19q13.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Wieringa, 1994 ¦ ———————————-+—————-+———-+——-+———+———+—————— —————+ Хорея Гентингтона; ¦HD, IT-15 ¦(CAG)n ¦6−37 ¦ ¦37- 121¦Huntington «p.s Dis. ¦

143 100¦4p16.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Collab.Res.Group, 1993 ¦ ———————————-+—————-+———-+——-+———+———+—————— —————+ Спинально-мозжечковая ¦SCA1 ¦(CAG)n ¦6−39 ¦ ¦41−81 ¦Orr et al., 1993 ¦ атаксия тип 1; 164 400¦6p21.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Chung et al., 1993 ¦ ———————————-+—————-+———-+——-+———+———+—————— —————+ Денто-рубральная-палли-¦DRPLA, B-37¦(CAG)n ¦7−34 ¦ ¦54−75 ¦ Koide et al., 1994 ¦ до-люисовая дегенерация¦12pter-p12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Nagafuchi et al., 1994¦

125 370¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ———————————-+—————-+———-+——-+———+———+—————— —————+ Спинально-бульбарная ¦AR ¦(CAG)n ¦12−33¦ ¦40−62 ¦La Spada et al., 1991 ¦ м’язова атрофия;313 200¦Xq11-q12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ———————————-+—————-+———-+——-+———+———+—————— —————+ Спинально-мозжечковая ¦MJD ¦(CAG)n ¦13−36¦ ¦68−79 ¦Kawaguchi et al., 1994 ¦ дегенерація Мачадо- ¦14q32.1 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ Джозефа ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ———————————-+—————-+———-+——-+———+———+—————— —————;

Розділ 10.4. Моногенные спадкові хвороби, диагностируемые молекулярними методами в России.

Зведення, подана у таблиці 10.3, складена виходячи з аналізу робіт основних вітчизняних лабораторій і публікацій, що з проблемою молекулярної діагностики спадкових хвороб. Зведення перестав бути вичерпної і включає переважно ті захворювання котрим можлива або вже проводиться діагностика на внутрішньоутробних стадіях розвитку (Баранов, 1994).

Таблиця 10.3. Моногенные спадкові хвороби, диагностируемые молекулярними методами і пропонує доступні пренатальної диагностике в России.

——-T—————————————————-T—————————.

¦N пп¦ Хвороби ¦Медичні центры¦

+——+—————————————————-+—————————+.

¦1 ¦ Муковісцидоз ¦ИАГ;ИЭМ РЦМГ; ТИМГ¦

¦2 ¦ Миодистрофия Дюшенна/Беккера ¦ИАГ;РЦМГ; ТИМГ ¦

¦3 ¦ Гемофілія, А ¦ИАГ; ДНЦ; ¦

¦4 ¦ Гемофілія У ¦ИАГ; ДНЦ ¦

¦5 ¦ Фенілкетонурія ¦ИАГ; ГНЦ;ПМА;РЦМГ ¦

¦6 ¦ Синдром ламкою Х-хромосомы ¦ИАГ; ¦

¦7 ¦ Миотоническая дистрофія ¦ИАГ ¦

¦8 ¦ Хвороба Виллебранда ¦ИАГ;ГНЦ ¦

¦9 ¦ Хорея Гентингтона ¦ИАГ; РЦМГ; НИИН ¦

¦10 ¦ Хвороба Леш-Нихана ¦ИАГ ¦

¦11 ¦ Спинально-бульбарная м’язова ¦ИАГ; НИИН ¦

¦ ¦ атрофія ¦ ¦

¦12 ¦ Гепато-лентикулярная дегенерація ¦РЦМГ; ИАГ ¦

¦13 ¦ Хвороба Хантера ¦ИАГ ¦

¦14 ¦ Адрено-генитальный синдром ¦ЦОЗМиР; РЦМГ ¦

¦15 ¦ Атаксия Фридрейха ¦ДНЦ ¦

¦16 ¦ вТалассемия ¦ДНЦ; ПМА ¦

¦17 ¦ Хвороба Верднига-Гоффмана ¦РЦМГ ¦

¦18 ¦ Дефіцит альфа-1-антитрипсина ¦ИЭМ ¦

¦19 ¦ Сімейна гіперхолестеринемія ¦ИЭМ; ПМА ¦

¦20 ¦ Схильність до інсулін- ¦ПМА ¦

¦ ¦ залежному діабету ¦ ¦

¦21 ¦ Дефіцит ацил-СоА дегидрогеназы ¦ПМА ¦

L——+—————————————————-+—————————;

ИАГ — Інститут Акушерства і Гінекології РАМН, Санкт Петербург.

ИЭМ — Інститут Експериментальної Медицини РАМН, Санкт Петербург.

ПМА — Педіатрична Медична Академія, Санкт Петербург.

РЦМГРосійський Центр Медцинской Генетики РАМН, Москва.

ДНЦ — Гематалогический Науковий Центр МОЗ РФ, Москва.

ТИМГТомський Інститут Медичної Генетики, Томск.

НИИННауково-дослідний Інститут Неврології РАМН, Москва.

ЦОЗМиРЦентр Охорони Здоров’я Матері і Дитину, Москва.

Молекулярні характеристики деяких із які у таблиці захворювань вже було розглянуто в розділах 10.1 и.

10.2. Окремі аспекти, що стосуються ідентифікації соответстующих генів, їх картирования, клонування і сканирования мутацій вже згадувалися як приклади при изложенді відповідних вступних глав монографії (см. Главы II,.

III, IV, V). У цій частині вважаємо за доцільне підсумовувати ці розрізнені відома і охарактеризувати ті найчастіші, соціально значимі моногенные захворювання, проти яких ми нагромаджено досить великий власний досвід молекулярних досліджень. Список цих алезологий, їх частоти й освоєно основні молекулярні характеристики наведені у Таблиці 10.4.

Таблиця 10.4. Основні молекулярно-генетические характеристики моногенных хвороб, діагностованих в Лабораторії пренатальної діагностики ИАГ.

РАМН, Санкт-Петербург.

(примітки наприкінці таблиці самі, що у Табл.10.1).

——————————-T———————T———————————-T———————- ————- Синдроми 1), номер по¦Встречаемость,¦Типы і кількість му- ¦Литература.

¦ МакКьюсику; хромосом-¦белок, ¦таций 4), мажорні мута¦(локализация і структура¦ ная локалізація; ген ¦розміри в ами-¦циив дужках вказані ¦генов, клонирование кДНК,¦ 2), размеры 3), экзоны¦нокислотах ¦частоти алелів у б-ных¦идентификация мутацій). ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Муковісцидоз; врожден¦1:2500- Европа¦Точковые-преобладающие;¦Rommens et al., 1989 ¦ ное відсутність vas de¦1:3800 -Россия¦небольшие дел. и дупл.; ¦Kerem et al., 1989 ¦ ferens, ¦CF-трансмемб- ¦Мажорные:delF508−30−90%¦Riordan et al., 1989 ¦ 219 700; 7q31.2 ¦ранный регуля-¦W1272X-2−33%, 3732delA -¦Горбунова і ін., 1991 ¦ CFTR.500; 260кб, 27экз¦тор 1480¦4%, 394delTT, G542X, R117H¦Баранов та інших., 1995 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Міопатія Дюшенна; Бек¦1:3500 мальчи-¦Делеции довгі - ¦Kunkel et al., 1985 ¦ кера;кардиомиопатия ¦ков ¦60%; дуплікації - 6−7%;¦Kunkel et al., 1986 ¦ делеционная, ¦ ¦делеции кількох зв. -¦Koenig et al., 1988 ¦ 310 200; Xp21.2 ¦Дистрофин ¦7; нонсенс — 9; сплайс.¦Roberts et al., 1992a;b ¦ DMD.21; 2000кб, 73экз ¦ 3685¦-3; миссенс -1; инс.-1 ¦Ahn et al., 1993 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Гемофілія А, ¦1:6500 мальч. ¦Делеции прим. — 31; мис-¦Wood et al, 1984 ¦ чинника YIII деф.; ¦Чинник YIII ¦сенс — 21; нонсенс -8 ¦Toole et al., 1984 ¦ 306 700; Xq28 ¦свертываемости¦Мажорные: інверсія 26 -¦Higuchi et al., 1991 ¦ F8C.66; 186 кб, 26экз¦крови 2351¦25 экзонов — 45% сімей ¦Naylor et al., 1993 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Гемофілія B, Кристма-¦1:20 000 мальч.¦Миссенс і нонсенс более¦Kurachi et al., 1982 ¦ са, чинника IX деф.; ¦Чинник IX ¦60%; сплайс.-10%; регу-¦Jagadeeswaran et al, 1984¦ 306 900, Xq27.1-q27.2 ¦свертываемости¦лят.- 3.5%; делециидо¦Green et al., 1991 ¦ F9.400; 34 кб, 8 прим ¦крові 461¦40% під час тяжких формах ¦Giannelli et al., 1993 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ фон Виллебранда бо- ¦1: 5 — 20 000 ¦Тип I і II-миссенс; Ма-¦Lynch et al., 1985 ¦ лезнь, ¦Чинник Y111R ¦жорные:R543W, R545C, V553¦Bonthorn et al., 1986 ¦ 193 400; 12pter-p12 ¦свертываемости¦M, R578Q. Тип III-делеции¦Cooney et al., 1991 ¦ F8VWF.22; 178кб, 52экз¦крови ¦1 н. в 28экз; нонсенс -4¦Randi et al., 1991 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Фенілкетонурія; гипер¦1: 10 -15 000¦Миссенс -62%; нонсенс -¦Guttler, Woo, 1986 ¦ фенилаланинемия, мяг-¦Фенилаланин- ¦13%;сплайс.-13%;делеций¦DiLella et al., 1986 ¦ кая, 261 600; 12q24.1¦гидроксилаза ¦9%; Мажорні: IVS12+1, ¦Cotton, 1990.

¦ PAH.70; 90 кб, 13 прим¦ 452¦R408W, R261Q, R158Q, IVS10¦Барановская і ін. 1995 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Леш-Нихана синдром; ¦ ¦Миссенс -53%;небольшие ¦Jolly et al., 1983 ¦ HPRT-родств. подагра,¦Гипоксантин- ¦структ.перестройки -40%¦Edwards et al., 1990 ¦ 308 000; Xq26-q27.2 ¦фосфорибозил ¦сплайс. -5%; нонсенс-2%¦Rossiter et al., 1991 ¦ HPRT.100; 44 кб, 9 экз¦трансфераза217¦Мажорные: R170TER (15%)¦Sculley et al., 1992 ¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-+ Гепато-лентикулярная ¦ ¦Миссенс -15; делеции/ ¦Bull et al., 1993 ¦ дегенерація Вільсона-¦ ¦инсерция -14;Мажорные -¦Petruchin et al., 1993 ¦ Коновалова, ¦Медь-транспор-¦H714Q — 31% і в Америці, ¦Tanzi et al., 1993 ¦ 277 900; 13q14.3-q21.1¦тирующая АТФа ¦22% у Росії; 1 зв. дел.¦Thomas et al., 1995 ¦ ATP7B.34; ¦за P типу 1434¦H1070Gl-28%;Gl1267L 10%¦

¦ ——————————-+———————+———————————-+———————- ————-;

Багатьом із які у Табл.9.4 захворювань присвячені докладні огляди, керівництва та монографії, які включають поруч із клінічними даними спеціальні розділи, присвяченийные молекулярної природі патологічного процесу, характеристике гена, його мутацій, їх фенотипических проявів, а як і останнім досягненням і перспектив участі лікування, включаючи генну терапію. Деякі з цих публікацій вже були упомянути попередні роки розділах книжки, інші будуть процитовані у підрозділах цієї глави. Слід як і згадати, що це наведені нозології були першими моногенними хворобами, хто був досліджені молекулярними методами нашій країні й у яких, у результаті, були разработаны і оптимізовані з урахуванням перебігу етнічних та національних особливостей аллельного поліморфізму, частот і паттерна мутаций оптимальні схеми молекулярної обстеження сімей великий ризик з єдиною метою пренатальної діагностику і виявлення гетерозиготного носительства. Практично всі ці исследования проводились рамках основних наукових програм ДКНТ «Геном Людини «і «Пріоритетні напрями генетики ». Огляд вітчизняних робіт з молекулярної діагностиці наследственных хвороб представлено ряді наукових зведень (Баранов,.

1992; 1994; Baranov, 1993; Баранов та інших., 1994; Евграфов,.

1993).

10.4.1 Муковисцидоз.

Муковісцидоз (пухирний фиброз підшлункової залози) — найпоширеніше моногенне спадкове захворювання в представників білої раси. Це перше «генна «хвороба, молекулярні основи якої визначені методами позиційного клонування без використання будь-яких даних про структурных перебудовах у сфері локалізації гаданого гена.

Нагадаємо, що виявлення пацієнтів із транслокациями або великими делециями, затрагивающими досліджуваний ген, значительно полегшує його картування й ідентифікації, як це було при міопатії Дюшенна, ретинобластоме чи хронічному грануломатозе. У сфері локалізації гена муковісцидозу хромосомные перебудови, немає. Докладно історію відкриття гена, його структуру, клонуванні, аналізі функцій, ідентифікації мутацій можна ознайомитися в ідущих вітчизняних роботах (Гембицкая, Баранов, 1991; Барановий, Гинтер, 1994).

Білковий продукт генатрансмембранный регуляторний белок муковісцидозуТРБМ (cystic fibrosis transmembrane regulatorCFTR), як з’ясувалося, є білком хлорных каналов, регулюючих обмін іонів хлору через апикальные мембрани всіх епітеліальних клітин організму. Залежно від типу мутацій, їх локалізації функція гена ТРБМ при муковисцидозе можна повністю чи частково нарушенной.

На початку 1995 р. в гені ТРБМ ідентифіковано більш 500 мутацій, кілька делеций і дуплікацій. Наболее распространенной жителі Західної Європи й Америки є мутація delF508, яка веде до отстутсвию фенілаланіну в 508 становищі білка ЕРМБ. У цих країнах частота delF508 находится не більше 70−85%. У Європі частота мутації обнаруживает певний градієнт поширення із півночі на південь і із Заходу Схід, досягаючи 85% у Данії зменшується до.

50% Італії і по 20−30% у Туреччині. У Європейської части.

Росії її становить близько 50% всіх мутантних (CF) хромосом. У євреїв-ашкеназі доминируюшей за частотою є мутація W1282X (33%).

Біохімічний аналіз клітин пацієнтів, хворих муковисцидозом, дозволив з’ясувати фенотипічні особливості експресії мутантних алелів гена ТРБМ, встановити определенний градієнт патологічних порушень на мембранном, клеточному та організменному рівнях залежно від типу мутации, її локалізації і структури аномального білкового продукта (Баранов, Гинтер, 1994). І так було встановлено, що ніякі CFTRмутації, зокрема і delF508, не перешкоджаючи трансляції, порушують процессинг білка тож він не достигает апикальной мембрани і створює хлорный потік. Цим пояснюється важка клініка муковісцидозу при подібних нарушениях (Sheppard et al., 1993). Інші мутації (R117H, R334W і R347P), виявлені за більш м’яких формах захворювання, не зачіпають процесингу білка, хлорный канал формується, але функціонує менш ефективно, ніж у нормі. Зіставлення процесингу, локалізації і функціонування білка в 3-х чиниях L-клеток, трансдуцированных нормальним CFTR-геном і двома його аллельными варіантами, показало, що дефект одній з мажорних мутацій — G551D, пов’язані з часткової інактивацією функції хлорного каналу, тоді як delF508, як оказалось, має комбінованим ефектом — порушує локализацию і стабільність білка знижує ефективність його функционирования як хлорого каналу (Yang et al., 1993).

Цікаво, що мутація R117H в гомозиготном стані, частіше у компаунде коїться з іншими аллелями, зокрема з delF508, обготівковувруживается у пацієнтів із уродженим відсутністю семявыводящих канальцев (vas deferens). У цьому клініка муковісцидозу таким пацієнтів, зазвичай, відсутня або дуже стерта. Це один із прикладів фенотипического розмаїття, обумовленого аллельными сериями.

Нині у Росії доступні ідентифікації наявністю відомих мутацій близько 65% хворих муковисцидозом.

(Иващенко, 1992; Потапова, 1994). Діагностична цінність основних мажорних мутацій у порядку спаду їх частоти следующая delF508 (50%), 3732delA (4,3%), W1282X (2,4%),.

394delTT (2,1%); G542X (2,0%) (Іващенко, 1992). Cогласно нашим даним (Баранов, 1994) молекулярна діагностика муковисцидоза прямими методами можлива приблизно 55 -60% семей. Що стосується непрямий діагностики використовуються полиморфные сайти локусів ДНК, які працюють у безпосередньої близости.

(IRP, D7S8, D7S23, MET) чи усередині її самої гена CFTR — минисателлитные послідовності в интронах 6, 8, 17b гена.

СFTR (Zielenski et al., 1991; Morral et al., 1991; Chehab et al., 1991; Агбангла та інших., 1992; Potapova et al., 1994). За відсутності мажорних мутацій і інформативності по полиморфным сайтах молекулярні дослідження може бути доповнені биохимическим аналізом амниотической рідини утримання ферментів мікроворсинок кишечника плоду (Гобунова і др., 1989;

Баранов і др., 1991).

Методами спрямованого мутагенезу (gene targeting див. Главу VIII) у різних лабораторія навіть Великобританії здійснено успішне конструювання трансгенних моделей муковісцидозу на мишах (Clarke, et al., 1992; Colledge et al., 1992; Dorin et al., 1992; Snouwaert et al., 1992). Вияснены ознаки й деякі міжвидові відмінності прояви мутації гена CFTR у мишей та якості людини. Показано, що різні мутації цього гена по-різному реалізуються в фенотипе СFTR дефіцитних мишей. Так було в одній з трансгенних ліній зазначено переважне поржаение легких, в інших — підшлункової залози та кишечнику. У одній мутантной лінії спостерігається загибель значної частини зародків від причин, сходных з мекониальным илеусом. Отже, ці лінії є ідеальні моделі на дослідження молекулярных основ патогенезу муковісцидозу, і навіть для разработкі та політичні випробування терапевтичних заходів, включаючи генотерапию. Як у попередньої главі, програми генотерапии муковісцидозу реалізуються по крайнього заходу о 7-й центрах навіть двох центрах Західної Європи (Великобританія и.

Франція). Вже успішно здійснено як апробації генноинженерных конструкцій на мутантних культурах клітин та моділових тварин, але розпочато й успішно проводяться клінічних досліджень генотерапевтического лікування муковісцидозу на 70 пацієнтів. Дослідження з генотерапії муковісцидозу, начатые нашій країні поки що проводяться лише на рівні клітинних лантухтур.

10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.

Миодистрофия Дюшенна — сцепленная зі статтю м’язова дистрофія; виділяють дві клінічні форми: важку — міодистрофію Дюшенна (МД) й більш м’яку — миодистрофию.

Беккера (МБ). Ген міодистрофії Дюшенна (DMD) — одне із найбільш великих відомих генів людини, кодує білок дистрофин, входить до складу сарколеммы м’язового волокна. При МД дистрофин або цілком відсутня, або деградує невдовзі після синтезу. При формі Беккера, зазвичай, дистрофин присутній, хоча у зміненому, переважно у скороченому состоянии.

Відповідно до сучасними уявленнями (Ahn,.

Kunkel, 1993) величезний DMD-ген перебуває під медичним наглядом сложіншої системи регуляції транскрипції і сплайсингу. По крайнього заходу, 5 незалежних промоторів здійснюють альтернативну специфічну транскрипцію перших экзонов у різних тканинах і різними стадіях ембріонального розвитку. 3 промотора экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофіну, тоді як 2 осущесвляют експресію останніх доменів взаимоисключающим способом. Високо консервативні послідовності 6- і экзонов, які кодують C-конец білка, альтернативно сплайсируются, створюючи кілька структурно різняться форм дистрофіну, здійснюють різні функції. Так, идентифицирована 6.5-кб мРНК, транскрибируемая з DMD-гена і являющееся, очевидно, його основним продуктом в не-мышечных тканях, включаючи мозок (Bar et al.,.1990). Відповідний білок істотно відрізняється від дистрофіну та її рівень у некоторых не-мышечных тканинах можна з кількістю дистрофіну в м’язах. Описано також 4.8-кб транскрипт тієї самої локусу, экспрессирующийся у багатьох типах тканин, але в.

Шванновских клітинах проводить нервової системи, де сам дистрофин відсутня (Blake et al., 1992). Цей білок підлозічил назва апо-дистрофин-1. Клонирован і секвенирован іще одна 2.2-кб транскрипт DMD-гена, який кодує аподистрофин-3, экспрессирующийся в пізньому эмбриогенезе (Tinsley et al., 1993).

У 60% випадків гені DMD в хворих хлопчиків обнаруживаются довгі делеции, захоплюючі від однієї за кілька сусідніх экзонов і сосредоточеные, зазвичай, в двух.

" гарячих «районах — у сфері 5 «-кінця гена (экзоны 6−19) й у 3 «- кінці (экзоны 40−53), у своїй 30% делеций локализованы в проксимальній частини гена і 70% - в дистальной. Проксимальные делеции виникають, очевидно, в ранньому эмбриогенезе і мають більше шансів самі стати «сімейними «мутациями.

Дистальные делеции виникають згодом і частіше зустрічаються, як ізольовані випадки. Вважається, що у спорадичних випадках повторний ризик народження хвору дитину при проксимальній делеции становить 30%, тоді як із дистальной — лише 4%.

(Passos-Bueno et al., 1992).

Відзначено популяційні особливості паттерна делеций у різних європейських популяціях, соціальній та популяціях Росії та країн СНД (Baranov et al., 1993). В окремих пацієнтів делетирован весь ген, але досить довгі сусідні області. Найчастіше кінці делеций локалізовано у частині дистрофинового гена. Так було в интроне 44, протяжністю 160−180 кб, містяться близько 30% точок разрыва всіх делеций. Показано, що проксимальний кінець одній з делеций в интроне 43 розташований всередині транспозон-подобного елемента, належить THE-1 сімейству ретротранспозонов (Pizzuti et al., 1992). Описано іще одна пацієнт, у доторого делеция закінчується в THE-1 елементі. Ці елементи, розміром 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными LTR, заговорили українською уторены близько 20 000 разів у геномі людини. Гіпотеза нестабильности DMD-гена, викликана присутністю транспозон-подобного елемента, залучається також і обьяснения кількох випадків виявлення відмінностей у молекулярному дефекті у пациентов, що належать одному й тому ж родоводу, тобто мають мутацію загального походження (Miciak et al., 1992). В.

2-х випадках дуплікацій з 8, котрим було проведено сиквенс кінцевих ділянок, показано присутність Alu-элементов.

У більшості інших 6 випадках рекомбінація здійснювалася між негомологичными послідовностями (Hu, Worton, 1992).

Прямий кореляції між вагою течії захворювання і протяжністю делеции не відзначається, але різницю між формами Дюшенна і Беккера, у випадку, пов’язані з наявністю чи відсутністю зсуву рамки зчитування. Ген дистрофіну может бути він втягнутий й у інші структурні зміни — дуплікації, транслокации. Так, приблизно 5% мутацій гена дистрофіну становлять дуплікації і майже 35%-точечные мутации, переважно, микроделеции (від 1 за кілька нуклеотидов), і навіть нонсенс мутації. Щодо великий відсоток нонсенс мутацій в гені дистрофіну пов’язують із присутністю великої кількості глютаминовых триплетов, мутации у якому часто призводять до утворення стоп-кодона.

Вкрай рідкісні миссенс мутації. Вважається, що у 30% сімей с.

МД і МБ мутації спонтанного походження і виникають претамущественно в оогенезе, у решті сім'ях це наследственные формы.

Розроблено вельми ефективні методи діагностики справіций в DMD-гене, засновані на мультиплексной ПЛР. Одновременное тестування 18 экзонов + промоторной частини гена позволяет виявити до 98% всіх великих делеций гена (Baranov et al., 1993). Для виявлення гетерозиготного носительства делеций використовується метод RT PCR, тобто ізоляція эктопической DMD-мРНК з клітин крові, зворотна транскрипція, амплификация кДНК, рестрикционный аналіз стану та секвенирование.

(Roberts et al., 1991). З цією самі цілі застосовується метод імунодетекції мутантного білка в білковому лизате м’язів і гістологічних зрізах біоптатів м’язів (Arahata et al., 1989). За відсутності ідентифікованої делеции застосовують непрямий метод ДНК-діагностики з допомогою внутригенных поліморфних сайтів: pERT87−8/Taq1; pERT87−15/BamH1;

124/Pst1;16intron/ Taq1, і аллельных варіантів динуклеотидных СА повторів в интронах 49 і 50 — STR-49; STR-50 (Малюкува та інших., 1991; 1992; Євграфов, Макаров, 1987; Євграфов та інших., 1990).

Серйозну проблему для діагностики гетерозиготного носительства і, отже, для медико-генетичного консультування предствляют випадки, з так званого, гонадного мозаицизма — присутність у соматичних клітинах гонад женщины-неносительницы мутацій гена дистрофіну, що, своєю чергою, призводить до появи кількох генерацій (клонів) статевих клітин (ооцитов) з мутанынм і нормальним генами дистрофіну. Передбачається, такі мутації можуть метушнікать на рівні первинних статевих клітин, цебто в ранних стадіях внутрішньоутробного розвитку майбутньої матері. По оріентировочным оцінкам приблизно 6−7% всіх спорадичних случитиївши є результатом гонадного мозаицизма в. Оценитку величину аберрантного клона ооцитов мало можна. У зв’язку з цим прогноз стосовно здоров’я наступного дитини на сім'ях, у яких в хворого МД вдається визначити гетерозиготное носительсту, дуже ускладнений. Емпірично визначено, що з наличии спорадичного випадку народження дитину поруч із МД за відсутності прямих молекулярних доказів гетерозиготного носительства мутації гена дистрофіну в ризик повторного народження хвору дитину може становити 14% (Essen et al., 1992).

В багатьох пацієнтів із міопатію Дюшенна при иммуногистохімічному окрашивании м’язів виявляються рідкісні дистрофин-положительные волокна. Проте, під час використання антитіл з антигенними детермінантами, кодируемыми делетированным ділянкою гена, фарбування немає і це дозволяє відвергнуть гіпотезу соматичного мозаицизма. Найбільш вероятный механізм такого явища — виникнення другий соматической делеции в м’язових клітинах, устраняющей зрушення рамки зчитування, викликаний основний делецией. Через війну мутантный ген може транскрибуватися із заснуванням стабильного, хоч і аномального дистрофіну (Klein et al., 1992).

Є модельна лінія мишей з миодистрофией Дюшенна — mdx. Ця модель отримали внаслідок відбору мутації, спонтанно яка виникла у C57BL/10 лінії (Bulfield et al.,.

1984). У м’язах й у мозку мишей лінії можна знайти різко знижене кількість Dmd-мРНК, проте дистрофин підлогуностью відсутня. Попри це, ніяких видимих клинических аномалій у mdx-мышей не спостерігаються. Ідентифіковано нонсенс мутація в mdx-гене, у яких у мишей транслюється лише 27% дистрофинового полипептида. Обнаружена також сплайсинговая мутація, яка веде до вирізання экзона майже 7 DMD-гена у собак (Sharp et al., 1992).

У серії експериментів на mdx-мышах доведено принципиальная можливість генокоррекции МД. Поява дистрофіну людини у сарколемме м’язових волокон mdx-мышей спостерігали після введення ретровірусних чи аденовирусных генноинженерных конструкцій, містять полноразмерную кДНК гена дистрофіна (14 кб) або його делетированную, але функціонально активную форму, так званий мини-ген (6.3 кб) (Wells et al.,.

1992; Cox et al., 1993; Aсsadi et al., 1995). Після всерединівенного запровадження фрагментів Dmd-гена у складі рекомбинантного аденовируса спостерігали тривале присутність экзогенной.

ДНК в кістякових і якості серцевих м’язах животных.

(Srataford-Perricaudet et al., 1992). Попри ці очевизначні успіхи, проблема генно-інженерної корекції МД ще таклека від своєї рішення. До цього часу ведуться жваві дебати дослідників перспективність генної терапії МД по сравнению з клітинної терапією (пересадка здорових ембріональних миобластов). Поки що затверджена жодна програми клинических випробувань генотерапевтического підходу МД (см. Главу.

IX). Основна складність проблеми генокоррекции — необходимость забезпечення системи ефективної доставки гена дистрофіна в миофибриллы як кістякових м’язів, але, що особливийале важливо — в м’язи серця й діафрагми. У 1995 р. дослідження з генотерапії МД розпочато у межах програми Геном чоловіки й з нашого стране.

10.4.3 Гемофілія А.

Гемофілія, А — зчеплене із соціальною статтю захворювання, викликане спадковим дефектом чинника VIII, найважливішого ланки у системі згортання крові (cм. Табл. 10.4). Комплекс фактора.

YIII з молекулярным вагою 1 мільйон складається з 2-х компонентів. Головний компонент — YIIIC, кодується геном.

F8C, локалізованим в Ікс-хромосомі. З YIIIC нековалентно связан чинник Виллебранда — YIIIR, кодирующийся аутосомным геном. Чинник Виллебранда стабілізує чинник VIII і регулирует його активность.

Ген F8C — однією з дуже великих генів людини; содержит 26 экзонов (розміром від 69 до 3106 нуклеотидів). Загальна довжина интронов соствляет 177 кб; близько 20% цієї ДНК приходится на интрон 22 (32.4 кб). мРНК гена F8С розміром 9 009 нуклеотидів включає 5 «нетранслируемую последовательность.

(150 п.о.), 3 «нетранслируемую послідовність (1 806 п.о.) і який кодує фрагмент (7053 п.о.). Усередині гена F8 в интроне 22 локалізовано решта 2 інших структурних гена невідомої природи — F8А і F8 В, було виявлено методами молекулярний аналіз. Ген F8A, повністю локалізований в інтроні 22 гена F8C, зовсім позбавлений интронов і транскрибується у бік, протилежному чиннику VIII (3 «-5 »). Перший экзон гена F8B також лежить у интороне 22, а такі нього розподілені до экзонов 23−26; транскрибується він у тому самому напрямі, як і ген F8C (5 «-3 »). Обидва гена экспрессируются переважають у всіх тканинах (Levinson et al., 1990;

Freije, Schlessinger, 1992; Lakich et al., 1993). Интрон 22 виявився незвичним у тому відношенні, що містить CpG-островок з відривом близько 20 кб від экзона 22 — припустительное місце локалізації бинаправленного промотора для геновий F8A і F8B. Виявилося, що за приблизно 500 кб в розмірі 5- «напрямі від гена F8 є ще 2 транскрибируемые копії гена F8A (Lakich et al., 1993).

Під час процесингу первинного білкового продукту гена.

F8C від вихідного пептида з 2 351 амінокислотних залишку відщепляется послідовність в 335 амінокислотних залишку. У плазмі крові чинник VIII існує у вигляді металлозависимого гетеродимера, що складається з С-концевой легкої ланцюга (80 кБ) и.

N-концевой важкої ланцюга (200 кБ). Половина всіх хворих на на гемофілію A немає чинника VIII, 5%- мають нормальне доличество нефункционирующего білка та інших випадках активность білка збережена, та його кількість різко снижено.

(McGinnis et al., 1993).

Ізольовані випадки гемофілії A становлять 30%; 70% - сімейні варіанти. Показано, що мутації в гені F8 творяться у сперматогенезе в 3 — 5 раз частіше, ніж у оогенезе (Rosendaal et al., 1990; Brocker-Vriends et al., 1991). Це означає, що у 80−86% спорадичних випадків матері є носіями мутації, яка виникла у зародкових клітинах їх батька. З іншого боку, близько 14% матерів, які є носіями мутації, може бути соматичними чи гонадными мозаїками, отже ймовірність повторного народження хвору дитину вони також повышена.

Близько 10% всіх ідентифікованих мутацій в гені F8 являются делециями однієї чи кількох суміжних экзонов. Прирозмірено 5% всіх мутацій становлять короткі делеции і дупликации гена, інші мутації - точковые заміни (Antonarakis et al., 1995). Майже половину миссенс мутацій идентифицирована в домені A2. Показано, що 35% всіх відомих мутацій локализовано в CpG динуклеотидах, причому понад 90% їх є C-T чи G-A транзиции (Cooper,.

Youssoufian, 1988). Такі мутації в які кодують районах зустрічаються в 42 разу частіше, чому це можна було б очікувати виходячи з випадкового характеру мутагенезу. Для основної маси мутацій гена F8C характерно практично повну відсутність «гарячих «точок: кожна родина великий ризик по гемофілії А має власну власну мутацію. Винятком є група виявлених порівняно недавно протяженных інверсій интрона 22, захоплюючих экзоны 1−22 й підлоганостью блокуючих функцію гена. Такі інверсії, як оказалось, є у 45% родин зі на важку форму гемофілії А.

(Lakich et a., 1993). Причиною інверсій у цій галузі гена є гомологичная рекомбінація між ідентичними післядовательностями гена F8А, що за интроне 22.

F8C-гена, та інші копіями цього ж гена, находящимися з відривом 500 кб від 5 «кінця гена F8 (см.выше).

Крім інверсій і точкових мутацій в гені ФVIII світанкугистрированы відомі випадки инсерционного мутагенезу, що з переміщенням в геномі транспазонподобных элементов типу LINE (див. Главу II). У двох пацієнтів неродственного походження було ідентифіковано инсертированный в екзоні 14 F8C-гена довгий елемент LINE-1 (L1) (Kazazian et al., 1988). У обох сім'ях що це мутації de novo. L1 послідовності є специфічне для генома людини сімейство довгих, розміром від 2 до запланованих 4 кб, заговорили українською уторяющихся елементів, розподілених за всі хромосомам і перебуває, приблизно, зі ста 000 копій. Було показано що оба.

L1 елемента, инсертированные в F8C-ген, близькі ретротранспозону, локалізованому на хромосомі 22 (Dombroski et al., 1991). У третій сім'ї инсертированный в интроне 10.

F8C-гена L1 елемент ні пов’язані з хворобою. Усі 3 L1 елімента мали відкриті рамки зчитування, а відповідні реконструируемые амінокислотні послідовності були високо ідентичні одна одній з рівнем гомології, перевищують 98%.

Отже, отримано ще одні непрямі подтверждения існування низки функціональних L1 елементів, кодующих 1 чи кілька білків, необхідні їх ретротранспозиции.

Пряма діагностика протяжних інверсій в гені F8 осуществляется шляхом блот-гибридизации з ДНК зондом р482.6 з наступної рестрикцией эндонуклеазами Bcl1, Dra1, Nco1.

(Lakich et al., 1993). У інших випадках, через відсутність мажорних мутацій в гені F8C, найчастіше використовують непрямі методи молекулярної діагностики. З допомогою ПЛР аналізують полиморфные динуклеотидные СА-повторы экзона 13, HindIII полиморфизм в интроне 19; HbaI поліморфізм в интроне 22 і «позагенний поліморфізм локусу DXS52 (St14/TaqI) (Асєєв і др.,.

1989; Aseev et al., 1994; Сурін та інших., 1990).

З огляду на наявність функціонально активної форми білка чинника VIII в плазмі крові генноинженерые підходи до терапії цього захворювання спрямовані отримання в чистому вигляді підлогуноценного білкового продукту (замісна терапія), або запровадження у організм хворого відповідної кДНК, які забезпечують синтез ФVIII та її вступ у кров. Осуществленное 10 років тому вони виділення і клонування кДНК цього гена зробило реальним обидві ці підходу. Є повідомлення про набуття трансгенних тварин (кіз), в геном яких запроваджено ген чинника VIII. Вони можна використовувати як продуценти повноцінного білкового продукту. Генна терапія цього заболевания перебуває в стадії експериментальних разработок.

(см. Главу IX). Успішно здійснена трансдукция фібробластів людини in vitro з допомогою ретровирусного вектора. Основна проблема у напрямі залежить від виборі эффективного промотора і доборі клітин, у яких експресія гена можна було досить тривалої. Нині знайдено невирусные промотори, щоб забезпечити ефективну і длительную експресію гена чинника VIII in vivo. Як возможных клеток-мишеней використовують м’язові клітини, фибробласты, гепатоцити і клітини ендотелію судин. У 1994 р. методом направленного мутагенезу (см. Главу VIII) отримані трансгенні моделі гемофілії На мишах. Є підстави вважати, що клінічних досліджень генокоррекции цього захворювання почнутся вже у найближчому будущем.

10.4.4 Гемофілія B.

Гемоофилия B — зчеплене зі статтю захворювання, викликанийное спадковим дефектом чинника IX — важливого компонента середньої фази внутрішнього каскаду згортання крові. Белок.

(чинник IX) — гликопротеин, складається з 415 амінокислотних залишків, об'єднаних у вісім доменів, синтезується як молекулы-предшественника клітинами печінки. У плазмі крові фактор IX перебуває у вигляді гетеродимера, що складається з 2-х полипептидных ланцюгів — легкої (L) важкою (H), ковалентно пов’язаних між собою одним дисульфидным містком. Чинник IX циркулює як неактивного зимогена до того часу, доки станеться протеолитическое вивільнення його активирующего пептида, що дозволяє йому прийняти конформацию активної сериновой протеази. Його роль згортання крові пов’язані з активацией чинника X у вигляді взаємодій з іонами кальция, фосфолипидами мембрани і чинником VIII.

Ген чинника IX транскрибується в гепатоцитах з образованием мРНК розміром 1 383 п.о. Для гена F9 характерна высокая частота виникнення мутацій — 4.1*10!6 за поколение.

Так само як і за гемофілії A мутації значно частіше метушнікают в сперматогенезе, ніж у оогенезе (Montandon et al., 1992). Вважається, що можливість отримання мутації від батька 11 разів більше, ніж від. Це означає, що у злированном разі ймовірність гетерозиготного носительства мутації в составвляет більш 80%. Виявлено чітка кореляція між віком батька і ймовірністю отримання від цього нової мутації в гені F9. Так, середній вік батька момент народження дочки — носительки нової мутації, складляет близько 42 років (King et al., 1992).

До 1994 р ідентифіковано близько 400 мутацій в гені гемофилии B. Переважна більшість їх заміни нуклеотидов, що призводять до замінам амінокислот або до освіті стоп-кодонов. Характерно, практично, повну відсутність вираженных мажорних мутацій і домінуючих областей підвищеної частоти мутування. Одна тільки мутація — I397T, встретилася о 7-й самьях. Близько 42% точкових мутацій виникає у CpG динуклеотидах (Bottema et al., 1993). Показано, що частота.

G-A чи C-T транзиций в CpG cайтах в 24 разу вищу, ніж у сусідніх місцях гена (Koeberl et al., 1990). З іншого боку, в CpG динуклеотидах гена F9 в 7.7 раз частіше виникають трансверсии.

(A-T, A-C, G-T чи G-C). Це обьясняется тим, що содержание.

(G+C) в які кодують областях F9-гена становить 40% (Bottema et al., 1991).

У 40% випадків під час тяжких, ингибиторных формах гемофилии У у пацієнтів виявляються делеции різної протяженности. Близько 10% точковых мутацій локалізовано в донорних чи акцепторных сайтах сплайсингу чи створюють нові сайти сплайсингу всередині интронов. У одній сім'ї руйнація гена в результаті инсерции Alu-элемента в экзон 5.

(Vidaud et al., 1993). Описано 13 точковых мутацій в промоуторованої області гена F9. Саме з цими мутаціями связана.

Лейденовская (Leyden) форма захворювання, коли він до візросту половозрелости настає поліпшення багатьох клінічних показників і зокрема, зникає кровоточащий диатез.

Обьясняется це тим, що мутації в промоторной області не можуть спричинить переключенню конститувною експресії гена на стероид-гармон-зависимую, порушуючи зв’язування гепатоцитарного ядерного чинника 4 (HNF-4), належав до суперсемейству транскрипционных чинників для рецепторів стероидных гормонов.

Гемофілія B була як модель розробки стратегії генетичного консультування при моногенных заболеваниях, які мають вираженої мутаційної гетерогенностью (Giannelli et al., 1992). Основою такий стратегії является складання національних баз даних молекулярних дефектов і специфічних методів їх діагностики. Зокрема, виходячи з такої інформації, автори провели характеристику мутацій групи з 170 неродинних індивідуумів з на гемофілію B шведського і англійського походження і тільки одного разі не вдалося ідентифікувати мутацию.

Молекулярна діагностика гемофілії У проводиться як непрямими і прямими методами. Непряма діагностика основану на аналізі методом ПЛР внутригенных поліморфних сайтов:

Taq1 (вагітною 11 109−11 113); инсерционного поліморфізму в интроне, А (рестриктазы Hinf1 і Dde1); Taq1 в интроне F вагітною 72. Метод ПДРФ аналізу інформативний лише у.

60−70% всіх родин зі на гемофілію У (Aseev et al., 1994; Сурін та інших., 1994). Пряма діагностика гемофілії У включає амплификацию геномних фрагментів гена чинника IX із наступною детекцией помилок комплементации методом mismatch detection.

(см. Главу IV) і пряме секвенування продуктів амплификации.

(Montadont et al.1990).

Порівняно невеликі розміри гена, присутність белкового генопродукта в сироватці крові й наявність природних біологічних моделей сприяли швидкому прогресу досліджень з генотерапія гемофілії У, що у час вже включено до програми клінічних випробувань. Успешная трансдукция і корекція генетичного дефекту отримана в дослідах in vitro і in vivo на різних модельних системах (Culver, 1994; Gerrard et al., 1993). Так, при введении полноразмерной кДНК у складі ретровирусного вектора в первинні культури кератиноцитів людини спостерігали експресію F9 і секрецію біологічно активного чинника IX.

Після трансплантації цих трансдуцированных клітин nu/nu мишам людський чинник ІХ ст невелику кількість з’являвся в кроветоке і зберігався там протягом тижня (Gerrard et al., 1993). На собак, котрі страждають на гемофілію B, здійснена трансдукция гепатоцитів in vivo шляхом прямий инфузии рекомбинантного ретровирусного вектора в портальную вену. У цьому спостерігали стійку експресію чинника ІХ ст впродовж понад 5 місяців, і поліпшення біохімічних показників свертываемости крові (Kay et al., 1993). Є повідомлення про успішної корекції гемофілії У побував у Китаї 1992 р. Двом хворим хлопчакам шкіру спини трансплантували культуру аутологичных фібробластів, попередньо трансдуцированных ex vivo рекомбінантною кДНК гена FVIII. Попри певний скептицизм щодо оцінки цього досягнення із боку специааркушів, немає сумнівів у цьому, що успішна генотерапія гемофилии У — подія найближчого будущего.

10.4.5 Хвороба Виллебранда.

Хвороба Виллебрандааутосомно-доминантное (при некоторых формах рецессивное) захворювання, обумовлене спадковим дефіцитом білка VIIIR, родинного фактору.

VIIIС згортання крові (см. Гемофилия А) та відомого, як головний чинник фон Виллебранда. Цей великий гликопротеин синтезируется клітинами ендотелію, у яких специфічна YIIIR-мРНК становить 0.3%, і надходить у кров як двох мультимеров з молекулярними вагами від 850 кБ до 20 мільйонів дальтон.

Чинник VIIIR здійснює взаємодія між стінкою ссудов і тромбоцитами, регулюючи їх адгезію у місцях повреждения ендотелію. Чинник VIIIR бере участь й у регуляції сінтеза і секреції чинника YIIIC і стабілізує комплекс фактору VIII.

Розрізняють 7 типів хвороби Виллебранда — I, IIA-IIE и.

III (Zimmerman, Ruggeri, 1987). При типі I знижена концентрація всіх мультимеров в плазмі, та їх якість не нарушено.

Генетично цій формі захворювання підрозділяється на рецессивные і домінантні варіанти. Типи IIC і III — рецессивны. Тип II характеризується якісними аномаліями фактора.

VIIIR, выражающимися у зменшенні здібності формувати великі мультимеры, (типи IIA і IIC) чи збільшенні скорости їх виведення з плазми (тип IIB).

Ген F8VWF досить протяжний і складається з 52 экзонов, розмірами від 40 до 1379 п.о. (Mancuso et al., 1989). Величина интронов варіює у величезних межах (від 100 до 20 000 пар нуклеотидів). Сигнальний пептид і пропептид кодуються першими 17 экзонами, тоді як зріла субьединица.

VIIIRчинника і трьох «нетранслируемая область — іншими 35 экзонами. Усередині гена ідентифіковані повторювані післядовательности, включаючи 14 Alu-элементов і поліморфний TCTA повтор близько 670 п.о. в интроне 40. Райони гени, які кодують гомологичные домени, мають подібну структуру. На хромосомі 22q11-q13 виявлено псевдоген довжиною 21−29 кб, відповідний экзонам 23−34 F8VWF-гена (Mancuso et al.,.

1991). Ідентифіковані у ньому сплайсинговые і нонсенс мутации перешкоджають освіті функціонального транскрипта.

Найбільше мутацій ідентифіковано при типі II хвороби Виллебранда. Переважна більшість їх — заміни амінокислот, найчастіше які у результаті транзиций в CpG динуклеотидах (Cooney et al., 1991; Randi et al.,.

1991; Donner et al., 1992). Мутації при хвороби типу IIA кластерированы в A2 домені, де може бути локалізований сайт протеолетического відщіплення, тоді, як із типе.

IIB — в домені, які забезпечують взаємодію Космосу з тромбоцитарным гликопротеиновым комплексом (Ib-IX рецептором). Велика група мутацій при формі захворювання IIB локалізована в пєгменте з одинадцяти амінокислот всередині єдиного дисульфидного вигину (loop), поєднує цистеины в 509 і 695 положениях.

При формі захворювання Нормандського типу, мимикриющей гемофилію A, чинник Виллебранда структурно і функціонально нормальон, за исключеним те, що порушено його взаємодію Космосу з чинником YIII. Таких пацієнтів справді идентифицируются миссенс мутації, які працюють у області гена, кодующей сайти зв’язування чинника VIIIR чинник VIIIС.

(Mazurier, 1992).

Тип III є найбільш важку форму заболевания, при которй чинник VIIIR, зазвичай, отсутствует.

Отримано докази, такі пацієнти є гомозиготами чи компаундами по нонсенс мутацій, обнаруживаемым лише у дозі в хворих типу I (Zhang et al., 1992). У цьому ж типі захворювання виявлено кластер мутацій зі зсувом рамки зчитування, возникаюших внаслідок делеции однієї з 6 цітозинов вагітною 2679−2684 экзона 18. Саме таке мутация було виявлено у ній, зареєстрованою вперше фон.

Виллебрандом в 1926 року. В окремих членів цієї родословіншої як було встановлено недавно, вона в компаунде з мутацією P1266L, яка виникла у результаті рекомбінації між геном F8VWF і псевдогеном (див. вище) (Zhang et al., 1993).

Вибір адекватного методу молекулярної діагностики болезни Виллебранда значною мірою визначається правильностью попередньої клінічної і лабораторної диагностики і результатами медико-генетичного консультирования, що дозволяє досить чітко визначити характер наследования захворювання на сім'ї великий ризик і час виявляють його форму. На жаль, домогтися цього які завжди можливо, а відсутність характерних мажорних мутацій значно снижает ефективність прямий молекулярної діагностики. Разом про те, по крайнього заходу, у деяких популяцій (Фінляндія, Швіция) виявлено «гарячі «точки мутацій, якими є экзоны 18 і 42, при типі II хвороби Виллебранда (Holmberg et al, 1993). У популяціях Росії такі «гарячі «точки доки виявлено, хоча дослідження, у цьому напрямі ведутся.

(Асєєв, Шауи Абдельрхани, 1995). Значно більш перспективной на етапі представляється непряма диагностика. У промоторной частини гена, в интронах.

15, 17, 23, 40, 41, 49, соціальній та экзонах 26, 35, 39 идентифицированы численні полиморфные сайти рестрикції з досить високою рівнем поліморфізму. Особливо перспективным для діагностики є поліморфізм интрона.

40, являє собою дві області варьирующих за кількістю тетрамерных повторів ТСТА з відривом 212 п.о. Амплификация цієї маленької частини интрона 4О з допомогою ПЛР, рестрикция AluI з наступним электрофоретическим поділом дозволяє ідентифицировать до 98 аллельных варіантів цього полиморфизма.

(Mercter et al., 1991). Настільки виражений поліморфізм позволяет із високим ефективністю маркувати мутантную хромосому.

(ген) і простежити її передачу в потомстве.

Відомості про генокоррекции хвороби Виллебранда в доступіншої літературі не обнаружены.

10.4.6 Фенилкетонурия.

Фенілкетонурія (ФКУ) — одне з найбільш частих аутосомно-рецессивных захворювань, обумовлених спадковим дефектом фенилаланингидроксилазы, що призводить за відсутності своєчасної терапії до важкої розумової відсталості. У Європе одне болюче дитина є у середньому серед 10 ;

17 000 новонароджених. У Ірландії і Шотландії частота ФКУ сягає 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).

Поширена ФКУ й у Польщі й у Білорусі. У Росії її частота захворювання коливається не більше 1: 8 — 10 000.

Дуже важлива рання діагностика ФКУ, бо за своевременном призначенні пацієнтові дієти, не що містить фенилаланин, розумова обмеженість, зазвичай, не розвивається чи має дуже стерті форми. Розроблено біохімічні скринирующие тести діагностики ФКУ у новорожденных.

Гидроксилирование фенілаланіну досить складним процесом, у якому беруть участь, по крайнього заходу, 3 ферменту. Фенилаланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фермент, що з субодиниць з молекулярным вагою 52 кБ, продукується клітинами печінці та регулює перетворення L-фенилаланина в L-тирозин. Його дефіцит призводить до накопичення фенілаланіну в сироватці крові. Гиперфенилаланинемия може постати також за дефіциті дигидроптеридинредуктазы і за дефектах синтезу биоптерина. Проте, перебіг цих захворювань, хоч і супроводжуються зниженням активності РАН, значно отличаются від класичної ФКУ і коррегируются дієтою, позбавленої фенилаланина.

PAH-ген транскрибується в гепатоцитах із заснуванням мРНК розміром 2.4 кб. Найпоширеніший тип мутаций.

— однонуклеотдные заміни (миссенс, нонсенс, мутації в сайтах сплайсингу), причому ці мутації результат транзиций в 22-х виявлених у PAH-гене CpG динуклеотидах.

Великих структурних перебудов не знайдено, хоча є невеликий відсоток точкових делеций. Зазначається нерівномірний характер внутригенной локалізації мутацій (Scriver et al., 1989). Так, найбільше миссенс мутацій є у центральній частині гена: в экзоне 7, кодирующем ділянку зв’язування білка з кофактором, де располжено 5 CpG дуплітов, соціальній та экзонах 9 та дванадцяти. Переважний район локализации делеций — экзоны 1, 2 і 3.

Втури РАН-гена локализованоно понад десять поліморфних сайтов рестрикції, причому розподілу гаплотипов за цими маркерам серед представниками різних рас і етнічних груп значно різняться. Виявлено сильне нерівновага по сцеплению між певними мутаціями в PAH-гене і гаплотипами по внутригенным сайтах рестрикції. Так, кожна гілка 5-и найчастіших у розвинених європейських популяціях мутацій ассоциировану лише з однією з більш, ніж 70 гаплотипов по 8 рестрикционным полиморфизмам (Eisensmith et al., 1992). Мажорна в західно-європейських популяціях сплайсинговая мутація в донорном сайті 12-го интрона зчеплена з гаплотипом 3 (DiLella et al., 1986). У той самий час інша мутація в экзоне 12 ;

R408W, найпоширеніша Сході Європи, в частийности у Білорусі й Росії, і знайдений Японії Кітає, пов’язані з гаплотипом 2 (DiLella et al., 1987). Мажорна в.

Європі мутація R158Q у 50% зчеплена з гаплотипом 4, найбільш частим серед його жителів Японії та Китаю. Поширена в Турции сплайсинговая мутація в интроне 10, яка веде к.

9-и-нуклеотидной инсерции, асоціюється з «південними «гаплотипами 6, 10 і 36.

Зіставлення частот різних гаплотипов по полиморфным сайтах рестрикції і мутацій в PAH-гене у різних популяциях, національностей і етнічних групах дозволяє зробити висновок, що з них, або навіть всі, сталися вже після дивергенції рас. Поширення мажорних мутацій гена.

РАН у різних популяціях і етнічних групах пов’язані з ефектом засновника. За деякими оцінками ці мутації візникнули одноразово від кількох основних сотень за кілька тисяч літ тому. Проте, часом розподіл мутацій може бути обьяснено в генетичних термінах, порівнянні з демографічної історією. Безсумнівно доведеними є приклади незалежного та рекуррентного виникнення у різних популяціях таких мутацій, як R261Q чи R158Q. Високі поповіляционные частоти специфічних мутацій в PAH-гене пов’язані, очевидно, лише з ефектом засновника і/або з существованием ендогенних механізмів підвищеного мутагенезу, але й перевагою гетерозигот. Висловлено припущення, що носійство РАН — мутацій підвищує стійкість організму до токсическому ефекту охратоксина А, продуцируемого некоторыми видами грибковою цвілі (Aspergillus, Penicillium), развивающимися при зберіганні збіжжя і інших продуктов.

(Woolf, 1986). Передбачається, що вагітним жінкам, ґетерозиготные пл РАНмутацій мають меншу ймовірність аборта, індукованого дією цих мікотоксинів. Можливо, висока частота ФКУ в Ірландії і Шотландії частково то, можливо обьяснена м’яким і вологим кліматом цих країн, сприятливому зростанню таких грибов.

У медичному практиці використовують як пряма, і непряма діагностика мутацій в PAH-гене. Розроблено дуже швидке й ефективний метод ПЦР/StyI-диагностики cамой частої у Росії (понад 70 відсотків%) мутації R408W (Ivaschenko,.

Baranov, 1993; Іващенко та інших., 1993). Дигностика інших маложорных мутацій в PAH-гене здійснюється методами ПЦР+АСО, аллель-специфической амплификации (ARMS), методом однонитевого конформационного поліморфізму (SSCP) (див. Главу IY).

При первинному обстеженні сім'ї черезвычайно зручно использовать три полиморфные нейтральні мутації в кодонах 232,.

245 і 385, зчеплені в Кавказьких популяціях з визначеніми ПДРФ-гаплотипами, отже, і зі специфічними мутантними аллелями. Кожна з цих мутацій створює новий сайт рестрикции і тому їх аллельное стан то, можливо легко протипировано з допомогою амплификации і рестрикції (Kalaydjieva et al., 1991). При аналізі сім'ї, у якій відсутні легко идентифицируемые прямими методами мутації, молекулярна діагностика може бути з допомогою внутригенных полиморфных сайтів рестрикції. Зручний, зокрема, Msp1-полиморфизм в 8-му экзоне, аналіз якої може бути здійснено методом ПЦР/рестрикции (Wedmeyer et al., 1993). Останнім часом з’явилися даные про наявність высокополиморфных сайтів всередині интронов гена РАН, які опинилися особливо зручніми для молекулярного маркірування мутантних алелів (Goltzov et al.1994).

Генокоррекция ФКУ успішно було здійснено у дослідах in vitro й у час перебуває в стадії экспериментальной розробки (Табл.9.2. Глава IX).

10.4.7 Синдром Леш-Нихана.

Синдром Леш-Нихана — рецессивное зчеплене із соціальною статтю заболевание, обумовлене спадкової недостатністю гіпоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) і сопровождающееся важкими ураженнями центральної нервової системы.

Фермент HPRT бере участь у регуляції метаболізму пуринов, контролюючи перетворення гуанина і инозина на відповідні рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессируется переважають у всіх типах клеструм із заснуванням мРНК розміром 654 п.о. Культивовані лінії клітин, дефектні по HPRT, стійкі до 8-азагуанину и.

6-тиогуанину, отже, можуть забрати на соответствующих селективних середовищах. Гетерозиготные носії мутаций по HPRT-гену може бути легко виявлено наявністю 2-х типів клітин — стійких і чутливих до 8-азагуанину, в первинної культурі фібробластів чи клітинах волосяних луковиц. У багатьох мутантних клітинних ліній кількість мРНК нормально, а білок відсутня. У частини пацієнтів хоч і транскрибується досить багато мРНК, але у цих молекулах виявляються структурні і функціональні аномалії. У невеличкому відсоток випадків в хворих вдається виявити ні білка, ні мРНК.

У 15% хромосом в хворих з синдромом Леш Нихана ген.

HPRT втягнутий у великі структурні зміни, корторые можуть бути встановлені методами Саузерн чи Нозерн блот-гибридизации. Синдром Леш Нихана одне з перших моногенных спадкових захворювань, котрим було проведено молікулярная ідентифікація точкових мутантних алелів. На цієї моделе уперше був в розроблено й випробуваний метод аналізу мутацій, заснований на розщепленні РНК-ДНК гібридів рибонуклеазой На місцях негомологичноно спарювання (метод розщепівления рибонуклеазой, А — см. Главу VI, Gibbs, Caskey, 1987).

Комбінація методів блот-гибридизации і розщеплення рибонуклеазой, А дає змоги виявити до 50% мутацій. Нині в гені HPRT знайдено понад сто спорадичних мутацій, половиу яких — однонуклеотидные заміни типу миссенс, нонсенс й у сайтах сплайсингу. Близько 40% мутантних хромосом мають структурні аномалії, зокрема великі делеции, нестачі окремих зкзонов і микроделеции однієї чи кількох нуклеотидов. У HPRT-гене, немає мутації, домининирующие за частотою у літак якихось популяціях. Винятком є нонсенс мутація R170TER, що становить около.

15% всіх нуклеотидних замін (Gibbs et al., 1989). Так само як і за гемофилиях мутації гена HPRT частіше творяться у сперматогенезе, ніж у оогенезе. Можливість мутування зростає віком батька. Ідентифіковано 3 HPRT-псевдогена в хромосомах 3, 5 і одинадцять (Stout, Caskey, 1984).

Описано поодинокі випадки синдрому Леш Нихана у гетерозиготных дівчаток. У цьому, зазвичай, хвороба розвивається внаслідок невипадковою інактивації X-хромосомы, не утримуючищей мутації (Ogasawara et al., 1989). Проте, у 3-х жінок — облигатных носительок мутацій в HPRT-гене, селективний тест не виявив присутності мутантних клітин на культивованих фибробластах і волосяних луковицах. У зв’язку з цим висловлено припущення, що існують певні мутації гена HPRT перебувають у нерівноважному зчепленні з неідентифікованою летальної мутацією в Ікс-хромосомі, що призводить до селекції клона клеструм тільки з одного (мутантной чи немутантной по гену HPRT).

X-хромосомой (Marcus et al., 1992).

Молекулярна діагностика хвороби Леш-Нихана можлива прямими і непрямими методами. Прямий варіант грунтується на провіданні зворотної транскрипції мРНК, її амплификации,.

SSCP-анализе одноцепочечных ДНК фрагментів зі своїми наступним секвенированием (см. Глава VI). Непряма діагностика предусматривает маркірування мутантной хромосоми з допомогою полиморфных сайтів (зокрема, локусу DXS52 — зонд.

St14/TaqI).

Як ми вже відзначали (Глави VII, VIII), перша трансгенная тваринна модель спадкового захворювання людини, сконструйована шляхом спрямованого перенесення мутациий в культивовані ембріональні власні стовбурні клітини, отримали для синдрому Леш-Нихана (Hooper et al., 1987; Kuehn et al.,.

1987). І на цій моделе уперше було проведена генокоррекция спадкового дефекту in vivo. Ці успіхи у значною мірою пов’язані з тривалим існуванням селективних середовищ, дозволяющих вести автоматичний відбір мутантних клітин. Взагалі, синдром Леш-Нихана є ідеальну систему як з вивчення пуринового метаболізму, але й рішення багатьох теоретичних питань біології і медицины.

(Seegmiller, 1989; Maraus et al., 1993; Boyel et al., 1993).

Складність генокоррекции захворювання, проте, залежить від необхідність забезпечення ефективної доставки гена HPRT.

(або його кДНК) у мутантні нервові клеткі. Проблема ще вирішена. Тому реальні клінічні програми генотерапії цього захворювання на сегоднешний день відсутні (см. Главу IX).

10.4.8 Хвороба Вильсона-Коновалова.

Хвороба Вильсона-Коновалова (БВК) — гепатолентикулярная дегенерація — аутосомно-рецессивное захворювання, обумовленийное спадковим дефектом одній з медь-транспортирующих.

АТФаз. У хворих різко знижена концентрація основного медь-содержащего білка плазми крові - церулоплазміну й у меншою мірою — цитохромоксидазы, чергового білка, участвующего в метаболізмі міді. Вирізняють, по крайнього заходу, 3 форми БВК (Cox et al., 1972). При рідкісної атипової формі, може бути Німецького походження, у гетерозигот зміст церулоплазміну снижено, по крайнього заходу, вдвічі. При двох інших, типових формах — слов’янської і ювенильной, зміст церулоплазміну у гетерозигот у межах норми. Слов’янський тип БВК характеризується порівняйтельно пізнім початком й переважно неврологічної симптоматикою. Ювенильная форма частіше є у Западной.

Європі і які ведуть у етіології захворювання є печеночные порушення. Серед євреїв-ашкеназі зустрічається БВК з поздним початком і майже нормальним змістом церулоплазміну в сироватці крові больных.

Ген БВК, ідентифікований в 1993 р. незалежно відразу в.

2х лабораторіях США, є медь-транспортирующую АТФазу P типу з 6-ту металл-связывающими районами. Ген має 60% гомологию по нуклеотидному складу з раніше идентифицированным геном АТФ-азы (АТР7А), мутантном при болезни.

Менкеса (Bull et al., 1993; Petruchin et al., 1993; Tanzi et al., 1993). За аналогією з геном хвороби Менкеса, також зумовленої порушенням транспорту міді, ген БВК назван.

АТР7 В. Два пацієнта з БВК виявилися гомозиготными по 7-нуклеотидной делеции в яка кодує області гена ATP7B, що доказывало його ідентичність гену БВК (Petruchin et al, 1993).

Ген экспрессируется у клітинах печінки, мозку, нирках, лимфовузлах. Типовим для експресії АТР7 В виявився альтернативний сплайсинг двох і більше экзонов центральній частині гена.

(6, 7, 8, 12 і 13).

Кодируемый ATP7B-геном білок містить кілька мембранных доменів, АТФ-консенсусную послідовність, сайт фосфорилювання і з крайнього заходу, 2 медь-связывающих сайта. У мозку, печінки, нирках та ломфоузлах виявлено изоформы білка, відповідні продуктам альтернативного сплайсингу гена АТР7 В. Їх призначення та функції поки неизвесты. У гене.

АТР7 В ідентифіковані полиморфные микросателлитные маркери, і навіть близько 20 поліморфних сайтів рестрикції. Нині в гені АТР7 В ідентифіковані понад 34 мутацій, зокрема 14 дрібних делеций/инсерций, 2 — нонсенс мутації, 15 — миссенс мутацій, 3 — сплайсинговые мутації. Діагностичну цінність для європейців представляють мутації His1070Gln и.

Gly1267Lys, зарегистрованные в 28% і десяти% всіх мутантних хромосом, відповідно (Thomas et al., 1995).

Наприкінці даного розділу представляється целесообрізним коротко розглянути інші досить часті моногенные захворювання, котрим показано й проводиться молекулярная діагностика, зокрема і пренатальна, за іншими медико-генетических центрах же Росії та, передусім, в Лаборатории молекулярної діагностики Институтата клінічної генітики РАМН (Москва).

10.4.9 Адрено-генитальный синдром.

Адрено-генитальный синдром — (вроджений дефицит.

21-гидроксилазы) — досить поширене аутосомно-рецессивное захворювання. Частота «класичних «форм 1:10 000 новоржденных, «некласичної «- близько 1% в популяції. У зависимости від характеру порушення функції гена і, соответственно клінічних проявів «класична форма «підразделляется на два варіанта: 1. летальна сольтеряющая формало; 2. нелетальная — вирилизирующая форма, пов’язана з збытком андрогенів (Morel, Miller, 1991).

У локусі 6р21.3, всередині складного супергенетического комплексу HLA ідентифіковані два тандемно расположенных.

21-гидроксилазных гена — функціонально активний CYP21B і псвдоген — CYP21А, неактивний внаслідок делеции 3-му экзоне, инсерции зі зсувом рамки зчитування в 7-му экзоне і нонсенс мутацій — в 8-му экзоне. Ген і псевдоген розділені значеннєвий послідовністю гена С4 В, яка кодує 4-й фактор комплементу. Обидва гена складаються з десяти экзонов, мають длину.

3,4 кб і вирізняються лише з 87 нуклеотидам. Висока степень гомології і тандемное розташування указвают на спільність еволюційного походження цих генів. Цікаво зазначити, що ж тандемно розташовані гени 21-гидроксилазы.

(звані також Р450с21) виявлено й інших млекопитающих, причому у мишей, на відміну людини, активний лише ген CYP21A, але з CYP21B, тоді як в великої рогатої скота функціонально активні обидва гена.

Білок- 21-гидроксилаза (Р450с21- микросомальный цитохром 450) забезпечує перетворення 17-гидроксипрогестерона в.

11-дезоксикортизол і прогестерону — в дезоксикортикостерон.

У першому випадку виникає дефіцит глюкокортикоидов і, кортизола, що у своє чергу стимулює синтез.

АКТГ, і до гіперплазії кори надниркових залоз (вирилирующая форма). Порушення перетворення прогестерону в дезоксипрогестерон веде до дефіциту альдостерона, що у своє чергу нарушает здатність нирок утримувати іони натрію і призводить до швидкої втрати солі плазмою крові (сіль втрачає форма).

Як і разі гемофілії А, наявність поруч із кодирующим геном гомологичной ДНК послідовності найчастіше веде щодо порушень спарювання в мейозе як наслідок цього, до конверсії генів (переміщення фрагмента активного гена на псевдоген), або до делеции частини смислового гена. У обох випадках функція активного гена порушується. Перед делеций припадає близько 40% мутацій, частку конверсій — 20% і зарозмірено 25% становлять точкові мутації. Відповідно до отечественным даним у разі найбільш важкої сольтеряющей форми АГС, частку конверсій припадає понад 20% мутантних хромосом, частку делеций — близько 20% (Evgrafov et al., 1995).

Непряма діагностика АГС можлива з допомогою типування тісно зчеплених з геном CYP21B алелів HLA A і HLA B генів, і навіть алелей гена HLA DQA1. Пряма ДНК діагностика АГС полягає в амплификакции з допомогою ПЛР окремих фрагментів генів CYP21B і CYP21A, їх рестрикції эндонуклеазами HaeIII чи RsaI і аналізі отриманих фрагментів після электрофореза.

(Evgrafov et al., 1995).

10.4.10 Спінальна м’язова атрофия.

Спінальна м’язова атрофія (СМА) — аутосомно-рецессивное захворювання, характеризується поразкою моторних нейроновий передніх рогів спинного мозку, у результаті развиваются симетричні паралічі кінцівок і м’язів туловища.

Це — другий після муковісцидозу найбільш часте летальное моногенне захворювання (частота 1: 6 000 новорожденных).

СМА підрозділяється втричі клінічні форми. Тип I. Гостра форма (хвороба Верднига-Гоффмана), проявляється у перші 6 месяцев життя і призводить до смерті вже у роки; Тип.

II. Середня (проміжна) форма, пацієнти що неспроможні стояти, але живуть понад 4-х років; Тип III. Ювенильная форма.

(хвороба Кугельберга-Веландера) — прогресуюча м’язова слабкість після 2-х років. Усі три форми є авлельные варіанти мутацій одного гена SMN (survival motor neurons), картированного в локусі D5S125 (5q13) і идентифицированного методом позиційного клонування (см. Главу III) в 1995 р (Lefebvre et al. 1995). У цьому поки единственой работі показано, що ген SMN розміром всього 20 000 п.о.состоит з 8 экзонов. мРНК цього гена містить 1 700 п.о. і кодує раніше невідомий білок з 294 амінокислотних залишків з молекулярным вагою 32 КилоДальтона.

Ген дуплицирован. Його копія (можливо варіант псевдогена) розташовується кілька ближчі один до центромере і від гена SMN наявністю 5-и точкових мутацій, дозволяють отличить обидва гена шляхом амплификации экзонов 7 і побачили 8-го та його исследованием методом SSCP аналізу (см. Главу IV). Ген названо сBCD541, за аналогією з початковою варіантом назви для теломерной копії, т 4о 0е 4сть 0гена SMN, tBCD541. Ген cBCD541 экспрессируется, та на відміну від гена SMN його сДНК подвергается альтернативного сплайсингу із втратою экзона 7.

Відсутність гена SMN (tBCD541) у 93% хворих (213 з 229), його розірвана (interrupted) структура у 13 обстежених пацієнтів (5.6%) та наявність серйозних мутацій у оставшихся.

3-х хворих дають підстави саме цю теломерную копію гена вважати відповідальної за захворювання. Істотно отметить, що центромерная копія гена виявлено у 95 4. 05% більных, 4тогд 0а 4как 0 отсутств 4 у.е.т вона 0 тільки в 4,4% 4 пацієнтів 0.

У безпосередній близькості до теломерного кінця гена.

SMN ідентифікований іще одна ген — ген белка-ингибитора запрогаммированной загибелі нейронів (neuronal apoptosis inhibitory proteinNAIP). При важких клінічних формах.

СМА (Тип I), обумовлених делециями, очевидно, нерідко трапляється втрата гена NAIP.

Відповідно до гіпотезі авторів СМА виникає при гомозиготном стані мутацій (обычно-делеций) в гені SMN, 4при цьому различ 4ия між 0форм 4ами 0СМА визначаються двома основними факторами: 1. числом копій гена cBCD541 (дві - у разі Типу I і чотири (що виникають унаслідок конверсії між SMN і cBCD541) — у разі Типу III), 2. наявністю чи відсутністю ген 4а 0NAIP. 4С 0реди всіх обстежених СМА-больных 4не.

4обнаружены 0случа 4и одночасної 0делеции обох гомологичных генів 4- 0SMN (tBCD541) і сBCD541 4, що 0указывает, по думці авторів, 4на то, 0что така аберація має виявлятися як домінантна леталь ще эмбриогенезе.

Деякі становища цієї, безумовно, основної роботи французьких авторів, очевидно, ще вимагають уточнения, проте, вже нині вона уможливила пряму молекулярную діагностику СМА у 98,6% хворих. Для цього він с. проводится ампліфікація экона 7, який відсутня у придушующего більшості хворих. Нормальний экзон 7 (ген SMN) дифференцируют від мутантного варіанта (ген cBCD541) з помощью.

SSCP аналізу. За необхідності можлива непряма диагностика — ПЛР аналіз динуклеотидных (CA) повторів ДНК локусов D5S125; D5S112; D5S127; ПДРФ-анализ з фланкирующими.

ДНК-зондами MU, 105−153RA; 153−6741 GT.

10.4.11 Атаксия Фридрейха.

Атаксия Фридрейха (АФ) — порівняно рідкісне (1: 22.

— 25 000) аутосомно-рецессивное захворювання, характеризующееся прогресивної дегенерацією нервових клітин мозочка. Ген.

АФ не ідентифікований, але досить точно картирован на хромосомних (9q13-q21) і фізичних картах ДНК-маркеров. Наиболее тісне зчеплення гена АФ показано для локусу D9S5.

(зонд 26Р). Сконструйовані космидные бібліотеки й складено докладні фізичні карти області 4 0геномной ДНК хромосоми 9, що включає локус D9S7 і «ймовірно, ген.

АФ. Визначено становище гена ФА стосовно іншим фланкирующим молекулярным маркерам (Fujita etal., 1991; Wilkes et al., 1991) 4. 0 В час відомо, по крайньої мере,.

5 таких ДНК маркерів: GS4, MCT-112, GS2 -дистальные і мікросателлитные маркери FD1 (з відривом 80 кб 4) 0и MLS1 (з відривом 150 кб) — проксимальные. Вивчено особливості авлельного поліморфізму цих систем щодо різноманітних популяций.

Західної Європи. Всім 5 молекулярних маркерів з’ясовані гаплотипы, зчеплені з захворюванням. Гаплотипы обох мікросателлитных маркерів опинилися у абсолютному генетичному нерівновазі з АФ, що доказывет дуже близьке расположение на генетичної карті стосовно мутантному гену.

АФ (Pianese et al., 1994).

Діагностика АФ поки можливе тільки непрямими методами.

ПДРФ аналіз з допомогою ДНК-зондов на дистальные полиморфные сайти, або ПЛР аналіз поліморфізму проксимальных по отношению до гену АФ микросателлитных маркерів MLS1 чи FD1.

Нами розглянуті лише ті моногенные наследственные хвороби, умовно розділені втричі підгрупи, виходячи, переважно, речей наскільки вони вивчені з молекулярно.

— генетичних позицій, їх актуальності для пренатальної діагностики у якій мері вони для медико-генетичної служби нашої країни. Понад те, історично склалося тож саме такі захворювання як муковісцидоз, миодистрофия.

Дюшенна, гемофілія А, фенілкетонурія, то 4 0есть 4 0социально наибільш значимі, раніше від інших генних хвороб стали предметому детального молекулярного аналізу, у нашої лабораторії та інших медико-генетичних центрах і науково-практичних підрозділах Росії (див. Баранов, 1991, 1994;

Baranov, 1993; Євграфов, Макаров, 1987).

Природно, що розглянутими нозологиями зовсім на вичерпується список тих хвороб, що є об'єктами молекулярних досліджень, у нашій країні. Наприклад, з огляду випали такі моногенные 4 0болезни як гиперхолестеринемія, гемоглобинопатии, дефіцит альфа-1 антитрипсина, митохондриальные хвороби. 4 0Для багатьох з яких розробити й подати широко застосовуються ефективні методи молекулярної діагностики, ведутся дослідження з генотерапії. 4 0Мы стосувалися б також работів проведених, 4 0главным чином, 4 0 В очолюваної профессором.

Е.И.Шварцем лабораторії молекулярної діагностики ПИЯФ РАН і присвячених молекулярному аналізу мультифакторіальних заболеваний, 4 0таких як діабет, гіпертонія, ішемія серця. Результаты цих 4 0исследований 4 0будут, очевидно, предметом наступних оглядів і монографий.

ГЛАВА I.

СТРУКТУРА І МЕТОДИ АНАЛІЗУ ДНК.

Розділ 1.1 Загальні уявлення, центральна догма, генітический код.

Універсальна генетична субстанція чи «енциклопедія життя », ДНК, містить інформацію, необхідну синтезу білків і нуклеїнових кислот, присутніх переважають у всіх типах клітин як проі эукариот. Дезоксирибонуклеиновые кислолоти (ДНК) — це ниткоподібні молекули, які з чотирьох розміщених у варьирующем порядку нуклеотидів: пуринов — аденіну і гуанина, і пиримидинов — цитозина і тиміну, соединенных в полинуклеотидную ланцюг з кістяком з які чергуються остатков цукру — дезоксирибозы, і фосфату. Послідовність нуклеотидів ДНК чи пар підстав становить інформаційну ємність молекули, визначаючи порядок синтезу і аминокислотную послідовність білків відповідно до універсальним всім живих істот трехбуквенным — триплетным, генетичним кодом (Табл.1.1). Дезоксирибонуклеиновые кислоти представляют собою єдиний тип молекул, талановитими в самовоспроизводству чи реплікації, як і забезпечує наступність генетичної інформацією ряду поколінь. Записується послідовність ДНК зліва-направо (5 «- 3 ») першими заглавными літерами відповідних нуклеотидів, є одновременно одиницями виміру молекули. Розміри ДНК можуть змінюватися в тому гігантських межах від кількох основних нуклеотидів до мільярдів пар підстав (п.о.). Як одиниць виміру розмірів ДНК використовуються також килобазы (kb) і мегабазы.

(mb) — послідовності, відповідні тисячі й мільйону пар підстав, соответственно.

ДНК можуть існувати як у вигляді однонитевых, і у вигляді двухнитевых молекул. Двухнитевые чи двухцепочечные молекулы утворюються з допомогою хімічного комплементарного спаривания між аденином і тиміном (А — Т) й між гуанином і цитозином (Р — Ц). Ці водневі зв’язок між парами нуклеотидов досить неміцні, отже ланцюга ДНК можуть легко диссоциировать — розділятися, і асоціювати — з'єднуватися, за зміни температури чи сольових концентрацій. При кажбудинок циклі ассоциаци — дисоціації чи, як ще кажуть, віджиге — плавленні, буде відтворюватися двухнитевая структура — дуплекс, стійкість визначається зіответствием нуклеотидних пар. Найбільш стійкі структури, представлені повністю комплементарними нитками ДНК. Процесс освіти дуплексов називається гібридизації. Шппсобность до комплементарному спарюванню підстав — одне з чудових властивостей ДНК, визначальних можливість саморепликации і точного вибору специфічних ділянок активации молекули у процесі зчитування генетичної информации. Це свойтво широко використовують у молекулярної біології на допомогу пошуку та ідентифікації потрібних послідовностей в огромных молекулах ДНК під час використання як зондів її порівняно невеликих мічених фрагментов.

Людина більшість ДНК- 3.2 мільярда пар оснований, перебуває у ядрах клітин на вигляді 46 щільно упакованих, суперскрученных з допомогою взаємодій з ядерними білками структур, званих хромосомами. Порівняно невелику частину ДНК — майже п’ять%, пристствует в мітохондріях — органеллах цитоплазми, які забезпечують процеси подиху і энерегетического обміну клітин эукариот. У багатьох соматичних клітин ДНК представленій у двох копіях — за однією у кожному хромосомі. Отже, у клітинах присутні 23 пари хромосом, 22 у тому числі гомологичны одна одній — аутосомы, і жодна пара (X і Y) — статеві хромосоми. Наявність Y хромосоми визначає чоловічої підлогу особини. При записи нормального кариотипу індивідуума вказується загальна кількість хромосом і тип половых хромосом. Отже, нормальний каріотип чоловіки ;

46,XY, а жінки -46,XX. У процесі гаметогенеза відбувається випадкове розбіжність гомологичных хромосом в мейозе в кожній зрілої статевої клітині - гамете, залишається тільки 23 хромосоми, тобто гаплоидный набір хромосом. Причому у кожної гамете зберігається лише однієї статева хромосома — гоносома. У яйцеклітинах це X хромосома, тоді як сперматозоіди із однаковою ймовірністю несуть як X, і Y хромосому, тобто підлогу майбутньої особини детермінується геномом сперматозоитак. При заплідненні диплоидный набір хромосом восстанавливается. Відповідно до сучасними уявленнями геном людини складається з 25 хромосом, 22 у тому числі аутосомы,.

2 статеві хромосоми і жодна мітохондріальна. У кожній клетках присутній порядку 1000 мітохондрій, а кожному митохондрионе міститься близько 20 кільцевих мітохондріальних хромосом, сходнах з хромосомами бактерій. Отже, у клітинах присутній близько 1000 копій мітохондріальних хромосом.

У хромосомах эукариот ДНК перебуває у двухнитевой формі, що забезпечує можливість точної реплікації при кожному циклі розподілу клітини. Одна нитку кодирующая чи значеннєва, комплементарная їй нитку — антисмысловая. Декодування інформації, закладеною у молекулі ДНК, чи процес транскрипции, здійснюється з допомогою виборчого синтезу молекул.

РНК, комплементарных певним ділянкам ДНК, так называемых первинних РНК транскриптів. Транскрибируемые ділянки ДНК звуться генів. Рибонуклеиновые кислоти (РНК) за своєю структурою дуже подібні з молекулами ДНК. Вони також складаються з чотирьох нуклеотидів, лише з пиримидиновых оснований — тимин, замінено на урацил й у сахарозном кістяку замість дезоксирибозы представлена рибоза. Молекули РНК існує лише в однонитевой формі, але можуть утворювати дуплексы з молекулами ДНК. Після синтезу молекули РНК перетерплюють досить складну модифікацію — процессинг. У цьому провиходять зміни у кінцевих ділянках молекул і вирізаються області, гомологичные интронам — некодирующим частинам гена.

Цей процес відбувається називається сплайсингом. У результаті з первичных РНК транскриптів утворюються молекули інформаційної чи матричної РНК (мРНК), які становлять безперервну послідовність нуклеотидів, гомологичную лише экзонам.

— смисловим ділянкам гена. Молекули мРНК як рибонуклеопротеїнових гранул виходять із ядра в цитоплазму і з'єднуються з рибосомами, де відбувається процес трансляції - синтез полипептидной ланцюга. Трансляція мРНК відбувається у точному зіответствии з генетичним кодом, за яким последовательность із трьох нуклеотидів РНК — кодон, відповідає певної амінокислоті чи сигналу терминации синтезу полипептидной ланцюга (Табл.1.1). Реалізація генетичного коду здійснюється з участю 20-ти типів транспортних РНК.

(тРНК), єдиних нуклеїнових кислот, які у собі поруч із нуклеотидами жодну з амінокислот. тРНК имеют кленовообразную форму, в хвостовій частини молекули расположена певна амінокислота, точному відповідність до послідовності із трьох нуклеотидів у сфері, званої антикодоном. Проходження мРНК по рибосоме є сигналом наближення до рибонуклеопротеидному комплексу тієї тРНК, що має послідовність нуклеотидів в антикодоне комплементарна кодирующему триплету мРНК. Отже транспортируется відповідна амінокислота здійснюється селледовательный синтез полипептидной ланцюга. Мітохондрії мають свою автономну систему білкового синтезу: рибосомальные.

РНК, мРНК і транспортні РНК.

Генетичний код універсальний всім живих істот — це одна з його головних властивостей. Невеликі відмінностей у структурі коду знайдено лише мітохондріальній ДНК. Так було в митохондриальном генетичному коді стоп кодонами є триплеты АГА і АГЦ, які кодують аргінін у ядерній ДНК.

(Табл.1.1). Універсальність генетичного коду служить наиболее вагомим аргументом на користь гіпотези про єдиному джерелі виникнення життя землі і филогенетическом кревність всіх видів живих істот. З іншого боку, саме це властивість забезпечує можливість прочитання у різноманітних модельних клеточных системах штучно введеної генетичної інформації, сконструйованої з фрагментів ДНК різного видового происхожденеия. Отже, вся генна інженерія полягає в універсальності генетичного коду. Іншим властивістю генетического коду є його вырожденность, яка полягає у цьому, що це амінокислоти окрім двох кодуються кількома варіантами триплетов. Справді, з 64 можливих комбинацій нуклеотидних триплетов РНК три відповідають термінірующим кодонам — ochre, amber і opal, інші варианты.

(61) кодують 20 амінокислот, причому триплеты, які кодують те ж амінокислоту, зазвичай, різняться щодо третього нуклеотиду в кодоне. Отже, знаючи нуклеотидную послідовність що кодує ділянки ДНК, можна однозначно прогнозувати аминокислотную послідовність соответствующего полипептидного фрагмента, тоді як біжать й та аминокислотная послідовність може кодуватимуть разособистим чином. У цьому, число можливих варіантів кодующих ДНК різко зростає збільшенням довжини полипептида.

На наступний етап полипептидные ланцюга транспортуються до специфічним органеллам клітини, і модифікуються з образованием зрілого функціонально активного білка. У окремих випадках інформація з молекул РНК може назад транскрибироваться в молекули ДНК. Зокрема, при зворотної транскрипции мРНК утворюються молекули комплементарної ДНК — кДНК, у якій залежно від повноти процесу представлені частково чи цілком всі смислові які кодують последовательности гена. Розглянута схема реалізації однонаправленного потоку інформації ДНК-РНК-Белок лежить в основі центральної молекулярно-биологической догми — рис. 1.1.

Докладніше з процесами реплікації, транскрипції, процесингу і трансляції можна ознайомитися у численних довідниках із молекулярної біології, цитології і генетике.

(Стент, Кэлиндер, 1981; Зенгер, 1987; Льюин, 1987).

1.2 Виділення ДНК, її синтез і рестрикция.

ДНК то, можливо ізольована із будь-якої типу тканин та клеструм, містять ядра. Етапи виділення ДНК включають швидкий лизис клітин, видалення з допомогою центрифугування фрагментов клітинних органел і мембран, ферментативное руйнація білків та його экстрагирование з розчину з допомогою фенолу і хлороформу, концентрування молекул ДНК шляхом преципитации в етанолі. З 1 грама сирої рядна або з 10!9 клітин зазвичай отримують 2 міліграма ДНК. Людина ДНК, найчастіше, вироблять з лейкоцитів крові, навіщо збирають від 5 до 20 мл венозної крові в стерильну пробірку з розчином, препятствующим коагуляції (наприклад, з глюгециром чи гепарином). Потім відокремлюють лейкоцити і клітинні плодів та овочівные мембрани додаванням буферних розчинів, містять денатурирующие агенти. Найкращі результати при виділенні ДНК дає застосування протеиназы-К із наступною фенолу — хлороформной екстракцією зруйнованих білків. ДНК в облогу беруть в цянулі і розчиняють в буферном розчині. Оцінку якості екстрагированной ДНК проводять виходячи з виміру оптичної щільності розчину ДНК у сфері білкового і нуклеинового спектрів поглинання. У чистих зразках ДНК соотношение.

А (260)/A (280) > 1.8. Інакше процедуру очищення необхідно повторювати, оскільки для успішного використання коштів і зберігання ДНK білки повинні бути цілком віддалені. Більше підробно з методами виділення, тож очищення ДНК із різних тканин можна ознайомитися на роботах і довідниках, які у кінці книжки (Маниатис та інших., 1984; Дейвіс, 1990; Горбунова та інших., 1991).

У процесі складного й різноманітного функціонування різні ділянки хромосом і ДНК перетерплюють різноманітні регульовані й у основі своїй, оборотні зміни. Ці модификации здійснюються з допомогою спеціальних білків — ферментів. Опис ферментативного апарату реплікації, транскрипции, репарації - системи захисту і відновлення поврежденных ділянок ДНК, рекомбінації, тобто обміну ділянками гомологичных хромосом і ДНК, далеко за межі нашого викладу. Ми коротко ознайомимося лише двома класами ферментів ДНК — полимеразами і рестриктазами, особливо важными розуміння основ сучасної молекулярної диагностики.

Ферменти, здійснюють синтез ДНК, називаються ДНК-полимеразами. І на бактеріальних клітинах, й у клітинах эукариот містяться три різноманітні форми ДНК-полимераз, усі вони обладають синтезуючої активністю і здатні подовжувати ланцюга ДНК у бік 5 «- 3 », послідовно нарощуючи за одним нуклеотиду до 3 «-OH кінцю, причому точність синтезу определяется специфічністю спарювання підстав. Отже, до роботи ДНК-полимеразы необхідна однонитевая матрична ДНК з двухнитевым ділянкою на 3 «- кінці молекули. З іншого боку, серед повинні бути чотири типи трифосфатов (dATP, dCTP, dGTP і dTTP) — молекул, які з підставиA, C, G чи T, цукру — дезоксирибозы (d) й трьох фосфатних остатков.

(P). У клітинах эукариот репликацию здійснює ДНК-полимеразу альфа, а клітинах E. coli — ДНК-полимераза 111.

ДНК-полимеразы мають різними активностями, зокрема і экзонуклеазной у бік 3 «- 5 », що дозволяє йому виправляти — репарирувати, дефекти, допущені під час доборі комплементарных підстав. ДНК-полимераза 1 E. coli здатна ініціювати репликацию на місці розриву ДНК і заміщати гомологічний ділянку у подвійний ланцюга ДНК. Це властивість используется запровадження в ДНК мічених нуклеотидів методом ник-трансляции.

Відкриття бактеріальних ферментів, які мають эндонуклеазной активністю — рестрикционных эндонуклеаз чи рестриктаз, значно просунули дослідження структури ДНК й можливості генноинженерного маніпулювання з молекулами.

ДНК. In vivo ці ферменти беруть участь у системі распознования та цивільного захисту «своїх «і знищенні чужорідних ДНК. Рестриктазы дізнаються специфічні послідовності з 4 — 6, рідше 8 ;

12 нуклеотидів в двухцепочечной молекулі ДНК і розрізають в фрагменти у місцях локалізації цих послідовностей, званих сайтами рестрикції. Кількість які виникають рестрикционных фрагментів ДНК визначається частотою встречаемости сайтів рестрикції, які розмір — характером розподілу цих сайтів із довжині вихідної молекули ДНК. Чим частіше расположены сайти рестрикції, тим коротше фрагменти ДНК після рестрикції. Нині відоме понад 500 різних типів рестриктаз бактеріального походження, причому кожен із ферметов дізнається своє специфічне послідовникность. Рестриктазы виділяють шляхом біохімічної очищення із різних видів бактерій і позначають трьома літерами, соответствующими перших трьох буквах латинського назви виду бактерій, і римської цифрою, відповідної хронології вткрытия цього ферменту цього виду бактерій. Залежно від частоти народження сайтів рестрикції в молекулі ДНК розрізняють три класу рестриктаз часто-, посередньоі редкощепящие. Природно, що рестриктазы, узнающие довгі специфические послідовності (8−12 п.о.), зазвичай, є редкощепящими (наприклад Nor1), а узнающие короткі (4−5 п.о.) — частощепящими (Taq1, EcoR1).

Сайти рестрикції можна використовувати як генетичних маркерів ДНК. Справді, які утворюються в результатае рестрикції фрагменти ДНК може бути упорядковані за довжиною шляхом електрофорезу в агарозном чи полиакриломидном гелі, і тим самим може бути оцінена їх молекулярна масса, отже, та фізичне відстань між сайтами. Напомним, що звичайним методом виявлення ДНК в гелі, як і и.

РНК, є його специфічне забарвлення, найчастіше цідиумом бромидом, і перегляд гелю в що проходить ультрофиолете.

За цих умов місця локалізації ДНК мають червону забарвленняку. З використанням для рестрикції кількох эндонуклеаз з наступним электрофоретическим аналізом перекрывающихся аддитивных за довжиною фрагментів ДНК можна домогтися повного упорядкування сайтів впізнавання кожного з ферментів відносительно одне одного й якихось інших маркерів, присутствующих в досліджуваної молекулі ДНК. Процес називається фізическим картированием і є елементом аналізу плазмидных, вірусних, бактеріальних ДНК і відносительно невеликих фрагментів ДНК эукариот. На рис. 1.2. представлен найпростіший приклад такої картирования у разі, як у досліджуваної молекулі ДНК присутній за одним сайту рестрикції обох эндонуклеаз. Після опрацювання исходной.

ДНК окремо кожної з рестриктаз утворюється два фрагмента, відповідних за довжиною відстані від кінців молекули ДНК до сайтів рестрикції. При спільної обробці обома ендонуклеазами на электрофореграмме з’являється новий фрагмент, розмір якого відповідає відстані між сайтами рестрикции. Вочевидь, що дані ще дозволяють однозначно визначити положення сайтів рестрикції стосовно кінців молекули ДНК. Проте, досить знати розташування хоча самого маркера у тому, щоб зробити точне фізичне картування вихідної молекули ДНК незалежно кількості локалізованих у ній сайтів рестрикции.

Після обробітку тотальної геномної эукариотической ДНК, зокрема ДНК людини, часточи среднещепящими эндонуклеазами утворюється дуже багато фрагментів різної довжини (загалом, порядку 1 мільйона), що й вдасться розділити з допомогою електрофорезу, тобто вдається візуально идентифицировать окремі фрагменти ДНК на электрофореграмме.

Після електрофорезу рестрцированной геномної ДНК виходить рівномірний забарвлення у всій довжині гелю — так званий шмер. Ідентифікація потрібних фрагментів ДНК у тому гелі візможна лише шляхом гібридизації з міченими ДНК-зондами. Це досягається з допомогою методу блот-гибридизации по Саузерну.

1.3. Блот-гибридизация по Саузерну, гібридизація in situ.

Однією з найефективніших методів ідентифікації певних молекул ДНК серед электрофоретически розділенийных фрагментів є став вже класичним метод блот-гибридизации по Саузерну, на прізвище автора Edцuard Southern, який запропонував даний метод в 1975 р. Послідовникные етапи цього методу представлені на Рис. 1.3. Суть метотак у тому, що геномная ДНК піддається рестрикции одна чи кілька рестриктазами, після чого утворющиеся фрагменти поділяються по молекулярному вазі в агарозном чи акриламидном гелях. Потім ДНК піддається денатурации in situ і переноситься з гелю на щільний носій (зазвичай нитроцеллюлозный фільтр чи нейлонову мембрану). Сам переніс (блоттинг) здійснюється впливом капілярних сил, електричного поля чи вакууму. Фіксовану на фільтре ДНК гибридизуют з радиоактивномеченым ДНК чи РНК зонбудинок. Методом авторадиографии визначають становище шуканого фрагмента геномної ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридизация — високо чутливий метод ідентифікації специфических послідовностей ДНК. При досить тривалої експозиції (протягом за кілька днів) і за високої удільної радіоактивності ДНК-зонда (більш 10!9 расп/ мин/микроГ) його дозволяє виявляти менш, ніж 0,1 пикоГ ДНК. Так під час використання зонда розмірами на кілька сотень підстав уникальная послідовність один 000 п.о. то, можливо виявлено удесятеро микроГ геномної рестрицированной ДНК як окремої смуги на радиоавтографе саме його експозицій протягом 12 годин. Метод дозволяє працювати з дуже короткими олигонуклеотидными зондами (20 п.о.), проте вимагає особливо морошего мечения і тривалої експозиції фільтра. Необходимость роботи з чистими препаратами ДНК, застосування высокомеченых радіоактивних зондів, тривалість і трудомісткість всієї процедури роблять її занадто дорогою. Проте, часом і сьогодні метод не втратив значення зокрема й у діагностики генних хвороб. Останнім часом цих цілей нерідко використовують різні варіанти нерадиоактивного мечения чи забарвлення ДНК азотно-кислым серебром.

Гібридизація з міченим ДНК-зондом препаратів ДНК или.

РНК, заподіяних капельно на твердий матрикс без випередительной рестрикції і електрофорезу називається дотчи слот-гибридизации залежно від конфігурації плями ДНК на фільтрі, округлої чи довгастої, відповідно. На рис. 1.3 також зображені послідовні етапи цих методов. Принагідно зауважимо, що метод гібридизації ДНК-зондов з электрофоретически розділеними молекулами РНК носить название Нозерн блот, тоді як Вестерн блот чи иммуноблот — це зв’язування электрофоретически розділених білків, фиксированних на фільтрах, з міченими антитілами. Назва цих методов — данина молекулярних генетиків професору Саузерну, який зробив неоціненний внесок у розробку экспериментальных підходів, що використовуються аналізу ДНК.

Нерідко щодо гібридизації з ДНК зондами непотрібен попереднього виділення, тож очищення ДНК.

Процедуру гібридизації можна лише з гелі, на фільтрах чи розчині, а й у гістологічних чи кульгавосомных препаратах. Цей метод називається гібридизації in situ. Варіант методу, щоб у ролі зондів используются препарати ДНК чи РНК, мічені флюорохромами, называется FISH (flurescein in situ hybridization). Меченый.

ДНК-зонд завдають на препарати дифференциально забарвлених і підготовлених для гібридизації (денатурированных) метафазных хромосом. Попередня обробка хромосом спрямовано полегшення зонда до геномної ДНК. Важливе значення має тут також добір умов, максимально сприяють процедуре гібридизації. Після відмивання несвязавшихся молекул ДНК і нанесення світлочутливої емульсії (під час використання радіоактивної мітки), або проведення відповідної обработки (під час використання біотинчи флюоресцеин-меченых ДНК зондів) місця локалізації послідовностей ДНК, комплементарных застосованому ДНК-зонду, можна безпосередньо поспостерігати на мікроскоп як характерних точок над соответствующими ділянками певних хромосом (Рис. 1.4).

Гібридизація in situ, одна із найбільш еффективных методів картирования комплементарных ДНК-зонду послідовностей ДНК на хромосомах. Цю методику особливо ефективна для дослідження розподілу за геномом повторяющихся послідовностей ДНК, клонованих послідовникностей ДНК анонімного походження, щодо як хромосомної приналежності, а й внутри-хромосомной локализациии унікальних генів у тому випадку, коли є відповідні ДНК-зонды. У цьому що дозволяє здатність методу може становити кількох хромосомних бэндов. Согласно останніх даних, в експериментах на спеціально приготовленных і розтягнуті интерфазных хромосомах людини развирішальна здатність методу FISH може становити 50 kb, що становить близько 1/20 величини середнього хромосомного бенду. Проблеми взаєморозташування клонованих фрагментов.

ДНК навіть у межах хромосомного локусу і з успехом вирішуються методом FISH.

Гібридизація in situ між молекулами РНК і кДНК-овыми зондами, проведена на гістологічних препаратах, одна із найефективніших методів аналізу тканеспецифического і розподілу і внутрішньоклітинної локалізації мРНК.

(Манк, 1990). Докладно з цим та іншими сучасними метобудинок молекулярного і цитогенетичного аналізу, ні з їх численними модифікаціями і варіантами можна ознакомиться у серії робіт, посібників і оглядів (Маниатис і др.,.

1984; Дейвіс, 1990; Sambrook et al., 1989).

1.4 ДНК-зонды, клонування, векторні системы.

ДНК-зондом може бути будь-яка однонитевая ДНК ограниченного розміру, використовувана на допомогу пошуку комплементарных послідовностей в молекулі більшого розміру чи серед пулу різноманітних молекул ДНК. Нерідко як зондів використовують штучно синтезовані олигонуклеотидные послідовності ДНК, розмір які зазвичай вбирається у 30 нуклеотидів. Зондом також можуть бути виділені з геному послідовності ДНК. Проте значительале такі послідовності попередньо клонируют, щоб матимуть можливість одержувати їх у час й у неограниченном кількості. Клонування передбачає встраивание.

(инсерцию) чужорідної екзогенної ДНК в векторну молекулу.

ДНК, що забезпечує проникнення цієї конструкції в бактериальные клітини хазяїна (Рис 1.5). Химерні молекули ДНК, що складаються з фрагментів різного походження, носять зввание рекомбінантних ДНК. Як клонирующих векторів використовують модифіковані плазміди, фаги, космиды, ретроі аденовіруси, і навіть деяких інших генетичні конструкции. Розміри клонованих ДНК-зондов сягають від зітен за кілька тисяч нуклеотидів, що визначається, главным чином, здатністю вектора утримувати чужорідний фрагмент ДНК. Особливо широко застосовують у ролі векторів плазмидную ДНК.

Плазмідами — це невеликі кільцеві двухцепочечные молекулы ДНК, які можуть опинитися бути присутнім на різному числі копій в бактеріальних клітинах. Відкриття плазмід пов’язані з вивченням генетичної природи антибіотикостійкості. Оказалось, що став саме плазмідами можуть нести гени, повідомляють клітинам опірність різним антибіотиків, і втрата чутливості інфекційних бактерій до дії таки відбувається поза рахунок відбору тих штамів, у яких маються плазмідами із відповідною генетичної інформацією. Замітім, що плазміди в бактеріальної клітині зовсім необов’язково задля забезпечення життєдіяльності організацій, бо за відсутності антибіотиків серед проживання бактерій штамми, які містять плазмід, цілком життєздатні. Плазміди мають автономну систему контролю реплікації, що забезпечує підтримку кількості у клітині певному рівні - від однієї за кілька сотень плазмидных геномів на клетку.

Зазвичай для клонування вибирають плазміди з ослабленим контролем реплікації, що дозволяє йому накопичуватися в клетке у числі копій. Конструювання плазмидных клонирующих векторів полягає в внесенні змін у систему контролю реплікації й у додаванні чи вирізанні генів антибиотикоустойчивости чи зручних для клонування інших генітических елементів: специфічних сайтів рестрикції, инициации і регуляції транскрипції тощо. Найчастіше для клонирования використовують плазміди pBR322, ColE1 чи його производные.

Кільцеву молекулу плазмидной ДНК можна легко перекласти на лінійну форму шляхом одиничного розриву на місці локализации унікального сайту рестрикції. Приєднання (встраивание, инсерция) фрагмента чужорідної ДНК до кінців лінійної молекули здійснюється з допомогою специфічних ферментов.

— лигаз, після чого гібридна плазмида знову приймає колицевую форму. Розроблено досить прості й ефективні методи трансформації бактерій, тобто штучного введения плазмід в бактеріальні клітини. У цьому, наявні у плазмидах гени антибіотикостійкості використав качестве маркерів трансформованих бактерій їхнього відбору відповідних селективних середовищах. При розмноженні трансформованих бактерій відбувається збільшити кількість допий инсертированного фрагмента ДНК. Отже, цей бажеродный для бактерій генетичний матеріал то, можливо підлозічен, практично, у різноманітних кількостях. Виділена з бактерій плазмидная ДНК чи ізольований з плазміди инсертированний фрагмент можна подальшому використані качестве ДНК-зондов.

Для деяких цілей у ролі клонирующих векторів виявилося зручніше використовувати фаги — бактеріальні вирусы.

Фаговая ДНК існує лише у лінійної формі, тому у її рестрикції утворюються два фрагмента, які зшивають з чужорідної ДНК із заснуванням химерного фага. Суто технически війни операція простіше, ніж инсерция в плазміду. Проте, розміри встраимовой ДНК обмежені пакующей здатністю говправні фага. Тому, за конструюванні вектора вирізають послідовності фаговой ДНК, які мають критичного значения для життєзабезпечення фага. Такий бактеріофаг може существовать в тому разі, тоді як нього її вмонтовано чужерідна ДНК, за величиною порівнянна з вирізаної фаговой.

ДНК. Найбільш вдалі конструкції векторів отримано з урахуванням фага лямбда — лямбда gt10, лямбда gt11, лямбда Zap.

Безліч побутових проблем молекулярної генетики успішно вирішуються з допомогою экспрессионных векторів, які у собі регуляторні послідовності, щоб забезпечити сінтез чужорідних білків у клітинах хазяїна. Так було в разі лямбда gt11 фаги можуть бути в, про, репликативных умовах, які забезпечують експресію инсертированной ДНК.

Оскільки зазвичай ДНК убудовують району локалізації маркерного гена, що дозволяє вести селекцію химерних фагов, то экспрессироваться буде злитий білок, у якому частина полипептидной ланцюга відповідатиме маркерному білку, а частина ланцюга транслюватиметься відповідно до информациїй, яка є у вмонтованому фрагменті ДНК. Цей білок может бути ідентифікований шляхом детекции фрагмента маркерного білка або з допомогою антитіл до специфічним ділянкам, кодируемым чужорідної ДНК.

Останнім часом велике поширення одержало клонування в космидах — конструкціях, обьединяющих у собі переваги плазмід і фагов. Космиды отримані з урахуванням плазмід, але у них запроваджені генетичні елементи фага лямбда, відповідальні за упаковку ДНК в фаговой частинки. Такі вектори можуть існувати у вигляді плазмід, а й у вигляді фаговых частинок in vitro. Космиды мають більшої клонирующей здатністю проти плазмідними і фаговыми векторами і може нести до 40−45 тисяч пар підстав инсертированной.

ДНК. Всі перелічені вектори йдуть на клонирования в прокариотических системах.

Вектори, придатні спрямованого перенесення в эукариотические клітини, конструюють з урахуванням прокариотических чи дріжджових плазмід — єдиних плазмід, знайдених клітинах эукариот, і навіть використовують різні эукариотические віруси, найчастіше ретровіруси, аденовіруси чи пеклоноассоциированные віруси. З використанням плазмід в качестве клонирующих векторів у яких вводять вірусні последовательности, відповідальні початок реплікації. Запровадження століттяторів в эукариотические клітини часто здійснюють шляхом ко-трансформации, т-є одночасно вводять плазміду й сегмент чужорідної ДНК. Векторні послідовності, введенные у клітини эукариот, можуть зберігатися там протягом днів як суперскрученных кільцевих молекул — эписом. У окремих випадках можлива інтеграція екзогенної ДНК в хромосомну ДНК. У таких випадках запроваджені послідовникности стійко зберігаються в геномі клітин господаря і насленадуті по менделевскому типу (див. Глава VIII).

Для клонування субхромосомальных фрагментів ДНК, зітримають цілі гени, розроблено систему дріжджових минихромосом. Штучні дріжджові хромосоми (YAC — artificial yeast chromosomes) конструирют з урахуванням плазмидных векторів, які у собі відомі центромерные й тіломерные послідовності хромосом дріжджів, необхідних підтримки і реплікації векторів у клітинах хазяїна. Такиє системи здатні утримувати фрагменти чужорідної ДНК розміром у кілька сотень тисяч і навіть мільйонів пар оснований.

Зупинимося коротко на методах запровадження векторів у клітини хазяїна. Та насамперед, визначимо основні терміни. Як згадувалося, запровадження плазмидной ДНК в бактеріальні клітини назвается трансформацією. Якщо перенесення генів осуществляется з допомогою фага, то говорять про трансдукциии. Процес запровадження екзогенної ДНК в эукариотические клітини називається трансфекцией. Всі ці методи засновані на доборі умов, які полегшують проходження плазмидной чи фаговой ДНК через клітинні і ядерні мембрани. На підвищення проникності мембран використовують дві різні підходу. У першому випадку проводять обробку векторної ДНК і клітин хазяїна буферними розчинами, що підвищують проникність клітинних і ядерних мембран (метод кальций-фосфатной преципитации,.

DEAE-декстран-опосредованная трансфекція). У другий випадок використовують короткострокове фізичне вплив на клітини до створення в мембранах мікропор, прохідних для макромолекул ДНК (метод электропорации — вплив високовольтним електричним полем, «бомбардування «частинками золота тощо.). Докладніше проблеми векторів й фізичні методи генетичесдідька лисого трансфрмации (трансдукції) розглянуті в Главі IX. Вопросам молекулярного клонування також присвячена велика література (Гловер, 1988; 1989; Шишкін, Калінін, 1992; Маніатис та інших., 1984; Дейвіс, 1990; Sambrook et al., 1989).

1.5 Геномные і к-ДНК-овые бібліотеки генів, їх скрининг.

Розглянемо докладніше методи виділення, тож идентификации фрагментів ДНК, необхідні аналізу або заради використання газу як ДНК-зондов. Основним джерелом цих фрагментів є штучно сконструированні бібліотеки генів, у яких здійснюють пошук чи скринінг потрібних послідовностей ДНК в спосіб залежно від специфічних особливостей цих последовательностей. Бібліотека генів це повний набір клонованих перекрывающихся фрагментів ДНК, які є результатом рестрикції чи механічного розрізування тотальної ДНК, выделенній з якогось специфічного джерела. У зависимости з походження ДНК розрізняють геномные і кДНК-овые бібліотеки генів. Для конструювання геномних бібліотек івобслуговують ДНК, виділену з тканин, культур клітин, з відділових хромосом або з їх фрагментів. Під час створення кДНК.

— овых бібліотек виділяють тотальну мРНК з тканин чи лантухтивируемых клітин, у яких явно экспрессируются интересующие дослідника гени. На наступний етап методом проратною транскрипції (РНК-ДНК) синтезують кДНК. Потім її розрізають і упаковують в обраний для клонування вектор.

Схема конструювання геномних і кДНК-овых бібліотек представлена на рис. 1.6. Як бачимо на схемою в геномних библиотеках присутні як які кодують послідовності геновий, але й несмысловые внутригенные послідовності - интроны і межгенные ділянки ДНК, причому питому вагу некодирующих фрагментів ДНК значно вища. кДНК-овые бібліотеки складаються тільки з які кодують — экзонных, областей генів. Наиболее зручний розмір инсертируемой ДНК порівнянним з середовищним розміром гена ссавців і як 15 — 25 тисяч пар підстав (kb). Оптимальний за величиною набір перекрывающихся послідовностей геномної ДНК людини виходить після його перетравлення частощепящими рестриктазами Sau3a или.

Mbo1. Інформаційна ємність кожної книгозбірні, тобто доличество клонів з різними инсертированными фрагментами.

ДНК, визначається розмірами вихідного геному і необходимостью присутності кожної його послідовності хоча в одному клоні. Тому досить представницькі геномные бібліотеки ссавців зазвичай містять щонайменше 8*10!5 ;

10!6 різних клонов.

Частіше бібліотеки конструюють з урахуванням фаговых чи космидных клонирующих векторів, позаяк у такому вигляді легше зберігати велику кількість химерних ДНК. До сформування библинабряк генів людини особливо зручні вектори, отримані з урахуванням фага лямбда, такі як EMBL3 чи EMBL4. Пакующая здатність цих векторів від 9 до 23 кб, вони є багато зручних клонирующих сайтів, отож у инсерции ДНК можна використовувати різні рестриктазы. З іншого боку, ці векторы не містять послідовностей плазмід, найчастіше що використовуються клонування: pBR322 і ColE1. Це позволяет проводити відбір потрібних клонів з допомогою фаговой ДНК, не вирізаючи попередньо инсертированный у ній фрагмент. До сформування бібліотек клонів, містять великі райони ДНК, використовується технологія штучних дріжджових хромосом.

— YAC. Останні є великі (до 1 млн п.о.) фрагмены геномної ДНК людини, зшиті з центромерными районами хромосом дріжджів. Після ідентифікації в библиотеках потрібних клонів з инсертированными фрагментами чужеродных.

ДНК США можуть бути субклонированы в фаговых чи космидных библиотеках.

Скринінг бібліотек проводять шляхом гібридизації на фільтрах з олигонуклеотидными, кДНК-овыми чи будь-якими иными.

ДНК-зондами, ні з допомогою антитіл, якщо бібліотека сконструйована з урахуванням экспрессионного вектора (рис. 1.7).

І тому химерні фаги, складові бібліотеку, висівають на щільно зростаючий в чашках Петрі газон бактерій таким образом, щоб утворилися окремі литические бляшки в результате инфецирования клітин одним рекомбінантним фагом.

Усі культури дублюють шляхом відбитка — репліки, інші чашки Петрі. Потім на вихідні культури накладають фільтри і переносять ними зростання напруження та лизированные колонії, проводять їх зруйнування, фіксацію білків і ДНК на фільтрі і блот гинувридизацию з міченим ДНК-зондом чи иммуноблот з міченими атителами (для экспрессионных бібліотек). Після відмивання фільтров від несвязавшихся мічених зондів і радиоавтографии на рентгенівської плівці проявляться темні плями у місцях локализации колоній, які у инсертированном фрагменті ДНК послідовності, комплементарные зонду, чи специфічні антигени. Відбір позитивних колоній фагов на дубльованих культурах виробляють саме в місцях, де відбулося затемнение плівки. Щоб уникнути можливого забруднення, відібрані колонії розмножують і знову піддають скринированию. Зазвичай, инсертированную ДНК ізолюють з бактериофага і субклонируют в плазмидном векторі, що дозволяє нарощувати велику кількість цієї ДНК.

1.6 Секвенування послідовностей ДНК.

Наступними етапами аналізу відібраного і клонированного.

ДНК фрагмента є її фізичне картування і определение нуклеотидної послідовності, тобто секвенирование. Методологія секвенування достатня проста і заключается у цьому, щоб отримати серію комплементарных молекул.

ДНК, різняться за довжиною одне підставу. Насправді, проте, визначення нуклеотидної послідовності протяженных молекул ДНК є дуже трудомістку задачу. Існує дві основні методи секвенування: хіміческое — метод Максама-Гильберта і дидезоксисеквенирование — метод Сэнджера. У першому випадку використовують хімічне розщеплення ДНК за одним підставі, у другому — синтезують потрібну ланцюг ДНК in vitro, специфічно зупиняючи синтез на заданому основании.

Частіше при секвенировании використовують метод Сэнджера, оскільки він понад надійний та простий у виконанні. Принцип данного методу показаний на рис. 1.8. У першому етапі ДНК денатурируют, щоб отримати однонитевые молекули. Потім додають секвенирующий праймер — штучно синтезовану олигонуклеотидну послідовність, комплементарную визначеноному ділянці вихідної молекули ДНК. Створюють умови для гинувридизации праймера, тобто для освіти двухцепочечного ділянки, і ініціюють синтез ДНК, додаючи в реакційну суміш ДНК-полимеразу і трифосфаты — dATP, dCTP, dGTP і dTTP, одна з яких є радіоактивним. Синтез ведуть у подружжяпровина паралельних пробірках, до кожної зі яких додають одне із специфічних дидезоксинуклеотидов чи терминаторов.

— ddATP, ddCTP, ddGTP чи ddTTP. При вбудовування ddNTP цього разу місце відповідного нуклеотида синтез ДНК прекращается.

Отже, у кожному з пробірок отримують набір розрізняющихся за довжиною радиоактивномеченых фрагментів ДНК з однією і тим самим специфічним для даної пробірки дидезокситерминатором на кінці молекули. Після одночасного электрофоретического поділу цих фрагментів на чотирьох сусідніх доріжках і радиоавтографии, розмір синтезованих фрагментів то, можливо визначено, отже, і визначено локалізація дідезоксинуклеотидов і Порядок відповідних нуклеотидів в вихідної молекулі ДНК (Рис. 1.9). На кожному секвенирующем гелі може бути оцінена первинна послідовність всего близько 500 пар підстав. У його початковому варіанті його є дуже важким і дорогостоящим.

Досить зауважити, що ціна приховує жодної ланки (кроку) у ланцюзі ДНК в Міжнародної Програмі «Геном людини «ще кілька років тому я оцінювався у 1 $.

Як модифікацій методу Сэнджера використовують передварительное клонування ДНК в вектори, сконструйованих з урахуванням фага M13, щоб одержати протяжних однонитевых ділянок ДНК, які можна безпосередньо секвенированы без денатурації і праймирования. Дуже ефективної оказалась система векторів mp8 і mp9, дозволяють вести сиквенс одовременно в обох напрямках і прочитувати ділянки більши протяжності. Інтенсивно розробляється методологія автоматичного ДНК секвенування. Особливо перспективною масової секвенування в автоматичному режимі оказалось застосування мічених різними флюорохромами дидеоксинуклеотидів. У цьому вся варіанті кожному з нуклеотидів соответствует свій колір смуги в гелі, який легко враховується автоматично. Цей метод знайшов особливо широке використання у реалізацію програми Геном людини. По останніх даних, розробка автоматичних секвенаторов дозволила знизити вартість приховує жодної ланки до 0,5 $ і різко підвищити эффективность цього процесу. Так, на 30 автоматичних секвенаторах фірми Applied Biosystems за тиждень роботи у 1994 г. можале було просеквенировать до 1 млн пар оснований.

Останніми роками активно розробляються принципово нові, ефективніші й економічні методи секвенирования. Особливо перспективною на сегоднешний день представляется метод секвенування шляхом гібридизації досліджуваної послідовності ДНК з набором олігонуклеотидів, так называемой олигонуклеотидной матрицею (Мирзабеков, 1990; Барський і др., 1994; Southern, et al, 1992). Найбільш зручними цієї мети є набори матриць — чіпи, в осередках яких пришиті (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть даного подхоі у тому, що пришивается набір всіх можливих варіантів перестановок з 4-х стандартних нуклеотидів (А, Г, Ц, Т) опреділеної довжини, причому у разі октануклеотидов кількість можливих варіантів нуклеотидів становить 65 536. Секвенируемый фрагмент ДНК мітять радіоактивним фосфором і гибридизуют з октануклеотидной матрицею. Фрагмент ДНК гибридизуется тільки з октануклеотидами, послідовності яких комплементарны його ділянкам. Отже, визначається набір всіх можливих октануклеотидов, присутніх в исследуемом фрагменті ДНК. Після цього, з допомогою спеціальної комп’ютерного опрацювання впорядковується розташування цих приблтамеров в досліджуваному фрагменті ДНК. Цей перспективний метод дозволяє значно прискорити час секвенування з допомогою автоматизації процесса.

1.7 Полімеразна ланцюгова реакция.

Донедавна гібридизація з ДНК-зондами і клонирование були єдиними способами пошуку це й виділення специфічних геномних чи к-ДНК-овых последовательностей.

ДНК з метою їхнього дослідження. А про великий трудомісткості цих методів, вони теж мають ряд принципиальных недоліків, і обмежень. По-перше, досліджувані фрагменти значно переважають за довжиною ДНК-зонды і слишкому великі для прямого молекулярного аналізу. Кінці цих послідовностей неможливо знайти обрані довільно, оскільки визначаються наявністю відповідних рестрикционных сайтів в исследуеммой молекулі ДНК. По-друге, для проведения успішної рестрикції і гібридизації потрібне неабияке кількість добре очищеної высокомолекулярной геномної ДНК.

(щонайменше 10 микроГ однією реакцію). Стільки ДНК зазвичай отримують з 3- 5 мл крові. Часто на цю кількість оказывается надто великою, з урахуванням, йдеться дітей і тяжкохворих людях. З іншого боку, необхідність немедленного використання зібраної крові виділення ДНК або збереження до використання за -20 З утрудняє исследование нетранспортабильных пацієнтів чи родичів, проживающих на віддаленому відстані від дослідницьких центрів. По-третє, для геномної гібридизації, зазвичай, необходимы радіоактивні ДНК-зонды із високим удільної активностью, щонайменше 10!8−10!9 имп./мин/мкГ., причому повинно бути використані протягом дуже короткого періоду після їх приготування. З іншого боку, роботу з радіоактивним матеріалом вимагає дотримання необхідної техніки безпеки і наличия спеціально обладнаного ізотопного блоку, що можливо лише декому діагностичних центрів. По-четверте, необходимость тривалої експозиції автографів значно задовільнолиняє час результатів, що також обмежує використання методів блот-гибридизации для пренатальної діагностики плоду, специфіка якої багато чому визначається терміном беременности.

Запропонований в 1983 г. американським исследователем.

Каррі Муллисом, удостоєним при цьому винахід Нобелівської премії в 1993 р., альтернативний метод аналізу геномної ДНК — метод полімеразної ланцюгову реакцію (ПЛР), з’явився епохальним відкриттям молекулярної біології ХХ століття. Метод ПЛР чи специфічної амплификации ДНК дозволяє вибірково синтезировать in vitro відносно невеликі ділянки ДНК, довжиною від кількох основних десятків за кілька сотень пар нуклеотидів, рідше до 1000 — 2000 п.о., використовуючи як матриці будь-які зразки ДНК, містять амплифицируемую последовательность.

Необхідною передумовою проведення ПЛР є знання нуклеотидной послідовності амплифицируемой області ДНК, оскільки специфічний вибір цієї ділянки здійснюють шляхом гібридизації матричної ДНК з цими двома штучно синтезированними праймерами — олигонуклеотдными последовательностями.

ДНК, довжиною, зазвичай, від 15 до 30 п.о., комплементарними 3 «- кінців амплифицируемого ділянки на значеннєвий і антисмысловой нитках ДНК, відповідно. Отже, відстань між праймерами определяяет довжину синтезованих молекул. У качестве матриці для синтезу можна використовувати будь-який тип.

ДНК — геномная ДНК окремих індивідуумів різних видів проі эукариот; ДНК, виділена зі культур клітин, бактериальных клонів, бібліотек генів або з інших джерел. Для проведення специфічної амплификации непотрібен великих кількостей матричної ДНК й у принципі, досить навіть однієї молекули (Li et al., 1988). Успіх з розробки методу ПЛР значною мірою пов’язаний із використанням як фермента, забезпечує синтез ДНК, термофильной ДНК полимеразы, виділеної з бактерій, що у гарячих джерелах, і зтому стійкою до дії високих температур (Kogan et al.,.

1987).

Принципова схема полімеразної ланцюгову реакцію покизана на Рис. 1.10. У першому етапі досліджувана двухнитевая матрична ДНК перетворюється на однонитевую форму шляхом її нагревания протягом декількох хвилин до температури, перевищующей +95 — +98 З. Подальша схема проведення ПЛР є простою й у чергуванні циклів (1) гібридизації чи отжига ДНК з праймерами, (2) синтезу послідовності, комплементарної матричної ДНК, і (3) денатурації утворившишихся двухнитевых структур. При гібридизації, достигаемой з допомогою зниження температури реакційної суміші до +30 — + 50.

З, відбувається освіту двухнитевого ділянки ДНК у суворо специфічних областях, комплементарных праймерам. При темпіратуре, оптимальної до роботи ДНК-полимеразы — +60 — +70 З, починається синтез ДНК у бік 5 «- 3 «з двухнитевого ділянки, освіченого праймерами. Потім за нагріванні розчину приблизно до +80 — +90 З синтез припиняється і двохнитевой ділянку між матричними і знову синтезованими молекулами ДНК розплавляється (денатурирует). У першому циклі олигопраймеры гибридизуются із вихідною матричної ДНК, а й затим, у наступних циклах і із знову синтезованими молекулами ДНК в міру їхнього накопичення в розчині. У цьому случаї синтез ДНК закінчується не за зміни температурного режиму, а, по досягненні ДНК-полимеразой кордону амплифицированного ділянки, що визначає, в кончном рахунку, розмір знову синтезованого ділянки ДНК з точністю до одного нуклеотида.

Отже, при кожному циклі відбувається двухкратное збільшити кількість синтезованих копій обраного для амплификации ділянки ДНК і змістом продуктів амплификации в розчині наростає в геометричній прогресії. Кожна з процедур циклу визначається двома параметрами — температурою реакції і його тривалістю, мінливою в диапозоне від десятков секунд до 1 — 3 хвилин, отже повний цикл триває від однієї до кілька хвилин. За 25 — 30 циклів число синтезированных копій ДНК сягає мільйонів. ПЛР зазвичай проводять у автоматичному режимі, використовуючи при цьому спеціальні прилади — термоциклеры чи амплификаторы ДНК.

Такий прилад дозволяє ставити потрібну кількість циклів й вибирати нам оптимальні часові й температурні параметри кожної процедури циклу з великої і найчастіше безупинної шкали можливих варіантів. У технічному виконанні ПЛР проста. Усі компоненти реакції - матричну ДНК, олигопраймеры, суміш трифосфатов і термофильную ДНК полимеразу добавляют в специфічний буфер (часто одномоментно), нашаровують невеличкий обсяг вазелінового олії запобігання растзлодія від засихання, потім поміщають пробірку з реакційної сумішшю в автоматичний термоциклер і вибирають необхідну програму циклічною зміни температури і тривалості каждого кроку реакції. Загальний обсяг реакційної суміші, зазвичай, становить від 10 до 50 — 100 микролитров. Вибір оптимального режиму роботи визначається довжиною і специфічністю амплифицируемого ділянки. Слід сказати, що, реально, кожної полімеразної реакції в звисимости від типу праймеров, довжини амплифицированного фрагмента, особливостей його первичіншої нуклеотидної структури, і навіть від типу використовуваної термофильной ДНК-полимеразы оптимальні режими температури і склад амплификационной суміші може істотно варіювати і часто підбираються эмпирически.

З допомогою ПЛР можна безпосередньо досліджувати місця локалізації гаданих мутацій чи поліморфних сайтів, і навіть вивчати наявність будь-яких інших специфічних особливийностей ДНК. Підбір системи олигопраймеров виробляють виходячи з аналізу нуклеотидної послідовності амплифицируемого ділянки. Розроблено різні варіанти автоматического пошуку послідовностей ДНК, використання которых як праймеров оптимізує процедуру амплификации специфічного ділянки геномної ДНК. А, щоб гибридизация проходила суворо специфічно, праймери нічого не винні зітримати повторюваних послідовностей ДНК. Ми вже отмечали, що з проведення ПЛР досить мінімального количества ДНК, до однієї молекули. З іншого боку, різні органічні компоненти клітин, такі як білки, ліпіди, углеводы, фрагменти клітинних органел чи мембран помітно не перешкоджають процесу амплификации. Тож у ролі джерела матричної ДНК можна використовувати будь-який, навіть деструктурированный біологічний матеріал, зберіг у собі досить повний набір фрагментів вихідних молекул ДНК. Для специфічної амплификации поруч із очищеноіншої ДНК використовують висушені на фільтрувальної папері плями крові, невеликі шматочки тканин, наприклад, такі як ворсини хориона, смывы з ротовій порожнині, цибулини коріння волосся, лантухтури клітин та сливи середовища з клітинних культур, містять не прикрепившиеся і дали зростання клітини, соскребы з цитогенетических препаратів і що особливо дивовижно, отриманоные при паталогоанатомическом аналізі та довго хранившиеся фіксовані тканини (Higuchi, R. et al., 1988). Більше докладних відомостей про постановку ПЛР можна отримати ряді спеціальних посібників і инструкций.

Є різноманітні модифікації ПЛР, які используются залежно від конкретних цілей проведення реакції чи то з характеру наступного молекулярного аналізу амплификатів. Так, для трудноамплифицируемых ділянок ДНК (утримуючищих різні повторювані послідовності чи незвичні структурні елементи), соціальній та тому випадку, коли матричная ДНК є у слідових кількостях, ПЛР проводять у два раунду, використовуючи як матричної ДНК другого етапу амплификации, чи як ще говарят при доамплификации, продукти ПЛР, синтезовані у першому раунді. Часто у випадках підвищення специфічності праймирования використовують систему, про вмонтованих (nested) праймеров, тобто за доамплификации як праймеров вибирають послідовності, локалізовані всередині амплифицируемого у першому раунді ділянки ДНК.

Нерідко зручно проводити мультиплексную ПЛР, тобто одночасну амплификацию кількох ділянок матричной ДНК. Можна отримувати мічені продукти ПЛР, додаючи в реакційну суміш мічені трифосфаты. Особливої уваги зазлуживает можливість проведення ПЛР з молекулами кДНК.

За підсумками цієї реакції розроблено методи аналізу експресії генів й отримання великих кількостей кДНК. До речі, що реакцію амплификации можна лише у растворах, а й безпосередньо на хромосомних препаратах, причому у разі використання мічених нуклеотидів продукти амплификации будуть гибридизоваться і виявляти комплементарные їм ділянки ДНК на хромосомах (метод PRINS — polymerase reaction in situ). До нашого часу доступними амплификации були ділянки ДНК, які перевищують за довжиною 5 kb. Останнім часом, завдяки внесення низки кардинальних інтерфейсвершенствований (особливий добір праймеров, використання сразу двох різних ДНК полимераз, трицинового буфера, спеціального температурного режиму полимеразных циклів), можливо проведення амплификации фрагментів ДНК, що сягають 35 kb. Зокрема, в такий спосіб вдалося амплифицировать плазміду зі вставкою 8.5 kb, рівної цілому геному вірусу HIV 1 (Cheng et al., 1994). І це ще межа. Надалі ми неоднократале повертатимемося до опису різних модифікацій ПЛР, тому що цей метод з права стала одна з основних в молекулярной діагностиці спадкових хвороб (Erlich, 1993;

Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).

Можливість дуже точного і специфічного вибору участка ДНК для амплификации, невеликі розміри синтезованих молекул, їх дуже багато черезвычайно полегшують молекулярный аналіз продуктів ПЛР. Зазвичай, амплифицированную.

ДНК можна безпосередньо поспостерігати на що проходить ултрофиолеті, у вигляді червоною смуги після электрофоретического концентрирования і звичайного фарбування гелю этидиумом бромидом.

З іншого боку, можлива ідентифікація цих молекул шляхом блот гібридизації зі специфічними олигонуклеотидными зондами.

За наявності сайтів рестрикції в амплифицированных участках.

ДНК після їх опрацювання эндонуклеазами і електрофорезу количество і становище забарвлених смуг на гелі змінюється відповідно до становищем цих сайтів (Рис. 1.11). Шляхом електрофорезу можуть бути встановлені невеликі відхилення у розмірі синтезованих молекул, які виникають з допомогою делеций чи инсерций кількох нуклеотидів в вихідної матричной молекулі ДНК; конформаційні зміни у однонитевых молекулах ДНК, які під час заміні підстав; і навіть структурні зміни у дуплексах між нормальними, і мутантными варіантами амплифицированных фрагментів ДНК. І, накінець, можливо визначення повної нуклеотидної последовательности синтезованих молекул з ідентифікацією всіх мутаций в досліджуваному районі матричної ДНК (див. Главу IV).

Розроблено варіанти ПЛР, у яких синтезуються преимущественно однонитевые фрагменти ДНК, що у последуюшем значительно полегшує їх секвенування. Надалі ми докладніше розглянемо методи генотипирования мутацій з помощью.

ПЛР, дозволяють виробляти повний молекулярний аналіз певних ділянок ДНК в окремих індивідуумів. У цьому зайвими візуалізації малих кількостей ДНК путим їх гібридизації з міченими геномными чи кДНК-зондами.

Не означає, звісно, що методи блот гібридизації і клонування втратили своєї актуальності. Без їх использования неможлива молекулярна ідентифікація генів, предшествующая розробці методів молекулярної діагностики з использованием ПЦР.

ГЛАВА VI.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ АНАЛІЗ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНОВ.

Розділ 6.1 Диференційна активність генів, вибір адекватних біологічних моделей.

Молекулярна ідентифікація гена, порушення роботи которого призводить до розвитку спадкового захворювання, создает передумови задля її подальшого докладнішого аналізу генетических і біохімічних основ патогенезу і розробки базі цього найефективніших методів лікування. Початкові етапи рішення поставленого завдання містять у собі иссследование механізмів тканеспецифической експресії і регуляції активності генів у нормальних клітинах, оцінку клінічного висловлювання різних типів порушень гена, виявлення первичного біохімічного дефекту, і навіть зіставлення молекулярных основ роботи генів у нормальних і мутантних клетках.

Природно, що у різних тканини організму экспрессируется в повному обсязі, а лише певні групи генов.

Виняток припадає лише звані гени домашнього мозяйства (house-keeping genes), генопродукты яких обеспечивают життєдіяльність всіх типів клітин (см. Главу II). По дуже орієнтовним оцінкам в тканинах ссавців і чоголовека працюють у середньому близько 2−3% всіх генів, у клітинах печінки — основний біохімічної лабораторії організму — около 5%, тоді як і клітинах мозку — приблизно 9−10% (Корочкин,.

1977). Це означає, що у різних соматичних клітинах эукариот транскрибується від 5 до 20 тисяч генів (Льюин,.

1987). Значна частина коштів контролюються ними білків необходмитрик задля забезпечення життєдіяльності самих клітин. У процессе онтогенезу та клітинної диференціювання у різних тканини організму відбувається виборча активація багатьох інших специфічних генів, що, зрештою, обумовлює значні міжклітинні розбіжності у наборі білків й у скорости їх синтеза.

Контроль генної активності здійснюється з допомогою дифференциальной транскрипції і процесингу РНК у клітинних отрутарах, різної стабільності мРНК в цитоплазмі, виборчої трансляції мРНК. Диференційна експресія генів, кінцевим результатом якої є синтез функціонально активного білка, передбачає як адекватну регуляцію генної активності, а й повноцінність усіх наступних етапів, включаючи сам білковий продукт, його стійкість, спроможність до посттрансляционным модифікаціям, правильну локалізації і коректне взаємодію з іншими компонентами клітини. Решающее значення для успішного аналізу від цього складного комплексу має вибір адекватних біологічних моделей, попозов і цілеспрямоване конструювання яких цілком самостійну наукову задачу.

Найбільш доступними модельними системами для аналізу експресії генів in vitro є культури клітин. Для клонирования, генноинженерного маніпулювання, спрямованого запровадження сайт специфічних мутацій, отримання великого доличества клонованих послідовностей ДНК, специфических молекул мРНК, і навіть білкового продукту гена зазвичай використовують генетично добре вивчені прокариотические системи (Хеймс, Хіггінс, 1987). Для дослідження процесів трансляції, посттрансляционных модифікацій білка, його внутриклеточной локалізації і функціонування частіше використовують культури клітин эукариот і зокрема, специфічні лантухтури клітин людини. Особлива роль вивченні початкових цязаговорили українською у розвитку патологічного процесу, обумовленого присутністю генних мутацій, соціальній та розробці терапевтических методів, включаючи генноинженерную корекцію метаболического дефекту, належить культурам мутантних клітин. Це може бути первинні чи перевиваемые культури клітин, підлозіченные зі специфічних тканин хвору людину, або выделенні з тканин лінійних тварин, службовців генетичної моделлю спадкового заболевания.

Ідентифікація гомологичных генів у експериментальних тварин у часто значно полегшує і прискорюють дослідження функціональної активності нормальних і мутантных генів людини. Велика роль вивченні молекулярних механизмов розвитку патологічних процесів in vivo принадлежит генетичним лініях тварин. Це може бути лінії, полученные внаслідок відбору спонтанно що виникли чи индуцированных мутацій, і навіть штучно сконструйовані моподіли з урахуванням трансгенних тварин, в геном яких запроваджено чужорідний ген чи фрагмент ДНК. Розглянемо основні экспериментальные підходи, використовувані для аналізу експресії генов.

Розділ 6.2 Аналіз регуляторних елементів гена, ізоляція як дослідження мРНК, штучні транскрипционные системы.

Регуляція експресії генів у ланцюжку ДНК — РНК — білок може здійснюватися в різних молекулярних рівнях. Відповідно до цим дослідження диференціальної активності генів у різних типах клітин та тканин включають оцінку роботи контролюючих елементів генів, аналіз молекул РНК всіх етапах від появи первинного транскрипта до зрілої мРНК вивчення відповідного білкового продукту, включаючи його процессинг (дозрівання), внутрішньоклітинну локалізацію, тканеспецифічне розподіл .

Дослідження регуляторних цис-действующих елементів генома, як-от промотори, инхансеры, ділянки ДНК, придушующие транскрипцію, є складовою аналізу молекулярной структури будь-якого гена. Ідентифікацію таких елементів проводять із використанням різноманітних сучасних методів молекулярної генетики. Зокрема, послідовності ДНК в.

5 «- фланкирующей області гена, відповідальні тканеспецифическую індукцію генної активності, може бути локалізовано шляхом дослідження транскрипції у різних лініях клітин під час введення у яких генів з штучними делециями їх ДНК. Для оцінки активності ідентифікованих регуляторных послідовностей їх зливають з чужорідними добре вивченими неиндуцибельными клонованими генами, так называемыми «репортерами ». Такі генетичні конструкції у складі векторних послідовностей вводять у культивируемые клітини эукариот і спостерігають за зміною рівня експресії. Як «репортера «часто використовую ген хлорамфеникол-ацетил-трансферазы (CAT-ген), що у естественних умовах экспрессируется лише у клітинах прокариот.

Сам фермент (CAT) має високої активністю, що позволяет як легко виявляти її мінімальні кількості у клітині, але й високої точністю проводити кількісну оцінку. На підвищення чутливості аналіз експресії химірних генів часто проводять у культурі фібробластів нирок африканської зеленої мавпочки (COS-клетки). Ці клітини модифицированы в такий спосіб, що мені після трансфекції провиходить ампліфікація копій сконструйованих належним чином эписом (внехромосомных генетичних конструкций (див. Главу X), що веде до чогось великого посиленню сигналов експресії запроваджених генів (трансгенів). Перенесення генов.

(трансгеноз) може бути здійснений на рівні цілого организма, зокрема, зиготи. Отримані внаслідок подібних маніпуляцій трансгенні тварини можуть бути і использованы як модельної системи для аналізу механізмів тканеспецифической активації генів in vivo.

Матрична РНК є найзручнішим обьектом вивчення регуляції транскрипції генів і посттранскрипционных модифікацій РНК. Тотальна клітинна РНК сотоит на 90 — 95% з рибосомальных і транспортних РНК, тоді як частка транслируемых чи poly (A)+ РНК вбирається у 5% (Льюин, 1987). У цьому, концентрація РНК-транскриптов індивідуальних генів серед усіх молекул мРНК, загалом, коливається не більше от.

0.01% до 0.001% (Гайцхоки, 1978). Тож виявлення індивідуальних типів мРНК потрібно використовувати високочутливі методи. Звичайним методом ідентифікації мРНК на тихорєцькому і клітинному рівнях є гібридизація in situ.

РНКчи ДНК-зондов з молекулами мРНК на гістологічних зрізах (Хаффнер, Уиллисон, 1990). Як ДНК-зондов використовують клоновані послідовності кДНК і синтетические олігонуклеотиди. Після інкубації мічених зондів на цитологічних препаратах із наступною ретельної відмиванням несвязавшихся молекул становище комплементарных РНК-последовательностей у клітинах визначають радиоавтографическими, чибо у разі биотинового мечения — імуногістохімічними методами. Оптимальні умови гібридизації дають можливість як виявляти присутність специфічних мРНК, а й определити їх внутрішньоклітинну локалізацію (Манк, 1990; Хаффнер,.

Уиллисон, 1990; Boehringer, Mannual, 1994).

Аналіз індивідуальних РНК включає ізоляцію з тканин пулу неушкоджених біологічно активних мРНК і идентификацию у тому числі специфічних молекул шляхом застосування разособистих варіантів ДНК-РНК гібридизації. Для генів із високим рівнем транскрипції може бути придатні дот чи слот блоты.

(см. Главу I). Коли джерелом РНК служать клітини, які можна отримати було багато, використовують цитоплазматический дот-блот. У цьому цілі клітини лизируют, і фіксують безпосередньо за тими мембранах, у яких проводять гібридизацію. Значно великий чутливістю має, так званий Northern blot (нозерн-блот) — гинувридизация з ДНКзондами на фільтрах попередньо сконзосереджених і фракционированных шляхом електрофорезу молікул РНК (Sambrook et al., 1987). Електрофорез проводять у агарозе з додаванням формальдегіду, денатурирующего РНК. У умовах швидкість просування молекул РНК через гель перебуває у логарифмічною залежність від довжини последовательности, що дозволяє точно визначити розмір РНК транскрипта. Переважна більшість РНК на гелі представленій у вигляді двох домінуючих бэндов, відповідних двом типам рибосомальной РНК — 28S і 18S. Усі молекули мРНК сконцентровано у погано различимой, слабко забарвленою області гелю, у якій окремі типи мРНК можуть бути встановлені лише шляхом гибридизации з відповідними ДНК-зондами. Нозерн-блот має той перевагу, що з электрофорезе можна розділити молекулы РНК, дають перехресну гібридизацію з ДНК-зондом.

З іншого боку, характер электрофоретического поділу позволяет візуально оцінити якість ізольованій РНК. При низьких концентраціях специфічних мРНК чи тому випадку, коли ДНК-зонды дають перехресну гібридизацію коїться з іншими компонентами (не мРНК), проводять збагачення ізольованій тотальної РНК транслируемыми мРНК через відбір на колонках фракцій, містять поли-A «хвости ». І тому выделенную.

РНК пропускають через коротку колонку з пришитими поли-T олигонуклеотидными послідовностями і високої концентрацией солей в буферном розчині, те щоб молекули мРНК, зіякі тримають полиA «хвости », затримувалися на колонці. При зниженні концентрації солей в буфері відбувається расплавление.

A-T дуплексов і звільнення молекул мРНК. У такий спосіб частка цих молекул у певних сольових фракціях може бути збільшена на два порядку. Звісно, поли-A селекція застосовна у випадках, коли є досить багато тотальної РНК. Іншим методом на дослідження структури РНК транскриптів є S1-анализ. І тут ДНК-РНК гинувридизацию ведуть у розчині, куди й додають S1 нуклеазу для перетравлення однонитевых несвязавшихся молекул як ДНК, і РНК, після чого проводять электрофоретическую очищення дуплексов, які потім элюируют з гелю на подальше аналіза (Sambrook et al., 1989). Цей метод дуже зручний аналізу стартових сайтів і трьох «-кінців генів, визначення напрями транскрипції і картирования интронов.

Рівень мРНК у клітині визначається кількома кинетическими параметрами — швидкістю первинного синтезу, эффективностью процесингу РНК-транскриптов і періодом полураспатак зрілих молекул мРНК. Останній параметр визначають по дінамике зникнення мРНК після додавання до клітинам актиномицина D, специфічним чином супрессирующего транскрипцию.

Дослідження механізмів транскрипції і процесингу переклвичных РНК-транскриптов проводять in vitro з допомогою штучно сконструйованих транскрипционных систем (Manley et al., 1986; Dignam et al., 1983;

Gutierrez-Hartmann et al., 1987; Хэймс, Хиггинс, 1987). І тому може бути обрані два різних підходу. У першому випадку ізолюють ядра і як транскрипционной матриці використовують неушкоджений хроматин. Синтез РНК проводять із додаванням усіх реагентів і зокрема, трифосфатів, одного з яких (зазвичай, у урацил) вводять зарадиоактивную мітку. У цьому знову синтезовані молекули РНК виявляються міченими. Вибір специфічних молекул РНК с. проводят шляхом ДНК-РНК гібридизації, проте, на відміну раніше описаних методів аналізу мРНК, використовують немеченые кДНК-зонды, попередньо завдані на фільтри. Великим гідністю цієї транскрипционной системи є його максимальне наближення до природних процесам. При другому підході транскрипція ведеться від клонованих фрагментов ДНК, а ядерні екстракти є джерелом ферментів і регуляторних белков.

Розділ 6.3 Аналіз трансляції, ДНК-экспрессионные системы.

Традиційні методи аналізу регуляції трансляції і посттрансляционных модифікацій білків засновані на использовании модельних систем, що становлять цитоплазматические позбавлені мРНК безядерные екстракти клітин, содержащие рибосомальный апарат, транспортні РНК, набір аминокислот і ферментів, необхідні трансляції і процесингу білків (Хэймс, Хіггінс, 1987; Клеменс, 1987). Після добавления до такої системи специфічної мРНК відбувається синтез відповідної полипептидной ланцюга in vitro. При запровадження мічених амінокислот до системи знову синтезовані білки після электрофоретической очищення може бути идентифицированы шляхом радиоавтографии або імунологічними методами, за наявності відповідних антитіл (Клеменс, 1987). Проте, для великої кількості моногенных спадкових заболеваний первинний біохімічний дефект невідомий, а следовательно, не ідентифіковані і мРНК транскрипти. Биохимическое вивчення багатьох білків утруднено через їх мінорного забезпечення і відсутності ефективних методів виділення, тож очищення. Остання обставина значною мірою відноситься до нерасворимым білкам, асоційованим з мембранными структурами клеток.

ДНК-экспрессионные системи, тобто клітинні культуры, синтезирующие чужорідні білки, є дуже сильним засобом аналізу структури, функції і синтезу белков.

(Sambrook et al., 1989). Такі системи конструюють на основе экспрессионных векторів, які у собі сільные промотори і регуляторні послідовності, обеспечивающие високий, але водночас регульований рівень експресії. Які Кодують послідовності чужорідних генів инсертируют (вставляють) з допомогою відповідних генно-инженерных прийомів до області дії цих промоторів. Конечале, такі повинні містити і трансляційні сигнали, зокрема, сайти зв’язування рибосом, щоб забезпечити роботу рибосомального апарату клітин хазяїна. У окремих випадках экспрессионные вектори вводять у мутантні по протеазным генам клітинні культури, аби запобігти деградацію чужорідних білків в клетках.

Існує три типу экспрессионных систем — бактериальные, сконструйовані зазвичай з урахуванням E. coli, дріжджові і экспрессионные культури клітин ссавців. Кожна з цих систем має переваги та недоліки. Бактеріальні системи найбільш зручними є для клонування, мають високий рівень експресії (до 1−2 грам білка на літр культури) та його використовують, зазвичай, для великої кількості чистого білка, який буде необхідний отримання антитіл або заради фармацевтичних цілей. Зручні також ці системи для введения змін — у різні райони полипептидной ланцюга шляхом сайт-направленного мутагенезу в нуклеотидної послідовникности чужорідної ДНК. Набуття та дослідження таких «мутантных «білків дуже важливо задля оцінки функціональної значимости різних ділянок белка.

Рівень експресії чужорідних білків в дріжджових клетках вдвічі, а клітинах ссавців вдесятеро нижче, ніж у бактеріальних. Проте, в бактеріальних клітинах відсутні ферментативные системи, щоб забезпечити процессинг эукариотических білків. Тому эукариотические системи зручніше використовуватиме вивчення посттрансляционных модифікацій білка — гликозилирования, тобто приєднання до полипептидной ланцюга вуглеводневих залишків; скручування білка з образованием третинної структури, часто, з допомогою виникнення дисульфидных зв’язків; і N-концевых модифікацій, стабилизирующих структуру білка. У ДНК-экспрессионных системах то, можливо синтезовано досить багато білка, щоб отримати її в кристалічною форми і досліджувати просторову структуру і функціональне призначення окремих доменов.

(Хэймс, Хіггінс, 1987).

Використання экспрессионных бібліотек для ізоляції додирующих послідовностей гена розглядалося раніше (см.

Глава II). Після секвенування кДНК можна, з генітического коду, прогрозировать амінокислотний склад білка і «зробити компьюторный пошук у банку даних гомологичных послідовностей у складі білків з роботи вже відомої структурою і функціями. Виявлення родинних білків, близьких зі свого полипептидному складу, значно прискорює і облег сподівається подальший молекулярний аналіз функціонування исследуемого білка у клітині. Аминокислотная послідовність білка дозволяє прогнозувати його третинну структуру, ідентифікувати домени, оцінювати функціональну значимість цілого білка і окремих його компонентів. Важливим кроком практичним наслідком цих даних є й возможность отримання антитіл до суворо специфічним ділянкам білка. І тому можна використовувати два підходу — биохимический і молекулярно-генетичний. У першому випадку для иммунизации використовують штучно синтезовані поліпептиди, які пришивають до білкової молекуле-носителю (гаптену).

Розміри таких полипептидов, зазвичай, становить 30 аминокислот — вони можуть бути дуже великими через високе стоимости і трудомісткості синтезу довгих молекул. При другому підході экзонные ділянки гена инсертируют в экспрессионный вектор до області, кодирующиую селектируемый білок. У результаті експресії такий конструкції отримують злитий білок, у якому поруч із амінокислотною послідовністю селектируемого маркера міститься певний фрагмент исследуемого білка. Цю химерну молекулу й використовують для імунізації тварин і звинувачують отримання моновалентных чи моноклональних антитіл. За наявності антитіл можна буде застосувати різні їммунологические подхооды для аналізу тканеспецифического і внутрішньоклітинного розподілу білка, дослідження його модификаций, і навіть щоб одержати нативного білка в препаративных количествах.

Cледующим кроком по дорозі аналізу молекулярних механізмів регуляції експресії гена є ідентифікація тих нарушений у структурі, локалізації і активності молекул мРНК й білків, які виникають внаслідок генетичних мутацій. Ми згадували про величезному значенні культур мутантних клітин для досліджень. Проте, багато патологічні процеси, які у організмі хворого, неможливо знайти досліджені in vitro. З іншого боку, можливості получения необхідної кількості клітин та тканин пацієнта і испытанія in vivo різних схем лікування значно ограничены.

Тож багатьох спадкових хвороб ефективність вивчення основ патогенезу істотно залежить від наявності адекватних біологічних моделей. Способи конструирования таких моделей докладно викладені у Главі YIII.

ГЛАВА II.

ГЕНОМ ЛЮДИНИ, СТРУКТУРА ГЕНОВ.

Розділ 2.1. Визначення геному та її основних элементов.

Термін геном використовується для позначення повної генітической системи клітини, визначальною характер онтогенетического розвитку організму, що спадкову передачу у низці поколінь усіх її структурних і функціональних признаков.

Поняття геному може бути застосована до таксономической группе, виду, окремої особини, клітині, микроорганизму чи вірусу. Так казати про структурі геному эукариот і прокариот, порівнювати геноми різних видів, вивчати особливості будівлі геному у конкретних індивідуумів чи ознайомитися з зменениями, що відбуваються в геномі специфічних клітин на процесі їх онтогенетической диференціювання. Часто геном окреслюється генетична інформація, ув’язнена в молекулах ДНК однієї клітини. Проте, такі факти, як відсутність зв’язок між кількістю ДНК для гаплоидный геном і таксономическим статусом видів, і навіть багаточисельні приклади існування величезних відмінностей у утримуючинді ДНК між близкородственными видами (так называемый.

" С-парадокс ") свідчать, що зовсім в усіх ділянки ДНК пов’язані з інформаційними функціями. Поняття генома і ДНК значною мірою тотожні, оскільки основні засади організації та функціонування геному целиком визначаються властивостями ДНК. Притаманні цим молекулам потенційні можливості практично необмеженого структурного розмаїття визначають розмаїття світу живих істот, на рівні міжвидових, і індивідуальних различий у межах виду (Баєв і др., 1990; Ратнер, 1985).

Процес еволюції і диференціювання окремих видів, зазвичай, супроводжувався накопиченням змін — у структурі генома. Ідеться, передусім, таких параметрів, як локализация і характеру упаковки ДНК у клітинах; кількість ДНК, приходящееся на гаплоидный геном; типи, співвідношення і функции які кодують і некодирующих нуклеотидних послідовникностей; регуляція експресії генів; межпопуляционная вариабильность і филогенетический консерватизм первинної структуры геному. У межах виду основні параметри геному досить постійні, а внутривидовое розмаїтість обеспечивается з допомогою мутаційної мінливості, тобто випадання, вставки чи заміни нуклеотидів на порівняно невеликих ділянках ДНК. Найчастіше такі зміни стосуються неэкспрессируемых елементів геному (интронов, псевдогенов, межгенных спэйсерных ділянок ДНК і т.д.).

Геноми эукариот, по суті, можна як мультигеномные симбиотческие конструкції, які з облігатных і факультативних елементів (Golubovsky, 1995). Основу облигатных елементів становлять структурні локусы, количество і місцезнаходження що у геномі досить постоянно.

Присутність у хромосомах деяких видів повторюваних ДНК, амплифицированных ділянок, ретровірусних послідовникностей, псевдогенов, як і його присутність серед клітині эписом, ретротранскриптов, ампликонов, додаткових B-хромосом і самеособистих цитосимбионтов (вірусів, бактерій, найпростіших) является не суворо обов’язковим, їх кількість і становище може значно варіювати, тобто ці елементи є факультативными. У той самий час участь факультативних элементов в спадкової передачі ознак, у формуванні мутационной мінливості й у еволюційних перетвореннях відов безсумнівно доведено. З іншого боку, існує безперервний перехід від самих станів решти з допомогою инсерции экстрахромосомных ДНК в хромосоми і вибудовування транспозоноподобных мобільних елементів з хромосом. Отже, попри значну різницю факультативних последовательностей від облигатных характером основних информационных процесів (реплікації, транскрипції, трансляції і сегрегации), вони також має розглядатися, як найважливіші еліменти генома.

Зупинимося тепер детальніше на основні принципи організації геному людини. У кожній диплоидной клітині з 46 хромосомами міститься близько 6 пікограм ДНК, а загальна довжина гаплоидного набору з 23-х хромосом становить 3.5 * 10!9 пар нуклеотидів (Kao, 1985). Цього кількості ДНК достатньо кодування мільйонів генів. Проте, за багатьма незалежними оцінками истиное число структурних генів находится не більше від 50 000 до 100 000. У розділі 2.4 изложены сучасні підходи, використовувані для підрахунку загального доличества генів, з яких випливає, що ймовірна оцінка їхньої числа становить близько 80 000. Зіставляючи це значення зі середніми розмірами гена і співвідношенням між величиною їх экзонных і интронных областей, можна заключить, что які кодують послідовності ДНК займають не более.

10−15% всього геному (McKusick, Ruddle, 1977). Отже, переважна більшість молекул ДНК несе інформацію про аминокислотною послідовності білків, що є основою любого живого організму, і кодує структуру рибосомальных, транспортних, ядерних та інших типів РНК. Функції этой.

" надлишкової «(junk) ДНК не зрозумілі, хоча її структура вивчена досить докладно. Передбачається, що ця ДНК може брати участі в регуляції експресії генів й у процессинге.

РНК, виконувати структурні функції, підвищувати точність гомологічного спарювання і рекомбінації, сприяти успішної реплікації ДНК і, можливо, є носієм принципово іншого генетичного коду з невідомої функцией.

Найбільш загальну характеристику геному може бути отримана з допомогою аналізу кінетики реассоциации молекул ДНК. Динамика плавлення геномної ДНК виявляє присутність по крайній мері трьох різняться з хімічного складності фракций.

(Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Швидко ренатурирующая фракція ДНК складається з відносно коротких высокоповторяющихся послідовностей; в проміжну фракцію входит безліч помірковано повторюваних ДНК — більш протяженных, але представлених меншою кількістю копій; повільно ренатурирующая фракція об'єднує у собі унікальні последовательности ДНК, які в геномі трохи більше 1−2 раз.

З допомогою молекулярного аналізу проведена ідентифікація основних класів повторюваних послідовностей ДНК, що більш як 35% всього геному чоловіки й які включають сателітну ДНК, инвертированные повтори, помірні і низькокопийные повтори, і навіть мініі микросателлитные последовательности ДНК. Класифікація цих типів повторів достаточале умовна базується, переважно, двома характеристиках: довжині повторюваних коровых одиниць, яка може варіювати від 1−2 до, ніж 2000 п.о., і їх допий, також мінливих на вельми межах — від десятка мільйон на гаплоидный геном. Так само важливими характеристиками різних класів повторюваних ДНК є нуклеотидная послідовність «коровых «одиниць повтору, специфичность їх організації, хромосомная локалізація, всерединіі межвидовая стабільність, і навіть можливі функції цих типів ДНК.

Розділ 2.2. Повторювані послідовності ДНК.

Сателлитная ДНК це клас высокоповторяющихся последовательностей, складових близько 20% всього геному человека.

(Kao, 1985). При центрифугировании геномної ДНК в градиенте щільності CsCl ці послідовності утворюють чотири відділових сателітних піка з різними середніми значеннями плавучої щільності. Методом гібридизації in situ показано присутність сателітної ДНК переважно у центромерных, теломерных і гетерохроматиновых районах більшості хромосом, у своїй характер гібридизації подібний всім подружжявина груп, і залежить від приналежності ДНК-зондов до семействам повторів, їхнім виокремленням різні сателітні піки. У кожній із цих груп, проте, присутній невеличке количество послідовностей, мають специфічну хромосомную локалізацію. Приміром, близько сорока% довгого плеча Y хромосоми становить сімейство послідовностей, тандемно повторюваних більш 3000 разів, і не знайдених інших хромосомах.

Вирізняють три основних типи сателітної ДНК: (1) короткие.

— від 2 до 20 п.о., стабільні тандемные повтори з кратністю кілька десятків тисяч разів, що інколи перемежовуються з неповторяющимися послідовностями; (2) кластери більш протяжних повторів, злегка різняться по нуклеотидної послідовності; (3) складні, які становлять кількох зітен пар нуклеотидів, повторювані послідовності разособистої ступеня гомології (Газарян, Тарантул, 1983). До посліднього типу ставляться альфа-сателлитные чи альфоидные ДНК, серед яких знайдено багато хромосом-специфических последовательностей. Розміри повтрояющихся «коровых «одиниць альфоидной ДНК становлять близько 170−200 п.о. У геномі людини тощо приматів ці мономери зорганізовані у кластери по 20 і більше «коровых «одиниць. Після розщеплення рестриктазой BamHI в альфоидной ДНК виявляється серія фрагментів, завдовжки близько 2.

000 п.о., у складі яких виявляються альфоидные післядовательности, специфічні для гетерохроматиновых районів різних хромосом людини (1, 3, 4, 5, 9, 6, 7, 11, 17, 19,.

Х). У окремих випадках ці повтори гомологичны двох різних хромосомам (9 і 15, 13 і 21, 18 і Х) (Willard, Waye, 1987).

Хромосом-специфические послідовності сателітної альфоидной ДНК знайшли широке використання у молекулярної цитогенетику як ДНК-зондов, зручних для маркірування индивидуальних хромосом в метафазных і интерфазных клітинах человека (Юров, 1987). Передбачається, що сателітні ДНК відіграють істотне значення у підтримці структур хромосом і, можливо, у тому паруванні у процесі мейоза (Charlesworth et al., 1994).

Особливе місце серед сателітних ДНК займають мікроі минисателлитные послідовності, які становлять численну групу розсіяних з усього геному относительале коротких тандемных повторів. Микросателлиты — це клас динуклеотидных повторів. Розмір повторюваних одиниць на минисателитных послідовностях не може змінюватися від 3 — 4 до.

10 — 15 нуклеотидів. Відмінною рисою мікроі минисателлитов служить наявність у тому числі великої кількості ділянок, вариабильных за кількістю копій в кластере.

Инвертированные чи звернені повтори сягають 5% геному. Вони складаються з цих двох тотожних копій довжиною около.

300 п.о., орієнтованих в протилежних напрямах в одній нитки ДНК і лежачих з відривом від нуля з десяток тисяч пар нуклеотидів друг від друга (загалом — 1,6 кб).

Близько 1/3 звернених повторів не розділені проміжними послідовностями й носять назва палиндромов. Середнє відстань між двома різними парами инвертированных повторів близько 12-ї кб, та його розподіл за геномом носить випадковий. Комплементарные пари легко асоціюють при отжиге, створюючи шпилечные структури з дуплексной ніжкою і однонитевой петлею, довжина який відповідає відстані пари звернених повторів. У результаті оказываются приблеженными досить віддалені друг від друга участкі ДНК, це важливо до роботи низки ферментів, які забезпечують процеси реплікації і транскрипції. Важливо і те, що однонитевой ділянку ДНК, утворюючий петлю, стає доступне действя нуклеазы S1, специфічно руйнує однонитевую ДНК.

Група помірковано повторюваних послідовностей дуже гетерогенна за довжиною і числу копій і як близько 20% геному людини. Зазвичай, вони розподілені дисперсно за всі хромосомам, причому щодо короткі послідовникности ДНК до 500 п.о., звані короткі диспергированні повтори — Sine, повторюються понад $ 100.000 разів у середньому, через кожні 2.2 кб. Кількість копій більш довгих диспергированных послідовностей — Line, вбирається у 10.

000. Помірковані повтори знайдено під всіх структурних компонентах геному крім які кодують областей генів. Дві головні сімейства поміркованих повторів, Alu і Kpn1, займають, по крайнього заходу, 10% геному та практично стільки ж зайнято кількома сотнями інших сімейств повторів цього класса.

Основний одиницею Alu сімейства є коротка послідовністю 300 п.о., повторена в геномі человека кілька сотень тисяч разів, загалом, через щоп’ять кб чи через кожні 2 — 3 диспергированных повтору, що належать іншим сімействам (Kao, 1985; Льюин, 1987). У цьому, кластери Alu-повторов, зазвичай, лежать всередині R-дисков метафазных хромосом — Гимза негативних (Gдисків). Распределение Alu-повторов за геномом дуже нерівномірно як між хромосомами, і з їхньої довжині. Так було в хромосомах 14,.

16, 21 Alu-последовательности концентруються у сфері центромеры, а хромосомах 4, 19, 20, Х і У виражені кластери Alu повторів не знайдено. Члени Alu сімейства в повному обсязі ідентичні одна одній. Проте, усі вони містять сайт рестрикції для ферменту AluI і мають димерную структуру, тобто складаються з цих двох прямих повторів завдовжки близько 130 п.о. з багатою аденином вставкою з 31 нуклеотида у другому мономере. Кожна Alu послідовність фланкирована прямими повторами довжиною від 7 до 20 п.о., різними до різних членовий сім'ї та мають велику ступінь гомології з транспозоноподобными елементами проі эукариот. Деякі члени Alu сімейства можуть транскрибуватися з допомогою фермента РНК-полімерази 111. Предпологается, що з визначеноных умовах які утворюються у своїй молекули РНК можуть обратале транскрибуватися, що у своє чергу, можуть призвести до появи у клітинах Alu-содержащих кДНК, які мають властивостями ретропазонов, тобто здатних инсертироваться в геномную ДНК. У літературі описані випадки инсерционного мутагенеза Alu повторів, що призводять до гемофілії У і нейрофиброматозу типу 1. Проте, частота таких подій, очевидно, невелика. Передбачається, що короткі помірні повтори, подібні Alu сімейству, беруть участь у регуляції транскрипції, в процессинге РНК й у ініціації реплікації ДНК. З іншого боку, виявлено високий рівень гомології Alu послідовностей одним із видів низкомолекулярной РНК (7 P. S РНК), беру участьщей в секреції белков.

До Line повторів належить Kpn1 сімейство, яке з більш довгих і більш гетерогенних послідовностей, розсіяних з усього геному. У багатьох случаїв члени Kpn1 сімейства группирются в кластери, створюючи довші структури, повторювані кілька тисяч раз.

Для деяких членів цього сімейства також доведено возможность инсерции кДНК-овых копій Kpn1- РНК-транскриптов в геномную ДНК і мутацій. Таке явище було обготівковувружено щодо одного разі гемофілії А. Деякі Kpn1- последовательности як транскрибируются, але й мають транслюватися (Charlesworth et al., 1994).

Розділ 2.3 Мультигенные сімейства, псевдогены, онкогены.

Багато гени людини повторені в геномі від кількох основних одиниць за кілька сотень разів, і утворюють мультигенные семейства (Газарян, Тарантул, 1983; Босток, Самнер, 1981; Kao,.

1985; Льюин, 1987). Ці гени зазвичай згруповані в кластери у певних районах однієї, чи декількох хромосом. Багато мультигенных сімействах поруч із функціонально активными генами містяться псевдогены — мутационно змінені послідовності, нездатні транскрибуватися чи продуцирующие функціонально неактивний генний продукт. Прикладуми мультигенных сімейств можуть бути гени рибосомальных, транспортних і ядерних РНК, гени альфаі бета-глобинов, тубулинов, міоглобіну, актина, інтерферону і багатьох інших. Нерідко, можлива виборча ампліфікація деяких сімейств генів у процесі їх експресії, як, наприклад, геновий рибосомальных РНК. У цьому число здатних транскрибироваться копій генів збільшується у цих колегіях виборчої амплификации на сотні і тисяч раз, що супроводжується обвальним наростанням частки відповідного генопродукта у клітинах. Особливе місце серед мультигенных сімейств занімают супергены — дуже серйозні кластери з сотень функционально і структурно родинних генів, розміщених у пєгментів окремих хромосом. Класичним прикладом супергена може бути HLA комплекс, контролируюший головні антигени гістосумісності. Він займає район більш 6000 кб на доротком плечі хромосоми 6р21 і складається з серії тісно сцепленних генів, відповідальних за синтез безлічі білків, які включають клітинні поверхневі антигени, молекули иммунного відповіді і пояснюються деякі компоненти комплементу. До супергенным сімействам ставляться три комлекса розташованих на разных хромосомах мультигенов, контролюючих синтез важкі крейсери та легких ланцюгів імуноглобулінів. Цікаво, у процесі диффиренцировки B лімфоцитів, які продукують імуноглобуліни, відбувається структурну перебудову цих сімейств. У цьому окремі послідовності ДНК элиминируются, тоді як інші зливаються, отже структура генів імуноглобулінів у стиглих B лимфоцитах істотно відрізняється від вихідної, тобто не від тієї, яка в зародкових клетках.

Однією із поважних на структурні особливості геному человека служить наявність про псевдогенов, унікальних послідовностей, дуже подібних за своєю структурою з впределенными нормальними генами, але з присутності додирующих послідовностях цілого ряду мутацій методных транскрибуватися чи правильно транслюватися з образованием структурно і функціонально активного продукта.

Псевдогены виявлено багатьом генів. Їхню кількість варьирует від однієї за кілька десятків копій на геном й у випадку вони, зазвичай розташовані тандемно. Іноді псевдогены тісно зчеплені з нормальними генами, у часто псевдогены і гени локалізовано у різних хромосомах.

Для деяких моногенных захворювань ідентифіковані мутантные аллели, подібні до мутаціями у псевдогенах. У таких випадках обсуждаеся можлива роль псевдогеновий в спнтанном мутаційному процессе.

У геномі людини присутні й нуклеотидные послідовності, гомологичные генам деяких вирусов.

Вперше ці послідовності були ідентифіковані в геноме вірусів, индуцирующих розвиток пухлин у тварин і звинувачують чоголовека, і відтак вони було названо онкогенами. Гомологичные послідовностям в геномі людини звуться протоонкогенів. Нині вже ідентифіковано понад сто протоонкогенов. Білкові продукти протоонкогенов, по-видимому, відіграють істотне значення за нормальної проліферації клітин особенно на ранніх стадіях ембріонального розвитку, контролюючи клітинний цикл і вибір геномної програми розвитку клетки.

У разі специфічних мутацій в протоонкогенах, і навіть при порушеннях регуляції його роботи, що виражаються в гіперпродукции чи зкспрессии в нетипичномном місці в невластивий момент життєдіяльності клітини, вони починають поводитися, як онкогены, стимулюючи неконтрольоване размножение і пролиферацию певних клітинних клонів, як і може, зрештою, до формування опухоли.

Розділ 2.4 Сучасне визначення поняття «ген », транскрипція, регуляторні елементи генов.

Близько 10−15% геному людини представлено унікальними транскрибируемыми послідовностями, складовими основу структурних генів (Льюин, 1987). Нині в понятие.

" ген «включається як його транскрибируемая область — экзоны + интроны, але й фланкирующие послідовності - лидерная, попередня початку гена, і хвостова нетранслируемая область, раположенная на 3 «кінці гена (Рис. 2.1). На відміну від генів прокариот гени людини рідко представлені однієї безупинної послідовністю й у гнітючому більшинстве мають переривчасту структуру. Щодо короткі які кодують ділянки — зкзоны, чергуються з довгими интронами, які транскрибируются і входять до складу первичного.

РНК-продукта, але потім при процессинге первинного РНК.

— транскрипта вони вирізаються і беруть участь у трансляции.

Процес вирізання интронов з первинних транскриптів отримав назву сплайсингу. Отже, в зрілої мРНК интронные області відсутні, а экзоны становлять безперервну кодирующую послідовність. Розміри зрілих мРНК нерідко тримають у десятки разів менша первинних РНК-транскрипов і, соответственно, розмірів самого гена.

Відповідно до класичним уявленням ген — це локус, на хромосомі, мутації у якому реалізуються лише на рівні фенотипу. У молекулярній біології ген сприймається як ассоциированний з регуляторними послідовностями фрагмент ДНК, відповідний певної одиниці транскрипції. Следовательно, ставлення до гені формальних генетиків далеко ще не повністю тотожні його фізичної одиниці і співвідношень між цими двома поняттями досить заплутані. Зазначимо деякі причини цих протиріч. Відомо, що мутації одного гена можуть спричинить зовсім різних і навіть у ряде випадків до комплементарних фенотипам. Результати прямого секвенування геному свідчить про присутності у ньому значного більшої кількості генів, чим можна чекати не від результатов мутаційного аналізу. Одна й та послідовникность ДНК в геномі може кодувати кілька різних білков, яка досягається з допомогою з так званого альтернативного сплайсингу (освіту різних мРНК вже з первичного.

РНК-транскрипта). У великих интронах низки генів виявлено смислові послідовності інших генів («ген в гені «), зчитувальні у напрямі. Транскрипционные одиниці геному можуть перекриватися завдяки наявності різних промоторів. Нарешті, завдяки соматичної рекомбінації структура транскрибируемых последовательнстей деяких геновий може бути різною у різних клонах клітин одного организма (Т-клеточные рецептори). Ситуація з визначенням понятия «ген «ще більше ускладнюється, тоді як це поняття включать численні регуляторні послідовності. Метушнікает питання: «І від гена можуть розташовуватися ці послідовності, щоб їх можна було включати у структуру гена? ». Багатьом цілей виявляється зручним запроваджене останнім часом поняття «рахований ген «- counting gene.

Останній сприймається як окрема транскрибируемая одиниця ДНК чи її частка, яка може транслюватися до однієї чи кілька взаємозалежних амінокислотних последовательностей. Тому послідовність, дає дві транскрипционные одиниці з допомогою альтернативного сплайсингу як наслідок, дві різні білка враховується одностайно ген.

Проте, якщо ступінь гомології двох генопродуктов, мають загальний транскрибируемый ділянку, невелика, то ці последовательности розцінюються як різних гена (Fields et al., 1994).

З власного функціональному призначенню гени можна розділити на дві групи. Група I представлена генами, кодирующими власне білки; група II — генами, контролирующими синтез рибосомальных, транспортних і ядерних РНК. По пхерактеру експресії гени також може бути підрозділені на дві групи — гени «домашнього господарства «(housekeeping genes), продукти яких необхідні забезпечення жизнедеятельности будь-якого типу клітин, і тканеспецифические гени, обеспечивающие спеціалізовані функції клітин, тобто гени, функціонально активні лише у певних типах клеток.

(тканин) і лише з певних стадіях онтогенезу, звані гени термінальній дифференцировки.

Вважається, що середні розміри гена людини составляют, приблизно, від 10 до 30 кб. Проте, їх кількість може долебаться і від кількох десятків до мільйонів пар нуклеотидов. За даними, найменший з відомих генівМСС-7, має в діаметрі всього 21 п.о. (Gonzales-Pastor et al., 1994), а самий болшой — ген дистрофіну -2.2 мегабаз.

Гени від'єднані одне від друга протяжними проміжками — спейсерами, що містять у собі дуже багато повторюваних послідовностей ДНК і нетранскрибируемые унікальні последовательности.

Розглянемо докладніше сучасні дані про кількість генів у геномі людини. Отримані в спосіб оцінки цієї величены наведені у Табл.2.1. З розміру генома.

(близько 3 000 мільйонів п.о.), й середнього розміру одного гена порядку 10 — 30 тыс.п.о. (Gilbert, 1992), загальна кількість генів має бути порядку 100 000. У цьому, як зазначалося, розподіл генів на хромосомах вкрай нерівномірно. Вустановлено, що як 90% генів перебуває у Гимзаотрицательных районах метафазных хромосом, в про R-бэндах.

(Antequera, Bird, 1993). Проведені недавно прямі исследования методом секвенування показують, що у R-бэндах їх кількість сягає 43−50 однією бенд, а Гимзапозитивних районах хромосом (G бэндах), — лише 1−2 на 75−80 килобаз, тобто в геномі очікується близько 70 000 генов.

Оцінка числа генів за часткою транскрибируемой частини генома.

(всього 12%) дає зовсім маленьку величину — 20 000 генов.

(Wagner et al., 1993). Методом дослідження кінетики реассоциации РНК у культурі клітин число генів оцінюється между.

20 — 40 000 (Lewin, 1990). У той самий час у клітинах мозку число різних мРНК за деякими даними сягає 97 000.

(Wagner et al., 1993). Найточніші підрахунки числа генів людини проведено останнім часом і засновані оцінці числа CpG острівців (Табл.2.1). Відомо, що у промоторной області всіх генів «домашнього господарства «і США приблизно у 40% генів термінальній диференціювання, які забезпечують специализированные функції диференційованих клітин, перебувають проласти коротких динуклеотидных CpG повторів. Розроблено молекулярные методи точної цих ділянок, які показали, що й число в геномі близько 45 000, звідси число структурних генів становить 67−70 000 (Antequera, Bird,.

1993). Практично таку саму кількість генів (64 000) визначено недавно методом обліку маркерних экспрессирующихся последовательностей (expressed sequence tags) (Fields et al., 1994).

Отже, підсумовуючи вищевикладене, можна дійти невтішного висновку, що у геномі людини міститься, загалом, близько 70−80 000 окремих транскрибируемых ДНК послідовностей, тобто генов.

Транскрипція гена починається з п’ятьма «кінця першої экзона, де міститься сайт ініціації транскрипциии. Певною гомології між стартовими сайтами різних генів не наблюдается, але найчастіше вони розпочинаються з нуклеотида А, оточенийного пиримидиновыми підставами. На межах між экзонами і интронами є консервативні канонічні последовательности, які відіграють істотну роль забезпеченні точності вирізання интронов під час сплайсингу РНК. Усі интронные послідовності розпочинаються з динуклеотида GT і заканчиваются динуклеотидом AG, званими, відповідно, донорными і акцепторными сайтами сплайсингу. На 3 «кінці багатьох структурних генів ідентифіковано поли (А)-сигнальная післядовательность (AATAAA), що у процесі модифікації первинного РНК транскрипта і відповідальна за альтернативний сплайсинг мРНК, який би синтез різних зрілих мРНК з однієї й того первинного РНК транскрипта.

Транскрипція генів здійснюється з допомогою фермента.

РНК-полімерази. Близько 50−70% клітинного синтезу РНК обеспечивается РНК-полимеразой I, локалізованої в ядрышках і південь відветственной за синтез генів рибосомальной РНК. РНК-полимераза II забезпечує транскрипцію генів, які кодують власне структурні білки. Цей фермент локалізований в ядрі (але не ядрышках). На її частку припадає 20 — 40% синтезу РНК.

РНК-полимераза III контролює синтез ядерних і транспортных РНК (Льюин, 1987). На 1-му етапі РНК-полимераза связывается з двухнитевым ділянкою ДНК і, розплітаючи його, робить доступним спарювання значеннєвий нитки ДНК з рибонуклеотидами.

(Рис. 2.2). Коли перший нуклеотид РНК инкорпорируется в сайт ініціації транскрипції, полимераза починає просуватися по нитки ДНК у бік 5 «- 3 », розплітаючи подвійні нитки ДНК перед собою і заплітаючи їх позаду. Цей процес відбувається триває до терминирующего сигналу, це чи кілька терминирующих кодоновий. Потім молекули РНК і ферменту вивільняються і подвійна спіраль (дуплекс) ДНК повністю восстанавливается.

Для правильного початку синтезу РНК необхідно точне взаємодія РНК-полімерази з молекулою ДНК. Цей процес відбувається контролюється промотором — спеціальної регуляторної післядовательностью ДНК розмірами близько 75 п.о., локалізованої, зазвичай, в розмірі 5 «-фланкирующей області гена. Іноді під медичним наглядом одного промотора зчитується кілька генів з проразованием єдиного первинного РНК-транскрипта. Промоторные області різних генів досить різноманітними зі свого нуклеотидному складу. Проте, майже всіх промоторів характерно наявність консервативної послідовності з 7 оснований з відривом 19−27 нуклеотидів зліва сайту ініціації транскрипції. Це правда званий, TATAбокс (блок Хогнесса), який би коректне розташування РНК полімерузы стосовно стартовому сайту. З віддалі 70 — 80 п.о. у бік 5 «-кінця з початку транскрипції часто лежить друга консервативна послідовністю 9 п.о. — CAATбокс, контролюючий початкова связывание.

РНК-полімерази. Мутації в TATAчи CAAT-боксах можуть существенно проводити швидкість синтезу РНК. У 5 «-фланкирующей області гена з відривом близько тисячі пар підстав з початку його яка кодує частини розташовуються інші регуляторні послідовності, звані инхансеры (підсилювачі), здатні різко збільшувати продукцію гена з допомогою увеличения швидкості транскрипції. Ці контролюючі елементи можуть працювати незалежно від своїх орієнтації стосовно сайту ініціації. Для деяких генів знайдено ділянки ДНК, подавляющие транскрипцію, і навіть звані аттенюаторы (ослабители) — послідовності, що лежать між сайтом ініціації транскрипції та власне геном. Вони можуть блокувати продвижение РНК-полімерази. Завдяки такого складного механізму контролю, досягається дуже тонка і ефективна регуляція експресії генів на всі етапи транскрипції, трансляції і безперервної освіти функціонально зрілого білка. Ці механізми детальніше розглянуті за іншими разделах.

Розділ 2.5 Мерехтливість геному, полиморфные сайти рестрикции, ПДРФ-анализ.

Які Кодують і регуляторні області структурних генів наиболее консервативні у процесі еволюції, оскільки мутації у яких піддаються тиску жорсткого природного отбора.

Справді, невеликі зміни у цих послідовникностях, навіть заміна одного підстави, делеция чи инсерция кількох нуклеотидів, можуть призвести до припинення синтезу білка або до втрати її функції, що, зазвичай, драматическим чином б'є по життєздатності особин, несущих подібні мутації. Проте, близько 90 відсотків% геному людини складається з некодирующих послідовностей, подібних сателлитным ДНК, помірним повторам, интронам і спейсерным промежуткам між генами. Ці ділянки значно більше мінливі мають безліч, про нейтральних мутацій чи полиморфизмов, які мають фенотипического вислови й які мають помітного впливу життєздатність чи репродуктивные властивості особин отже, не схильних до прямому тиску природного відбору. Полиморфные локусы є зручними генетичними маркерами. За підсумками аналізу родоводів можна простежити їх успадкування у низці поколений, проаналізувати зчеплення друг з одним, з такими відомими генами і з анонімними послідовностями ДНК, тобто використовувати як звичайних менделевских ознак у «класичному генетичному аналізі. Інформативність полиморфных локусів визначається найвищим рівнем їхній генетичній изменчивости у різних популяциях.

Експериментально легко виявляються два варіанта геномного поліморфізму. Количественые зміни у області локализации мініі микросателлитных послідовностей ДНК і качественные заміни окремих нуклеотидів, що призводять до появлению поліморфних сайтів рестрикції. У першому випадку зрадчивость за кількістю повторених «коровых «одиниць створює серію алелів, характері і частота яких унікальні кожному за вариабильного локусу. Поліморфізм в сайтах рестрикції пов’язані з присутністю точковых нейтральних мутацій, локализованых, зазвичай, в унікальних послідовностях некодирующих ділянок ДНК. Такі мутації з вырожденности генетического коду (см. Глава 1) можуть бути й у які кодують послідовностях генів. Спонтанні мутації, що у сайтах впізнавання для певних рестриктаз, роблять їх резистентными до дії цих ферментів. Так, при таких заміни можна створювати нові сайти рестрикции.

Показано, що полиморфные локусы зустрічаються переважають у всіх хромосомах із частотою приблизно один поліморфний сайт на.

300−500 п.о. Цей тип мінливості ДНК було виявлено і использован для молекулярної маркування специфічних ділянок генома історично раніше проти вариабильными сателлитными повторами (Botstein et al., 1980).

Мутационная мінливість в сайтах рестрикції то, можливо легко виявлено зі зміни довжини рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся зі специфічними ДНК-зондами. Аналіз поліморфізму довжини рестрикционных фрагментів, так называемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism.

— RFLP analysis), входять такі етапи: виділення геноміншої ДНК, її рестрикцию специфічної эндонуклеазой, элекрофоретическое поділ які виникають фрагментів ДНК і ідентификацию фрагментів ДНК, містять поліморфний сайт рестрикции, шляхом блот-гибридизации по Саузерну (см. Главу 1).

За відсутності рестрикції в полиморфном сайті на электрофореграммах чи радиоавтографах (залежно від типу мечения.

ДНК-зонда) буде виявлятися значного фрагмент, соответствующий за довжиною послідовності ДНК між двома сусідніми константними сайтами рестрикції до тієї ж ендонуклеазы. За наявності рестрикції в полиморфном локусі на электрофореграмме житиме менший за величиною фрагмент, рівний відстані між полиморфным сайтом рестрикции одним із найближчих константних сайтів рестрикції. З котрим саме із двох фрагментів, що прилягають до полиморфному локусу, відбуватиметься гібридизація залежить від локализации використовуваного для аналізу ДНК-зонда. У приватному такому випадку можливий гібридизація разом з двома сусідніми рестрикционными фрагментами, якщо обраний ДНК-зонд комплементарен послідовності, що містить поліморфний сайт рестрикци. Проте, такі зонди дуже рідко використовуються на практику, оскільки довжина рестрикционных фрагментів зазвичай, у десятки разів більше довжини ДНК-зондов і який завжди удается виділити й проклонировать фрагмент ДНК, у якому полиморфный сайт рестрикції. Тому надалі для простоти викладу ми розглядати лише трохи більше загальну ситуацію і слід вважати, що за відсутності рестрикції в полиморфном сайте.

ДНК-зонд гибридизуется з однією довгим фрагментом, а при наличии рестрикції гибридизующийся фрагмент має меншу длину. Отже, під час аналізу ДНК особин, на обох хромосомах яких присутній сайт рестрикції в полиморфной проласти, на электрофореграмме буде виявлено лише одне бенд у нижній області гелю, відповідний більш короткому фрагменту ДНК. У особин, гомозиготных по мутації, изменяющей полиморфный сайт рестрикції, спостерігатиметься один бенд у верхній частині гелю, відповідний фрагмента більшої довжини, тоді як в гетерозигот проявляться обидві ці бенду (Рис. 2.3а).

ПДРФ-анализ то, можливо значно спрощений у разі, якщо можлива специфічна ампліфікація ділянки ДНК, содержащего поліморфний сайт рестрикції. Тестування стану цього локусу можливо шляхом проведення ПЛР і рестрикції амплифицированного фрагмента. За відсутності сайту впізнавання в досліджуваній галузі ДНК розміри амплифицированного фрагмента не зміняться саме його обробки відповідної эндонуклеазой, тоді як із повній відповідності полиморфной області сайту рестрикції утворюються два фрагмента меншою длины.

(Рис. 2.3б). У гетерозигот будуть присутні 3 фрагмента, одна з яких за довжиною відповідатиме розміру амплификата до рестрикції, плюс 2 маленьких фрагмента з тією ж сумарною довжиною. Отже, як у разі использования для аналізу блот гібридизації по Саузерну, трьом возможным варіантів генотипу відповідатимуть три різні варіанти электрофореграмм.

Слід підкреслити, що первинна ідентифікація полиморфных сайтів рестрикції, зчеплених з деякими генами, можлива лише за наявності відповідних ДНК-зондов. Подальша тактика залежить від пошуку рестрикційної нуклеазы, выявляющей поліморфізм. Для цього він використовують широкий набір эндонуклеаз для рестрикції геномної ДНК, выделенній із групи неродинних індивідуумів, що становлять репрезентативну вибірку популяції. Потім проводят.

ПДРФ-анализ окремо кожної з рестриктаз з набором имеющихся ДНК-зондов. Після виявлення поліморфізму на одній із популяцій аналогічні дослідження проводять у інших популяциях.

Слід враховувати, що полиморфные сайти рестрикції завжди є двухаллельную систему, тому такнавіть за найвищої вариабильности такого сайту, число гетерозиготных у цій локусу особин в популяції нічого очікувати перевищувати 50% Тим більше що, лише за наявності полиморфного сайту в гетерозиготному стані можна відрізнити мутантний аллель від нормального, тобто здійснити з його молекулярну маркірування. Отже, інформаційна ємність такого полиморфизма щодо невелика (див. Глави Y і VII).

Розділ 2.6 Вариабильные мікроі минисателлитные ДНК.

Гипервариабильные сателітні повтори є значно більше информтивными маркерами проти полиморфными сайтами рестрикції, оскільки є мультиаллельные системи з рівнем гетерозиготности, сягаючим 70 ;

90%. З іншого боку, виявилося, що його высокоизменчивых мікроі минисателлитных послідовностей в геномі человека, очевидно, перевищує кілька десятків тисяч, вони досить плідно і рівномірно розташований у кожній з хромосом. Так більш 90% з 5000 ідентифікованих (C-A)-повторів є полиморфными, причому у більшості їх уровень гетерозиготности значно перевищує 50% (Weissenbach et al, 1992). Серед гипервариабильных мини-сателлитных послідовностей розрізняють варьирующие за кількістю тандемные повтори — VNTR, три-, тетраі пентануклеотидные повтори, і навіть деяких інших класи повторів. Загальна кількість високополіморфних минисателлитных послідовностей в геномі перевищує 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,.

1994). VNTR (variable number tandem repeats — варьирующие за кількістю тандемные повтори) -характеризуються наявністю 10 — 15 — ти нуклеотидних «коровых «послідовностей, подібних з контролюючими елементами рекомбінації E. coli (Jeffreys et al., 1985). З допомогою ДНК-зондов, сконструйованих на основе тандемно повторюваних «коровых «послідовностей, можна аналізувати індивідуальну мінливість в одиничних чи багатьох высокополиморфных локусах, несучих однетипную коровую послідовність. Прикладом може служить.

VNTR, виявлена в интроне миоглобинового гена, куди входять чотири тандемных повтору з 33 п.о., фланкированных прямими повторами з 9 п.о. Отримані від цього району ДНК-зонды успішно йдуть на ідентифікації особистості методом.

ДНК-фингерпринта, оскільки можливість збігу алелів двох неродинних індивідуумів за всі гипервариабильным локусам, гибридизующихися з цим ДНК-зондом, значно менше 10!-7 (Jeffreys et al., 1991). Высокополиморфные VNTR знайдено й у гені інсуліну, у сфері глобинового псевдогена й у Х-хромосомі, що містить послідовності, гомологичные ДНК вірусу гепатиту У (Nakamura et al., 1985). Останнім часом численні VNTRпослідовності пронаружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O «Brien, 1992).

Пошук нових гипервариабильных локусів грунтується на систематическом скринінгу клонованих послідовностей ДНК з поміццю штучно синтезованих «коровых «зондів. Особливийале зручні для такого скринінгу геномные бібліотеки, сконструйовані з урахуванням попередньо фракционированных за величиною Mbo1 чи Sau3A1 фрагментів ДНК, оскільки великі фрагменти збагачені довгими і більше вариабильными минисателитными послідовностями (Armour, et al., 1990). Хороші результати отримано також за скринировании космидных бібліотек з допомогою G-богатых синтетичних ДНК-зондов і хемолюминесцентного методу разом із ПЦР.

(Decorte, Cassiman, 1990). У окремих випадках із метою застосовують також послідовності ДНК, виділені з фага.

М13, має у собі подібні структури (Armour etal., 1990).

Однією з варіантів минисателлитных послідовностей є тримерные і тетрамерные короткі тандемные повторы.

— STR (short tandem repeats), які стабільно успадковуються і мають високий рівень поліморфізму за кількістю коровых одиниць (Edwards et al., 1991). У X хромосомі такі повтори виявлено через кожні 300 — 500 кб, тоді в інших частинах геному вони зустрічаються з відривом 10 кб друг від друга. За деякими оцінками їх частота може становити 1/20 кб (Charlesworth et al., 1994). Можливо, истиное число триі тетрамерных повторів в геномі людину ще більше, оскільки вони виявили в багатьох генах. Подібно іншим повторам STR зазвичай зустрічаються в некодирующих частинах генів. Останнім часом, проте, виявлено група структурних генів, несучих тримерные повтори в регуляторних і навіть у трансльованих частинах генів. Зміни числа цих внутригенных повторів у бік їхнього збільшення може спричинить порушення функції цих генів до повного блоку експресії й можуть бути причиіншої низки тяжких захворювань — хвороби експансії (см. Главу X). Як зондів виявлення доротких тандемных повторів використовують синтетичні олигонуклеотиды, побудовані з простих повторів 3 або чотирьох нуклеотидов.

Останнім часом щоб виявити різних класів микросателлитных послідовностей і STR-повторов применяют ефективні методи, засновані на використанні ПЦР.

(Edwards et al., 1991). Для цих локусів характерно велика кількість алелів, які різняться за кількістю коровых единиц.

Продукти амплификации цих сайтів можуть бути різні друг від друга числом дітричи тетрануклеотидных повторів. Для зручності ідентифікації різних алелів полимеразную ланцюгову реакцію проводять у присутності мічених нуклеотидів, а электрофоретического поділу продуктів амплификации використовують спеціальні секвенирующие гелі. Багато STR-локусы настільки полиморфны, що застосовуються у судовій мідіцине для ідентифікації особистості. На підвищення достовірності результатів із метою використовують мультиплексные варианты.

ПЛР, дозволяють встановлювати генотип індивідуума одновременно з кількох STR-сайтам (Weber, May, 1994; Асєєв і др., 1995). Можливість точного генотипирования особистості з допомогою полімеразної ланцюгову реакцію, цебто в мінімальном кількості ДНК, є важливим методичним преимуществом STR перед раніше розглянутими VNTR, для аналізу доторых частіше використовують блот-гибридизацию по Саузерну.

Висока частота коротких тандемных повторів, уникальность комбінацій числа тетра-, триі димеров у різних сайтах разом із їхньої високої вариабильностью та порівняльної легкістю ідентифікації алелів дозволяє широко использовать ці повтори для генетичного й фізичного картирования у найбільш зручних індексних маркерів геномных.

ДНК-последовательностей (см. Главу III). Такі маркерні сайти дістали назву STS (sequence tagged sites). У настоющее час у геномі людини вже ідентифіковано близько 10.

000 STS, переважна що їх є тандемные повтори 2 — 4 нуклеотидів. Завдяки вираженої індивідуальної специфічності і стабільному менделевскому типу наслідування STS-сайты знайшли широке применение й у молекулярної діагностиці генних хвороб, насамперед у ролі молекулярних маркерів для ідентифікації мутантных хромосом у сім'ях великий ризик (див. Главу VII).

Наявність значної частини гипервариабильных мікроі минисателлитных послідовностей ДНК є характерною особливийностью геному людини. Аналогічні послідовності, пронаруженные в геномі приматів, значно більше однорідні, що доводить можливість істотного збільшення вариабильности їх ДНК за порівняно короткий эволюционный проміжок (Юров, 1988; Gray et al., 1991).

Відомості про мутабильности высокополиморфных последовательностей в геномі людини дуже суперечливі. Показано, проте, що в вариабильных минисателлитных локусах частота мутацій може становити 5% на гамету (Jeffreys et al., 1988). Передбачається, що з головних функцій гіпервариабильных мікроі минисателлитных последовательностей.

ДНК то, можливо контроль гомологичной рекомбінації в мейозе.

На культурах клітин показано стимулюючий вплив минисателлитных послідовностей ДНК на гомологичную рекомбинацию. Так, инсерция синтезованою послідовності, складеної з урахуванням гипервариабильных минисателлитов в геномную ДНК призводить до більш, ніж 10-кратному збільшення кількості реципрокных обмінів, причому ступінь цього впливу проратно пропорційна відстані між STR і сайтом рекомбинації (Wahls et al., 1990). Разом про те, багато авторів проращают увагу до досить високий стабільність минисателлитных алелів, що дозволяє їх широко використовувати як генетичного маркірування, так популяційних досліджень, і ідентифікації особистості методом ДНК-фингерпринта (Decorte, Cassiman 1993; Edwards et al., 1991; Іванов, 1989).

Багатьом мутацій, локалізованих в некодирующих частинах геному, характерні рівні популяционного полиморфизма. Необхідно, проте, підкреслити, що ця зрадчивость торкається загальної структури геному, визначальною різницю між видами. Понад те, сопосталение первинних нуклеотидних послідовностей порівняно протяжних секвенированных ділянок ДНК (області Т-рецепторных генів завдовжки близько 100 кб) виявило збереження високого рівня гомології у які кодують, а й, що особливо удивительно, в некодирующих частинах цих послідовностей. Коли ж врахувати, що еволюційно чоловік і миша розділені майже 80 мільйонами років еволюції, ці дані розглядаються як свидетельство функціональної значимості некодирующих частин цих генів Очевидно, далеко ще не всякі мутації в некодирующих районах ДНК є нейтральними й у певних случаях можуть мати негативний вплив на життєздатність. На жаль, нині нічого, або майже неизвестно про функції некодирующих ДНК-последовательностей.

Висловлювалося навіть припущення, що й єдиною функцией є реплікація. Звідси виникло уявлення об.

" егоїстичної «чи «паразитичної «ДНК. Звісно, цілковито виключити наявність подібних паразитичних послідовникностей ДНК у кожному геномі не можна. Тим ні менш, представляется малоймовірним, значна частина геному людини, як і інших напрямів, належить до егоїстичної ДНК.

Очевидно, наші знання про роль некодирующей чи, як ще кажуть, «надлишкової «ДНК досі їх замало. Стабильность структурної організації геному не більше виду свідчить скоріш про важливою еволюційної ролі некодирующих ДНК-последовательностей і про їхніх участі у процесах вінтогенеза. Можна припустити, відповідь цей інтригуючий питання на певною мірою отримають при розшифровці і сравнении повної первинної нуклеотидної послідовності геномов у тварин різних видів тварин і, передусім, в людини й миші, де прогрес в секвенировании геномної ДНК особливо значний (см. Главу III). До речі, що проведений недавно комп’ютерний аналіз геному людини дозволяє переддумати його присутність серед його некодирующей частини особливого, поки що незрозумілого генетичного коду, зміст і значення залишаються загадковими (?).

Розділ 2.7 Мобільність геному, облігатні і факультативные елементи генома.

До цього часу ми розглядали основні структурні еліменти геному людини, становище що у відповідність до уявленнями класичної генетики досить постоянно.

Починаючи з 1950;х років стали накопичуватися даних про істотавании значної частини мобільних генетичних елементів, що їх у геномі перестав бути обов’язковим, які топографія і кількість може варіювати у різних клетках, тканинах і в різних індивідуумів (McClintock, 1984; Berg,.

Howe, 1989). У прокариот такі елементи дістали назву транспозонов. Їх структура і функції досить добре изучены. Відмінною рисою мобільних елементів является здатність існувати як і інтегрованому з хромосомой вигляді, і у вигляді окремих макромолекул — эписом, плазмід, вірусних частинок. Майже 50 різних сімейств мобильных елементів описано у дрозофіли. Разом ці последовательности становлять близько 12-ї% гаплоидного набора.

(Golubovsky, 1995). У геномі ссавців міститься до 50.

000 диспергированных копій ретропозона LINE розміром около.

6500 пар основанийю. Сімейство Aluповторів, що містить от.

300 до 500 тисяч копій, також належить до мобільних елементів геному (Сharlesworth et al., 1994). Явище лизогенді, тобто присутність вірусних послідовностей у складі ДНК чоловіки й наявність фрагментів генів людини у вірусних геномах, слугує однією із прикладів мобільності ДНК й можливості «горизонтальній «передачі спадково закрепленних ознак між видами. Мобільні ДНК, зазвичай, ставляться до факультативним елементам. Як зазначалося, немає чітких меж між облигатными і факультативними елементами геному, оскільки може бути взаємний перехід від одного стану до іншого. Структурні локусы чи сегменти хромосом можуть трансформуватися на факультативні елементи з допомогою амплификации, інтеграції в мобільні елементи чи шляхом освіти цитоплазматических ретротранскриптов. Проратний перехід від факультативних елементів до облигатным осуществляется у вигляді инсерций, транспозон-индуцированных перебудов і зворотної транскрипции.

Факультативні елементи перебувають у геномі як популяции інформативних макромолекул. Зміни, що у них під впливом зовнішніх чинників, носять зовсім інший пхерактер проти класичними мутаціями в структурних локусах. Для описи змін — у факультативних елементах запропонований термін «варіації «(Голубовський, 1985). Цей терхв вперше використаний Жакобом і Воллманом для описи поведення эписом (Jacob, Wollman, 1961). Варіації можуть приводить до змін на генотипическом рівні, тобто до мутациям, внаслідок простого переміщення факультативних элементов чи зсуву у співвідношенні між факультативними і облігатными елементами. У таких випадках мутації зустрічаються одновременно в багатьох індивідуумів. Такі зміни упорядочены, можуть коїтися одразу у багатьох локусах і отличаются високої сайт-специфичностью. Локалізація структурних перебудов, що виникають унаслідок варіацій, предопределена початкової топографією факультативних елементів на хромосомах. І, насамкінець, самі варіації може бути индуцированы звичайними «не-мутагенными «чинниками, такі як температура чи межлинейные кроси (Golubovsky, 1995). Факультативні елементи можна розглядати як оперативна пам’ять геномало, оскільки у часто спонтанне виникнення мутаций в облигатных елементах опосередковано їх активацією. Считается, зокрема, що инсерционный мутагенез причина спонтанного виникнення 70% видимих мутацій у природних популяціях дрозофіли. Проте, в людини поки зарегистрированы лише одиничні випадки виникнення мутацій внаслідок переміщення мобільних елементів геному (Vidaud et al., 1993).

Розділ 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные сайты.

Перераховані вище компоненти геному невипадковим образом пов’язані з послідовностями нуклеотидів. І це сенсі можна говорити про існування в геномі людини структур вищого ієрархічного порядку. Прикладом служать изохоры — довгі, загалом, понад 300 кб сегменты.

ДНК, гомогенні композиційно підстав чи з GC-уровням.

62% геному складається з GC-бедных изохор і над ними локалізовано близько 34% генів, 31% геному представлений GC-богатыми изохорами, що містять 38% генів, й у 3% изохор, обогащенных.

GC-последовательностями (про H3 изохор), находится 28% генів (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,.

1993). Отже, існують відносно невеликі ділянки ДНК, у яких щільність генів у 10 -20 разів більше, ніж у інших последовательностях.

Інший спільною рисою геному людини є те, що in vivo значна частина цитозиновых залишків в молекулі ДНК метилирована, т-є перебуває у формі 5-метилдезоксицитидина. Експериментальне вивчення характеру метилування грунтується на зіставленні рестрикционных фрагметов, утворющихся після обробки ДНК эндонуклеазами, котрим сайти впізнавання однакові утримують у собі цитозин, а діють ці ферменти по-різному, залежно від цього, перебуває це підставу в метилированном змозі або немає. Зокрема, рестриктазы — Msp1 і Hpa11, дізнаються післядовательность CCGG, та на відміну від Msp1, Hpa11 не расщепляет ДНК у його сайтах, де внутрішній CpG динуклеотид мітилирован. Деякі сегменти геному, особливо це стосується повторюваним послідовностям, повністю метиловані у місцях 5 «-CCGG-3 «і лише частково метиловані в розмірі 5 «-GCGC-3 «- сайтах рестрикції для Hha1. За інших сегментах спостерігається характерний малюнок часткового метилування в розмірі 5 «-CCGG-3 «послідовностях (Behn-Krappa et al., 1991). Різні індивідууми, незалежно від своїх етнічного походження, мало різняться характером метилування ДНК тільки в і тієї ж типах тканин, тоді як у процесі онтогенетической диференціювання відбуваються значних змін малюнків метилування. У перевиваемых культурах клітин опухолевого походження число метилированных сайтів різко уменьшено.

Висловлено припущення щодо наявності прямого зв’язку між метилированием ДНК і станом генетичної активності у клітинах. Існує клас білків, які специфічним проразом пов’язуються з метилированными ділянками ДНК, робить їх недоступними на дію низки ферментів, зокрема, візможна, й у полимераз. Отримано багато прямих экспериментальных доказів ролі метилування ДНК в інактивації эукариотических промоторів, отже, й у регуляції активности генів. Навпаки, гипометилирование промоторной області генів, особливо CpG острівців, зазвичай, свидетельствует про функціональної активності генів. Показано, що незвичні структури в молекулі ДНК, як і экзогенная.

ДНК, інкорпорована у процесі генетичної трансформации, нерідко піддаються метилированию. Відомо, що метилирование відіграє в інактивації X хромосоми у самок, в регуляції експресії генів у процесі розвитку, і навіть безпосередньо залучено в феномен хромосомного (геномного) імпринтингу, що з відмінностями пенетрантности деяких алелів залежно від своїх походження, тобто проходження через материнський чи батьків гаметогенез (баранов, 1991).

У GC-богатых изохорах локалізовано велике количество.

CpG острівців — послідовностей від 500 до 2000 п.о., пхерактеризующихся дуже високий змістом гуанина і цитозина.

(G+C > 60%), які у вигляді кластерів неметилированных CpG дуплетов й дуже званих, G/C боксів — локусів, родинних сайту впізнавання одного з транскрипционных чинників Sp1 — (G)4C (G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;

Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова є багато сайтів впізнавання для чутливої до метилированию эндонуклеазы.

HpaII, і навіть сайти для редкощепящих рестриктаз, котрі дізнаються неметилированные CpG дуплеты. Зокрема, більш 80%.

Nor1-сайтов пов’язані з CpG-богатыми острівцями. Як правило,.

CpG острівці локалізовано в розмірі 5 «- що фланкують послідовникностях, 5 «-зкзонах і п’яти «-интронах всіх вивчених хаузкипинг-генов і 40% тканеспецифических генів. CpG острівці являются характерною рисою транскрибируемых ділянок геному. Їх ідентифікація в клонованих послідовностях геномних бібліотек істотно полегшує пошук конкретних структурних генів (см. раздел 2.4). Найбільша щільність CpG острівців зокрема у теломерных ділянках хромосом 1, 9,.

15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis, 1994). Точні молекулярные методи реєстрації СрG острівців показали, що й число в геномі людини наближається до 45 000 (.

Antequera, Bird, 1993).

Можна зазначити існування у геномі людини сайтів, гиперчувствительных до дії ДНК-азы 1 і структурале від основної маси хроматина. Присутність таких сайтів показано багатьом генів ссавців і, по-видимому, це необхідне, але з достатня умова їх експресії. Локалізація гиперчувствительных сайтів може меняться у розвитку й під дією гормонів. У недоторых випадках ці ділянки маркірують становище транскрипционных регуляторних елементів геному, діючих як і покладительном, і у негативному напрямах. За інших случитиях це області функціонально активних генів, що у деспирализованном стані людини і мають однонитевую структуру.

Саме через такі однонитевые ділянки ДНК особливо выско чувствительны до ДНК-азе 1. У цьому їх властивості грунтується метод ник-трансляции in situ, дозволяє безпосередньо на хромосомных препаратах візуалізувати функціонально активні райони хромосом. Для цього він хромосомні препарати обрабатывают ДНК-азой 1, після чого безпосередньо них з поміццю ДНК-полимеразы проводять синтез ДНК у присутності мечіных нуклеотидів. У цьому мітка включається переважно лише у ділянки хромосом, где перебувають функціонально активные гени (Verma, Babu, 1989).

ГЛАВА II.

ГЕНОМ ЛЮДИНИ, СТРУКТУРА ГЕНОВ.

Розділ 2.1. Визначення геному та її основних элементов.

Термін геном використовується для позначення повної генітической системи клітини, визначальною характер онтогенетического розвитку організму, що спадкову передачу у низці поколінь усіх її структурних і функціональних признаков.

Поняття геному може бути застосована до таксономической группе, виду, окремої особини, клітині, микроорганизму чи вірусу. Так казати про структурі геному эукариот і прокариот, порівнювати геноми різних видів, вивчати особливості будівлі геному у конкретних індивідуумів чи ознайомитися з зменениями, що відбуваються в геномі специфічних клітин на процесі їх онтогенетической диференціювання. Часто геном окреслюється генетична інформація, ув’язнена в молекулах ДНК однієї клітини. Проте, такі факти, як відсутність зв’язок між кількістю ДНК для гаплоидный геном і таксономическим статусом видів, і навіть багаточисельні приклади існування величезних відмінностей у утримуючинді ДНК між близкородственными видами (так называемый.

" С-парадокс ") свідчать, що зовсім в повному обсязі ділянки ДНК пов’язані з інформаційними функціями. Поняття генома і ДНК значною мірою тотожні, оскільки основні засади організації та функціонування геному целиком визначаються властивостями ДНК. Притаманні цим молекулам потенційні можливості практично необмеженого структурного розмаїття визначають розмаїття світу живих істот, на рівні міжвидових, і індивідуальних различий у межах виду (Баєв і др., 1990; Ратнер, 1985).

Процес еволюції і диференціювання окремих видів, зазвичай, супроводжувався накопиченням змін — у структурі генома. Ідеться, передусім, таких параметрів, як локализация і характеру упаковки ДНК у клітинах; кількість ДНК, приходящееся на гаплоидный геном; типи, співвідношення і функции які кодують і некодирующих нуклеотидних послідовникностей; регуляція експресії генів; межпопуляционная вариабильность і филогенетический консерватизм первинної структуры геному. У межах виду основні параметри геному досить постійні, а внутривидовое розмаїтість обеспечивается з допомогою мутаційної мінливості, тобто випадання, вставки чи заміни нуклеотидів на порівняно невеликих ділянках ДНК. Найчастіше такі зміни стосуються неэкспрессируемых елементів геному (интронов, псевдогенов, межгенных спэйсерных ділянок ДНК і т.д.).

Геноми эукариот, по суті, можна як мультигеномные симбиотческие конструкції, які з облігатных і факультативних елементів (Golubovsky, 1995). Основу облигатных елементів становлять структурні локусы, количество і місцезнаходження що у геномі досить постоянно.

Присутність у хромосомах деяких видів повторюваних ДНК, амплифицированных ділянок, ретровірусних послідовникностей, псевдогенов, як і його присутність серед клітині эписом, ретротранскриптов, ампликонов, додаткових B-хромосом і самеособистих цитосимбионтов (вірусів, бактерій, найпростіших) является не суворо обов’язковим, їх кількість і становище може значно варіювати, тобто ці елементи є факультативными. У той самий час участь факультативних элементов в спадкової передачі ознак, у формуванні мутационной мінливості й у еволюційних перетвореннях відов безсумнівно доведено. З іншого боку, існує безперервний перехід від самих станів решти з допомогою инсерции экстрахромосомных ДНК в хромосоми і вибудовування транспозоноподобных мобільних елементів з хромосом. Отже, попри значну різницю факультативних последовательностей від облигатных характером основних информационных процесів (реплікації, транскрипції, трансляції і сегрегации), вони також має розглядатися, як найважливіші еліменти генома.

Зупинимося тепер детальніше на основні принципи організації геному людини. У кожній диплоидной клітині з 46 хромосомами міститься близько 6 пікограм ДНК, а загальна довжина гаплоидного набору з 23-х хромосом становить 3.5 * 10!9 пар нуклеотидів (Kao, 1985). Цього кількості ДНК достатньо кодування мільйонів генів. Проте, за багатьма незалежними оцінками истиное число структурних генів находится не більше від 50 000 до 100 000. У розділі 2.4 изложены сучасні підходи, використовувані для підрахунку загального доличества генів, з яких випливає, що ймовірна оцінка їхньої числа становить близько 80 000. Зіставляючи це значення зі середніми розмірами гена і співвідношенням між величиною їх экзонных і интронных областей, можна заключить, что які кодують послідовності ДНК займають не более.

10−15% всього геному (McKusick, Ruddle, 1977). Отже, переважна більшість молекул ДНК несе інформацію про аминокислотною послідовності білків, що є основою любого живого організму, і кодує структуру рибосомальных, транспортних, ядерних та інших типів РНК. Функції этой.

" надлишкової «(junk) ДНК не зрозумілі, хоча її структура вивчена досить докладно. Передбачається, що ця ДНК може брати участі в регуляції експресії генів й у процессинге.

РНК, виконувати структурні функції, підвищувати точність гомологічного спарювання і рекомбінації, сприяти успішної реплікації ДНК і, можливо, є носієм принципово іншого генетичного коду з невідомої функцией.

Найбільш загальну характеристику геному може бути отримана з допомогою аналізу кінетики реассоциации молекул ДНК. Динамика плавлення геномної ДНК виявляє присутність по крайній мері трьох різняться з хімічного складності фракций.

(Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Швидко ренатурирующая фракція ДНК складається з відносно коротких высокоповторяющихся послідовностей; в проміжну фракцію входит безліч помірковано повторюваних ДНК — більш протяженных, але представлених меншою кількістю копій; повільно ренатурирующая фракція об'єднує у собі унікальні последовательности ДНК, які в геномі трохи більше 1−2 раз.

З допомогою молекулярного аналізу проведена ідентифікація основних класів повторюваних послідовностей ДНК, що більш як 35% всього геному чоловіки й які включають сателітну ДНК, инвертированные повтори, помірні і низькокопийные повтори, і навіть мініі микросателлитные последовательности ДНК. Класифікація цих типів повторів достаточале умовна базується, переважно, двома характеристиках: довжині повторюваних коровых одиниць, яка може варіювати від 1−2 до, ніж 2000 п.о., і їх допий, також мінливих на вельми межах — від десятка мільйон на гаплоидный геном. Так само важливими характеристиками різних класів повторюваних ДНК є нуклеотидная послідовність «коровых «одиниць повтору, специфичность їх організації, хромосомная локалізація, всерединіі межвидовая стабільність, і навіть можливі функції цих типів ДНК.

Розділ 2.2. Повторювані послідовності ДНК.

Сателлитная ДНК це клас высокоповторяющихся последовательностей, складових близько 20% всього геному человека.

(Kao, 1985). При центрифугировании геномної ДНК в градиенте щільності CsCl ці послідовності утворюють чотири відділових сателітних піка з різними середніми значеннями плавучої щільності. Методом гібридизації in situ показано присутність сателітної ДНК переважно у центромерных, теломерных і гетерохроматиновых районах більшості хромосом, у своїй характер гібридизації подібний всім подружжяпровина груп, і залежить від приналежності ДНК-зондов до семействам повторів, їхнім виокремленням різні сателітні піки. У кожній із цих груп, проте, присутній невеличке количество послідовностей, мають специфічну хромосомную локалізацію. Приміром, близько сорока% довгого плеча Y хромосоми становить сімейство послідовностей, тандемно повторюваних більш 3000 разів, і не знайдених за іншими хромосомах.

Вирізняють три основних типи сателітної ДНК: (1) короткие.

— від 2 до 20 п.о., стабільні тандемные повтори з кратністю кілька десятків тисяч разів, що інколи перемежовуються з неповторяющимися послідовностями; (2) кластери більш протяжних повторів, злегка різняться по нуклеотидної послідовності; (3) складні, які становлять кількох зітен пар нуклеотидів, повторювані послідовності разособистої ступеня гомології (Газарян, Тарантул, 1983). До посліднього типу ставляться альфа-сателлитные чи альфоидные ДНК, серед яких знайдено багато хромосом-специфических последовательностей. Розміри повтрояющихся «коровых «одиниць альфоидной ДНК становлять близько 170−200 п.о. У геномі людини тощо приматів ці мономери зорганізовані у кластери по 20 і більше «коровых «одиниць. Після розщеплення рестриктазой BamHI в альфоидной ДНК виявляється серія фрагментів, завдовжки близько 2.

000 п.о., у складі яких виявляються альфоидные післядовательности, специфічні для гетерохроматиновых районів різних хромосом людини (1, 3, 4, 5, 9, 6, 7, 11, 17, 19,.

Х). У окремих випадках ці повтори гомологичны двох різних хромосомам (9 і 15, 13 і 21, 18 і Х) (Willard, Waye, 1987).

Хромосом-специфические послідовності сателітної альфоидной ДНК знайшли широке використання у молекулярної цитогенетику як ДНК-зондов, зручних для маркірування индивидуальних хромосом в метафазных і интерфазных клітинах человека (Юров, 1987). Передбачається, що сателітні ДНК відіграють істотне значення у підтримці структур хромосом і, можливо, у тому паруванні у процесі мейоза (Charlesworth et al., 1994).

Особливе місце серед сателітних ДНК займають мікроі минисателлитные послідовності, які становлять численну групу розсіяних з усього геному относительале коротких тандемных повторів. Микросателлиты — це клас динуклеотидных повторів. Розмір повторюваних одиниць на минисателитных послідовностях не може змінюватися від 3 — 4 до.

10 — 15 нуклеотидів. Відмінною рисою мікроі минисателлитов служить наявність у тому числі великої кількості ділянок, вариабильных за кількістю копій в кластере.

Инвертированные чи звернені повтори сягають 5% геному. Вони складаються з цих двох тотожних копій довжиною около.

300 п.о., орієнтованих в протилежних напрямах в одній нитки ДНК і лежачих з відривом від нуля з десяток тисяч пар нуклеотидів друг від друга (загалом — 1,6 кб).

Близько 1/3 звернених повторів не розділені проміжними послідовностями і їх носять назва палиндромов. Середнє відстань між двома різними парами инвертированных повторів близько 12-ї кб, та його розподіл за геномом носить випадковий. Комплементарные пари легко асоціюють при отжиге, створюючи шпилечные структури з дуплексной ніжкою і однонитевой петлею, довжина який відповідає відстані пари звернених повторів. У результаті оказываются приблеженными досить віддалені друг від друга участкі ДНК, це важливо до роботи низки ферментів, які забезпечують процеси реплікації і транскрипції. Важливо і те, що однонитевой ділянку ДНК, утворюючий петлю, стає доступне действя нуклеазы S1, специфічно руйнує однонитевую ДНК.

Група помірковано повторюваних послідовностей дуже гетерогенна за довжиною і числу копій і як близько 20% геному людини. Зазвичай, вони розподілені дисперсно за всі хромосомам, причому щодо короткі послідовникности ДНК до 500 п.о., звані короткі диспергированні повтори — Sine, повторюються понад $ 100.000 разів у середньому, через кожні 2.2 кб. Кількість копій більш довгих диспергированных послідовностей — Line, вбирається у 10.

000. Помірковані повтори знайдено під всіх структурних компонентах геному крім які кодують областей генів. Дві головні сімейства поміркованих повторів, Alu і Kpn1, займають, по крайнього заходу, 10% геному та практично стільки ж зайнято кількома сотнями інших сімейств повторів цього класса.

Основний одиницею Alu сімейства є коротка послідовністю 300 п.о., повторена в геномі человека кілька сотень тисяч разів, загалом, через щоп’ять кб чи через кожні 2 — 3 диспергированных повтору, що належать іншим сімействам (Kao, 1985; Льюин, 1987). У цьому, кластери Alu-повторов, зазвичай, лежать всередині R-дисков метафазных хромосом — Гимза негативних (Gдисків). Распределение Alu-повторов за геномом дуже нерівномірно як між хромосомами, і з їхньої довжині. Так було в хромосомах 14,.

16, 21 Alu-последовательности концентруються у сфері центромеры, а хромосомах 4, 19, 20, Х і У виражені кластери Alu повторів не знайдено. Члени Alu сімейства в повному обсязі ідентичні одна одній. Проте, усі вони містять сайт рестрикції для ферменту AluI і мають димерную структуру, тобто складаються з цих двох прямих повторів завдовжки близько 130 п.о. з багатою аденином вставкою з 31 нуклеотида у другому мономере. Кожна Alu послідовність фланкирована прямими повторами довжиною від 7 до 20 п.о., різними до різних членовий сім'ї та мають велику ступінь гомології з транспозоноподобными елементами проі эукариот. Деякі члени Alu сімейства можуть транскрибуватися з допомогою фермента РНК-полімерази 111. Предпологается, що з визначеноных умовах які утворюються у своїй молекули РНК можуть обратале транскрибуватися, що у своє чергу, можуть призвести до появи у клітинах Alu-содержащих кДНК, які мають властивостями ретропазонов, тобто здатних инсертироваться в геномную ДНК. У літературі описані випадки инсерционного мутагенеза Alu повторів, що призводять до гемофілії У і нейрофиброматозу типу 1. Проте, частота таких подій, очевидно, невелика. Передбачається, що короткі помірні повтори, подібні Alu сімейству, беруть участь у регуляції транскрипції, в процессинге РНК й у ініціації реплікації ДНК. З іншого боку, виявлено високий рівень гомології Alu послідовностей одним із видів низкомолекулярной РНК (7 P. S РНК), беру участьщей в секреції белков.

До Line повторів належить Kpn1 сімейство, яке з більш довгих і більш гетерогенних послідовностей, розсіяних з усього геному. У багатьох случаїв члени Kpn1 сімейства группирются в кластери, створюючи довші структури, повторювані кілька тисяч раз.

Для деяких членів цього сімейства також доведено возможность инсерции кДНК-овых копій Kpn1- РНК-транскриптов в геномную ДНК і мутацій. Таке явище було обготівковувружено щодо одного разі гемофілії А. Деякі Kpn1- последовательности як транскрибируются, але й мають транслюватися (Charlesworth et al., 1994).

Розділ 2.3 Мультигенные сімейства, псевдогены, онкогены.

Багато гени людини повторені в геномі від кількох основних одиниць за кілька сотень разів, і утворюють мультигенные семейства (Газарян, Тарантул, 1983; Босток, Самнер, 1981; Kao,.

1985; Льюин, 1987). Ці гени зазвичай згруповані в кластери у певних районах однієї, чи декількох хромосом. Багато мультигенных сімействах поруч із функціонально активными генами містяться псевдогены — мутационно змінені послідовності, нездатні транскрибуватися чи продуцирующие функціонально неактивний генний продукт. Прикладуми мультигенных сімейств можуть бути гени рибосомальных, транспортних і ядерних РНК, гени альфаі бета-глобинов, тубулинов, міоглобіну, актина, інтерферону і багатьох інших. Нерідко, можлива виборча ампліфікація деяких сімейств генів у процесі їх експресії, як, наприклад, геновий рибосомальных РНК. У цьому число здатних транскрибироваться копій генів збільшується у цих колегіях виборчої амплификации на сотні і тисяч раз, що супроводжується обвальним наростанням частки відповідного генопродукта у клітинах. Особливе місце серед мультигенных сімейств занімают супергены — дуже серйозні кластери з сотень функционально і структурно родинних генів, розміщених у пєгментів окремих хромосом. Класичним прикладом супергена може бути HLA комплекс, контролируюший головні антигени гістосумісності. Він займає район більш 6000 кб на доротком плечі хромосоми 6р21 і складається з серії тісно сцепленних генів, відповідальних за синтез безлічі білків, які включають клітинні поверхневі антигени, молекули иммунного відповіді і пояснюються деякі компоненти комплементу. До супергенным сімействам ставляться три комлекса розташованих на разных хромосомах мультигенов, контролюючих синтез важкі крейсери та легких ланцюгів імуноглобулінів. Цікаво, у процесі диффиренцировки B лімфоцитів, які продукують імуноглобуліни, відбувається не структурна перебудова цих сімейств. У цьому окремі послідовності ДНК элиминируются, тоді як інші зливаються, отже структура генів імуноглобулінів у стиглих B лимфоцитах істотно відрізняється від вихідної, тобто не від тієї, яка в зародкових клетках.

Однією із поважних на структурні особливості геному человека служить наявність про псевдогенов, унікальних послідовностей, дуже подібних за своєю структурою з впределенными нормальними генами, але з присутності додирующих послідовностях цілого ряду мутацій методных транскрибуватися чи правильно транслюватися з образованием структурно і функціонально активного продукта.

Псевдогены виявлено багатьом генів. Їхню кількість варьирует від однієї за кілька десятків копій на геном й у випадку вони, зазвичай розташовані тандемно. Іноді псевдогены тісно зчеплені з нормальними генами, у часто псевдогены і гени локалізовано у різних хромосомах.

Для деяких моногенных захворювань ідентифіковані мутантные аллели, подібні до мутаціями у псевдогенах. У таких випадках обсуждаеся можлива роль псевдогеновий в спнтанном мутаційному процессе.

У геномі людини присутні й нуклеотидные послідовності, гомологичные генам деяких вирусов.

Вперше ці послідовності були ідентифіковані в геноме вірусів, индуцирующих розвиток пухлин у тварин і звинувачують чоголовека, і відтак вони було названо онкогенами. Гомологичные послідовностям в геномі людини звуться протоонкогенів. Нині вже ідентифіковано понад сто протоонкогенов. Білкові продукти протоонкогенов, по-видимому, відіграють істотне значення за нормальної проліферації клітин особенно на ранніх стадіях ембріонального розвитку, контролюючи клітинний цикл і вибір геномної програми розвитку клетки.

У разі специфічних мутацій в протоонкогенах, і навіть при порушеннях регуляції його роботи, що виражаються в гіперпродукции чи зкспрессии в нетипичномном місці в невластивий момент життєдіяльності клітини, вони починають поводитися, як онкогены, стимулюючи неконтрольоване размножение і пролиферацию певних клітинних клонів, як і може, зрештою, до формування опухоли.

Розділ 2.4 Сучасне визначення поняття «ген », транскрипція, регуляторні елементи генов.

Близько 10−15% геному людини представлено унікальними транскрибируемыми послідовностями, складовими основу структурних генів (Льюин, 1987). Нині в понятие.

" ген «включається як його транскрибируемая область — экзоны + интроны, але й фланкирующие послідовності - лидерная, попередня початку гена, і хвостова нетранслируемая область, раположенная на 3 «кінці гена (Рис. 2.1). На відміну від генів прокариот гени людини рідко представлені однієї безупинної послідовністю й у гнітючому більшинстве мають переривчасту структуру. Щодо короткі які кодують ділянки — зкзоны, чергуються з довгими интронами, які транскрибируются і входять до складу первичного.

РНК-продукта, але потім при процессинге первинного РНК.

— транскрипта вони вирізаються і беруть участь у трансляции.

Процес вирізання интронов з первинних транскриптів отримав назву сплайсингу. Отже, в зрілої мРНК интронные області відсутні, а экзоны становлять безперервну кодирующую послідовність. Розміри зрілих мРНК нерідко тримають у десятки разів менша первинних РНК-транскрипов і, соответственно, розмірів самого гена.

Відповідно до класичним уявленням ген — це локус, на хромосомі, мутації у якому реалізуються лише на рівні фенотипу. У молекулярній біології ген сприймається як ассоциированний з регуляторними послідовностями фрагмент ДНК, відповідний певної одиниці транскрипції. Следовательно, ставлення до гені формальних генетиків далеко ще не повністю тотожні його фізичної одиниці і співвідношень між цими двома поняттями досить заплутані. Зазначимо деякі причини цих протиріч. Відомо, що мутації одного гена можуть спричинить зовсім різних і навіть у ряде випадків до комплементарних фенотипам. Результати прямого секвенування геному свідчить про присутності у ньому значного більшої кількості генів, чим можна чекати не від результатов мутаційного аналізу. Одна й та послідовникность ДНК в геномі може кодувати кілька різних білков, яка досягається з допомогою з так званого альтернативного сплайсингу (освіту різних мРНК вже з первичного.

РНК-транскрипта). У великих интронах низки генів виявлено смислові послідовності інших генів («ген в гені «), зчитувальні у напрямі. Транскрипционные одиниці геному можуть перекриватися завдяки наявності різних промоторів. Нарешті, завдяки соматичної рекомбінації структура транскрибируемых последовательнстей деяких геновий може бути різною у різних клонах клітин одного организма (Т-клеточные рецептори). Ситуація з визначенням понятия «ген «ще більше ускладнюється, тоді як це поняття включать численні регуляторні послідовності. Метушнікает питання: «І від гена можуть розташовуватися ці послідовності, щоб їх можна було включати у структуру гена? ». Багатьом цілей виявляється зручним запроваджене останнім часом поняття «рахований ген «- counting gene.

Останній сприймається як окрема транскрибируемая одиниця ДНК чи її частка, яка може транслюватися до однієї чи кілька взаємозалежних амінокислотних последовательностей. Тому послідовність, дає дві транскрипционные одиниці з допомогою альтернативного сплайсингу як наслідок, дві різні білка враховується одностайно ген.

Проте, якщо ступінь гомології двох генопродуктов, мають загальний транскрибируемый ділянку, невелика, то ці последовательности розцінюються як різних гена (Fields et al., 1994).

З власного функціональному призначенню гени можна розділити на дві групи. Група I представлена генами, кодирующими власне білки; група II — генами, контролирующими синтез рибосомальных, транспортних і ядерних РНК. По пхерактеру експресії гени також може бути підрозділені на дві групи — гени «домашнього господарства «(housekeeping genes), продукти яких необхідні забезпечення жизнедеятельности будь-якого типу клітин, і тканеспецифические гени, обеспечивающие спеціалізовані функції клітин, тобто гени, функціонально активні лише у певних типах клеток.

(тканин) і лише з певних стадіях онтогенезу, звані гени термінальній дифференцировки.

Вважається, що середні розміри гена людини составляют, приблизно, від 10 до 30 кб. Проте, їх кількість може долебаться від кількох основних десятків до мільйонів пар нуклеотидов. За даними, найменший з відомих генівМСС-7, має в діаметрі всього 21 п.о. (Gonzales-Pastor et al., 1994), а самий болшой — ген дистрофіну -2.2 мегабаз.

Гени від'єднані одне від друга протяжними проміжками — спейсерами, що містять у собі дуже багато повторюваних послідовностей ДНК і нетранскрибируемые унікальні последовательности.

Розглянемо докладніше сучасні дані про кількість генів у геномі людини. Отримані в спосіб оцінки цієї величены наведені у Табл.2.1. З розміру генома.

(близько 3 000 мільйонів п.о.), й середнього розміру одного гена порядку 10 — 30 тыс.п.о. (Gilbert, 1992), загальна кількість генів має бути порядку 100 000. У цьому, як зазначалося, розподіл генів на хромосомах вкрай нерівномірно. Вустановлено, що як 90% генів перебуває у Гимзаотрицательных районах метафазных хромосом, в про R-бэндах.

(Antequera, Bird, 1993). Проведені недавно прямі исследования методом секвенування показують, що у R-бэндах їх кількість сягає 43−50 однією бенд, а Гимзапозитивних районах хромосом (G бэндах), — лише 1−2 на 75−80 килобаз, тобто в геномі очікується близько 70 000 генов.

Оцінка числа генів за часткою транскрибируемой частини генома.

(всього 12%) дає зовсім маленьку величину — 20 000 генов.

(Wagner et al., 1993). Методом дослідження кінетики реассоциации РНК у культурі клітин число генів оцінюється между.

20 — 40 000 (Lewin, 1990). У той самий час у клітинах мозку число різних мРНК за деякими даними сягає 97 000.

(Wagner et al., 1993). Найточніші підрахунки числа генів людини проведено останнім часом і засновані оцінці числа CpG острівців (Табл.2.1). Відомо, що у промоторной області всіх генів «домашнього господарства «та приблизно у 40% генів термінальній диференціювання, які забезпечують специализированные функції диференційованих клітин, перебувають проласти коротких динуклеотидных CpG повторів. Розроблено молекулярные методи точної цих ділянок, які показали, що й число в геномі близько 45 000, звідси число структурних генів становить 67−70 000 (Antequera, Bird,.

1993). Практично таку саму кількість генів (64 000) визначено недавно методом обліку маркерних экспрессирующихся последовательностей (expressed sequence tags) (Fields et al., 1994).

Отже, підсумовуючи вищевикладене, можна дійти невтішного висновку, що у геномі людини міститься, загалом, близько 70−80 000 окремих транскрибируемых ДНК послідовностей, тобто генов.

Транскрипція гена починається з п’ятьма «кінця першої экзона, де міститься сайт ініціації транскрипциии. Певною гомології між стартовими сайтами різних генів не наблюдается, але найчастіше вони розпочинаються з нуклеотида А, оточенийного пиримидиновыми підставами. На межах між экзонами і интронами є консервативні канонічні последовательности, які відіграють істотну роль забезпеченні точності вирізання интронов під час сплайсингу РНК. Усі интронные послідовності розпочинаються з динуклеотида GT і заканчиваются динуклеотидом AG, званими, відповідно, донорными і акцепторными сайтами сплайсингу. На 3 «кінці багатьох структурних генів ідентифіковано поли (А)-сигнальная післядовательность (AATAAA), що у процесі модифікації первинного РНК транскрипта і відповідальна за альтернативний сплайсинг мРНК, який би синтез різних зрілих мРНК з однієї й того первинного РНК транскрипта.

Транскрипція генів здійснюється з допомогою фермента.

РНК-полімерази. Близько 50−70% клітинного синтезу РНК обеспечивается РНК-полимеразой I, локалізованої в ядрышках і зажадав відветственной за синтез генів рибосомальной РНК. РНК-полимераза II забезпечує транскрипцію генів, які кодують власне структурні білки. Цей фермент локалізований в ядрі (але не ядрышках). На її частку припадає 20 — 40% синтезу РНК.

РНК-полимераза III контролює синтез ядерних і транспортных РНК (Льюин, 1987). На 1-му етапі РНК-полимераза связывается з двухнитевым ділянкою ДНК і, розплітаючи його, робить доступним спарювання значеннєвий нитки ДНК з рибонуклеотидами.

(Рис. 2.2). Коли перший нуклеотид РНК инкорпорируется в сайт ініціації транскрипції, полимераза починає просуватися по нитки ДНК у бік 5 «- 3 », розплітаючи подвійні нитки ДНК перед собою і заплітаючи їх позаду. Цей процес відбувається триває до терминирующего сигналу, це чи кілька терминирующих кодоновий. Потім молекули РНК і ферменту вивільняються і подвійна спіраль (дуплекс) ДНК повністю восстанавливается.

Для правильного початку синтезу РНК необхідно точне взаємодія РНК-полімерази з молекулою ДНК. Цей процес відбувається контролюється промотором — спеціальної регуляторної післядовательностью ДНК розмірами близько 75 п.о., локалізованої, зазвичай, в розмірі 5 «-фланкирующей області гена. Іноді під медичним наглядом одного промотора зчитується кілька генів з проразованием єдиного первинного РНК-транскрипта. Промоторные області різних генів досить різноманітними зі свого нуклеотидному складу. Проте, майже всіх промоторів характерно наявність консервативної послідовності з 7 оснований з відривом 19−27 нуклеотидів зліва сайту ініціації транскрипції. Це правда званий, TATAбокс (блок Хогнесса), який би коректне розташування РНК полімерузы стосовно стартовому сайту. З віддалі 70 — 80 п.о. у бік 5 «-кінця з початку транскрипції часто лежить друга консервативна послідовністю 9 п.о. — CAATбокс, контролюючий початкова связывание.

РНК-полімерази. Мутації в TATAчи CAAT-боксах можуть существенно проводити швидкість синтезу РНК. У 5 «-фланкирующей області гена з відривом близько тисячі пар підстав з початку його яка кодує частини розташовуються інші регуляторні послідовності, звані инхансеры (підсилювачі), здатні різко збільшувати продукцію гена з допомогою увеличения швидкості транскрипції. Ці контролюючі елементи можуть працювати незалежно від своїх орієнтації стосовно сайту ініціації. Для деяких генів знайдено ділянки ДНК, подавляющие транскрипцію, і навіть звані аттенюаторы (ослабители) — послідовності, що лежать між сайтом ініціації транскрипції та власне геном. Вони можуть блокувати продвижение РНК-полімерази. Завдяки такого складного механізму контролю, досягається дуже тонка і ефективна регуляція експресії генів на всі етапи транскрипції, трансляції і безперервної освіти функціонально зрілого білка. Ці механізми детальніше розглянуті за іншими разделах.

Розділ 2.5 Мерехтливість геному, полиморфные сайти рестрикции, ПДРФ-анализ.

Які Кодують і регуляторні області структурних генів наиболее консервативні у процесі еволюції, оскільки мутації у яких піддаються тиску жорсткого природного отбора.

Справді, невеликі зміни у цих послідовникностях, навіть заміна одного підстави, делеция чи инсерция кількох нуклеотидів, можуть призвести до припинення синтезу білка або до втрати її функції, що, зазвичай, драматическим чином б'є по життєздатності особин, несущих подібні мутації. Проте, близько 90 відсотків% геному людини складається з некодирующих послідовностей, подібних сателлитным ДНК, помірним повторам, интронам і спейсерным промежуткам між генами. Ці ділянки значно більше мінливі утримують безліч, про нейтральних мутацій чи полиморфизмов, які мають фенотипического висловлювання й які мають помітного впливу життєздатність чи репродуктивные властивості особин отже, не схильних до прямому тиску природного відбору. Полиморфные локусы є зручними генетичними маркерами. За підсумками аналізу родоводів можна простежити їх успадкування у низці поколений, проаналізувати зчеплення друг з одним, з такими відомими генами і з анонімними послідовностями ДНК, тобто використовувати як звичайних менделевских ознак у «класичному генетичному аналізі. Інформативність полиморфных локусів визначається найвищим рівнем їхній генетичній изменчивости у різних популяциях.

Експериментально легко виявляються два варіанта геномного поліморфізму. Количественые зміни у області локализации мініі микросателлитных послідовностей ДНК і качественные заміни окремих нуклеотидів, що призводять до появлению поліморфних сайтів рестрикції. У першому випадку зрадчивость за кількістю повторених «коровых «одиниць створює серію алелів, характері і частота яких унікальні кожному за вариабильного локусу. Поліморфізм в сайтах рестрикції пов’язані з присутністю точковых нейтральних мутацій, локализованых, зазвичай, в унікальних послідовностях некодирующих ділянок ДНК. Такі мутації з вырожденности генетического коду (см. Глава 1) можуть бути й у які кодують послідовностях генів. Спонтанні мутації, що у сайтах впізнавання для певних рестриктаз, роблять їх резистентными до дії цих ферментів. Так, при таких заміни можна створювати нові сайти рестрикции.

Показано, що полиморфные локусы зустрічаються переважають у всіх хромосомах із частотою приблизно один поліморфний сайт на.

300−500 п.о. Цей тип мінливості ДНК було виявлено і использован для молекулярної маркування специфічних ділянок генома історично раніше проти вариабильными сателлитными повторами (Botstein et al., 1980).

Мутационная мінливість в сайтах рестрикції то, можливо легко виявлено зі зміни довжини рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся зі специфічними ДНК-зондами. Аналіз поліморфізму довжини рестрикционных фрагментів, так называемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism.

— RFLP analysis), входять такі етапи: виділення геноміншої ДНК, її рестрикцию специфічної эндонуклеазой, элекрофоретическое поділ які виникають фрагментів ДНК і ідентификацию фрагментів ДНК, містять поліморфний сайт рестрикции, шляхом блот-гибридизации по Саузерну (см. Главу 1).

За відсутності рестрикції в полиморфном сайті на электрофореграммах чи радиоавтографах (залежно від типу мечения.

ДНК-зонда) буде виявлятися значного фрагмент, соответствующий за довжиною послідовності ДНК між двома сусідніми константними сайтами рестрикції до тієї ж ендонуклеазы. За наявності рестрикції в полиморфном локусі на электрофореграмме житиме менший за величиною фрагмент, рівний відстані між полиморфным сайтом рестрикции одним із найближчих константних сайтів рестрикції. З котрим саме із двох фрагментів, що прилягають до полиморфному локусу, відбуватиметься гібридизація залежить від локализации використовуваного для аналізу ДНК-зонда. У приватному такому випадку можливий гібридизація разом з двома сусідніми рестрикционными фрагментами, якщо обраний ДНК-зонд комплементарен послідовності, що містить поліморфний сайт рестрикци. Проте, такі зонди дуже рідко використовуються на практику, оскільки довжина рестрикционных фрагментів зазвичай, у десятки разів більше довжини ДНК-зондов і який завжди удается виділити й проклонировать фрагмент ДНК, у якому полиморфный сайт рестрикції. Тому надалі для простоти викладу ми розглядати лише трохи більше загальну ситуацію і слід вважати, що за відсутності рестрикції в полиморфном сайте.

ДНК-зонд гибридизуется з однією довгим фрагментом, а при наличии рестрикції гибридизующийся фрагмент має меншу длину. Отже, під час аналізу ДНК особин, на обох хромосомах яких присутній сайт рестрикції в полиморфной проласти, на электрофореграмме буде виявлено лише одне бенд у нижній області гелю, відповідний більш короткому фрагменту ДНК. У особин, гомозиготных по мутації, изменяющей полиморфный сайт рестрикції, спостерігатиметься один бенд у верхній частині гелю, відповідний фрагмента більшої довжини, тоді як в гетерозигот проявляться обидві ці бенду (Рис. 2.3а).

ПДРФ-анализ то, можливо значно спрощений у разі, якщо можлива специфічна ампліфікація ділянки ДНК, содержащего поліморфний сайт рестрикції. Тестування стану цього локусу можливо шляхом проведення ПЛР і рестрикції амплифицированного фрагмента. За відсутності сайту впізнавання в досліджуваній галузі ДНК розміри амплифицированного фрагмента не зміняться саме його обробки відповідної эндонуклеазой, тоді як із повній відповідності полиморфной області сайту рестрикції утворюються два фрагмента меншою длины.

(Рис. 2.3б). У гетерозигот будуть присутні 3 фрагмента, одна з яких за довжиною відповідатиме розміру амплификата до рестрикції, плюс 2 маленьких фрагмента з тією ж сумарною довжиною. Отже, як у разі использования для аналізу блот гібридизації по Саузерну, трьом возможным варіантів генотипу відповідатимуть три різні варіанти электрофореграмм.

Слід підкреслити, що первинна ідентифікація полиморфных сайтів рестрикції, зчеплених з деякими генами, можлива лише за наявності відповідних ДНК-зондов. Подальша тактика залежить від пошуку рестрикційної нуклеазы, выявляющей поліморфізм. Для цього він використовують широкий набір эндонуклеаз для рестрикції геномної ДНК, выделенній із групи неродинних індивідуумів, що становлять репрезентативну вибірку популяції. Потім проводят.

ПДРФ-анализ окремо кожної з рестриктаз з набором имеющихся ДНК-зондов. Після виявлення поліморфізму на одній із популяцій аналогічні дослідження проводять у інших популяциях.

Слід враховувати, що полиморфные сайти рестрикції завжди є двухаллельную систему, тому такнавіть за найвищої вариабильности такого сайту, число гетерозиготных у цій локусу особин в популяції нічого очікувати перевищувати 50% Тим більше що, лише за наявності полиморфного сайту в гетерозиготному стані можна відрізнити мутантний аллель від нормального, тобто здійснити з його молекулярну маркірування. Отже, інформаційна ємність такого полиморфизма щодо невелика (див. Глави Y і VII).

Розділ 2.6 Вариабильные мікроі минисателлитные ДНК.

Гипервариабильные сателітні повтори є значно більше информтивными маркерами проти полиморфными сайтами рестрикції, оскільки є мультиаллельные системи з рівнем гетерозиготности, сягаючим 70 ;

90%. З іншого боку, виявилося, що його высокоизменчивых мікроі минисателлитных послідовностей в геномі человека, очевидно, перевищує кілька десятків тисяч, вони досить плідно і рівномірно розташований у кожній з хромосом. Так більш 90% з 5000 ідентифікованих (C-A)-повторів є полиморфными, причому у більшості їх уровень гетерозиготности значно перевищує 50% (Weissenbach et al, 1992). Серед гипервариабильных мини-сателлитных послідовностей розрізняють варьирующие за кількістю тандемные повтори — VNTR, три-, тетраі пентануклеотидные повтори, і навіть деяких інших класи повторів. Загальна кількість високополіморфних минисателлитных послідовностей в геномі перевищує 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,.

1994). VNTR (variable number tandem repeats — варьирующие за кількістю тандемные повтори) -характеризуються наявністю 10 — 15 — ти нуклеотидних «коровых «послідовностей, подібних з контролюючими елементами рекомбінації E. coli (Jeffreys et al., 1985). З допомогою ДНК-зондов, сконструйованих на основе тандемно повторюваних «коровых «послідовностей, можна аналізувати індивідуальну мінливість в одиничних чи багатьох высокополиморфных локусах, несучих однетипную коровую послідовність. Прикладом може служить.

VNTR, виявлена в интроне миоглобинового гена, куди входять чотири тандемных повтору з 33 п.о., фланкированных прямими повторами з 9 п.о. Отримані від цього району ДНК-зонды успішно йдуть на ідентифікації особистості методом.

ДНК-фингерпринта, оскільки можливість збігу алелів двох неродинних індивідуумів за всі гипервариабильным локусам, гибридизующихися з цим ДНК-зондом, значно менше 10!-7 (Jeffreys et al., 1991). Высокополиморфные VNTR знайдено й у гені інсуліну, у сфері глобинового псевдогена й у Х-хромосомі, що містить послідовності, гомологичные ДНК вірусу гепатиту У (Nakamura et al., 1985). Останнім часом численні VNTRпослідовності пронаружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O «Brien, 1992).

Пошук нових гипервариабильных локусів грунтується на систематическом скринінгу клонованих послідовностей ДНК з поміццю штучно синтезованих «коровых «зондів. Особливийале зручні для такого скринінгу геномные бібліотеки, сконструйовані з урахуванням попередньо фракционированных за величиною Mbo1 чи Sau3A1 фрагментів ДНК, оскільки великі фрагменти збагачені довгими і більше вариабильными минисателитными послідовностями (Armour, et al., 1990). Хороші результати отримано також за скринировании космидных бібліотек з допомогою G-богатых синтетичних ДНК-зондов і хемолюминесцентного методу разом із ПЦР.

(Decorte, Cassiman, 1990). У окремих випадках із метою застосовують також послідовності ДНК, виділені з фага.

М13, має у собі подібні структури (Armour etal., 1990).

Однією з варіантів минисателлитных послідовностей є тримерные і тетрамерные короткі тандемные повторы.

— STR (short tandem repeats), які стабільно успадковуються і мають високий рівень поліморфізму за кількістю коровых одиниць (Edwards et al., 1991). У X хромосомі такі повтори виявлено через кожні 300 — 500 кб, тоді в інших частинах геному вони зустрічаються з відривом 10 кб друг від друга. За деякими оцінками їх частота може становити 1/20 кб (Charlesworth et al., 1994). Можливо, истиное число триі тетрамерных повторів в геномі людину ще більше, оскільки вони виявили в багатьох генах. Подібно іншим повторам STR зазвичай зустрічаються в некодирующих частинах генів. Останнім часом, проте, виявлено група структурних генів, несучих тримерные повтори в регуляторних і навіть у трансльованих частинах генів. Зміни числа цих внутригенных повторів у бік їхнього збільшення може спричинить порушення функції цих генів до повного блоку експресії й можуть бути причиіншої низки тяжких захворювань — хвороби експансії (см. Главу X). Як зондів виявлення доротких тандемных повторів використовують синтетичні олигонуклеотиды, побудовані з простих повторів 3 або чотирьох нуклеотидов.

Останнім часом щоб виявити різних класів микросателлитных послідовностей і STR-повторов применяют ефективні методи, засновані на використанні ПЦР.

(Edwards et al., 1991). Для цих локусів характерно велика кількість алелів, які різняться за кількістю коровых единиц.

Продукти амплификации цих сайтів можуть бути різні друг від друга числом дітричи тетрануклеотидных повторів. Для зручності ідентифікації різних алелів полимеразную ланцюгову реакцію проводять у присутності мічених нуклеотидів, а электрофоретического поділу продуктів амплификации використовують спеціальні секвенирующие гелі. Багато STR-локусы настільки полиморфны, що застосовуються у судовій мідіцине для ідентифікації особистості. На підвищення достовірності результатів із метою використовують мультиплексные варианты.

ПЛР, дозволяють встановлювати генотип індивідуума одновременно з кількох STR-сайтам (Weber, May, 1994; Асєєв і др., 1995). Можливість точного генотипирования особистості з допомогою полімеразної ланцюгову реакцію, цебто в мінімальном кількості ДНК, є важливим методичним преимуществом STR перед раніше розглянутими VNTR, для аналізу доторых частіше використовують блот-гибридизацию по Саузерну.

Висока частота коротких тандемных повторів, уникальность комбінацій числа тетра-, триі димеров у різних сайтах разом із їхньої високої вариабильностью та порівняльній легкістю ідентифікації алелів дозволяє широко использовать ці повтори для генетичного й фізичного картирования у найбільш зручних індексних маркерів геномных.

ДНК-последовательностей (см. Главу III). Такі маркерні сайти дістали назву STS (sequence tagged sites). У настоющее час у геномі людини вже ідентифіковано близько 10.

000 STS, переважна що їх є тандемные повтори 2 — 4 нуклеотидів. Завдяки вираженої індивідуальної специфічності і стабільному менделевскому типу наслідування STS-сайты знайшли широке применение й у молекулярної діагностиці генних хвороб, насамперед у ролі молекулярних маркерів для ідентифікації мутантных хромосом у сім'ях великий ризик (див. Главу VII).

Наявність значної частини гипервариабильных мікроі минисателлитных послідовностей ДНК є характерною особливийностью геному людини. Аналогічні послідовності, пронаруженные в геномі приматів, значно більше однорідні, що доводить можливість істотного збільшення вариабильности їх ДНК за порівняно короткий эволюционный проміжок (Юров, 1988; Gray et al., 1991).

Відомості про мутабильности высокополиморфных последовательностей в геномі людини дуже суперечливі. Показано, проте, що в вариабильных минисателлитных локусах частота мутацій може становити 5% на гамету (Jeffreys et al., 1988). Передбачається, що з головних функцій гіпервариабильных мікроі минисателлитных последовательностей.

ДНК то, можливо контроль гомологичной рекомбінації в мейозе.

На культурах клітин показано стимулюючий вплив минисателлитных послідовностей ДНК на гомологичную рекомбинацию. Так, инсерция синтезованою послідовності, складеної з урахуванням гипервариабильных минисателлитов в геномную ДНК призводить до більш, ніж 10-кратному збільшення кількості реципрокных обмінів, причому ступінь цього впливу проратно пропорційна відстані між STR і сайтом рекомбинації (Wahls et al., 1990). Разом про те, багато авторів проращают увагу до досить високий стабільність минисателлитных алелів, що дозволяє їх широко використовувати як генетичного маркірування, так популяційних досліджень, і ідентифікації особистості методом ДНК-фингерпринта (Decorte, Cassiman 1993; Edwards et al., 1991; Іванов, 1989).

Багатьом мутацій, локалізованих в некодирующих частинах геному, характерні рівні популяционного полиморфизма. Необхідно, проте, підкреслити, що ця зрадчивость торкається загальної структури геному, визначальною різницю між видами. Понад те, сопосталение первинних нуклеотидних послідовностей порівняно протяжних секвенированных ділянок ДНК (області Т-рецепторных генів завдовжки близько 100 кб) виявило збереження високого рівня гомології у які кодують, а й, що особливо удивительно, в некодирующих частинах цих послідовностей. Коли ж врахувати, що еволюційно чоловік і миша розділені майже 80 мільйонами років еволюції, ці дані розглядаються як свидетельство функціональної значимості некодирующих частин цих генів Очевидно, далеко ще не всякі мутації в некодирующих районах ДНК є нейтральними й у певних случаях можуть мати негативний вплив на життєздатність. На жаль, нині нічого, або майже неизвестно про функції некодирующих ДНК-последовательностей.

Висловлювалося навіть припущення, що й єдиною функцией є реплікація. Звідси виникло уявлення об.

" егоїстичної «чи «паразитичної «ДНК. Звісно, цілковито виключити наявність подібних паразитичних послідовникностей ДНК у кожному геномі не можна. Тим ні менш, представляется малоймовірним, значна частина геному людини, як і інших напрямів, належить до егоїстичної ДНК.

Очевидно, наші знання про роль некодирующей чи, як ще кажуть, «надлишкової «ДНК досі замало. Стабильность структурної організації геному не більше виду свідчить скоріш про важливою еволюційної ролі некодирующих ДНК-последовательностей і про їхніх участі у процесах вінтогенеза. Можна припустити, відповідь цей інтригуючий питання на певною мірою отримають при розшифровці і сравнении повної первинної нуклеотидної послідовності геномов у тварин різних видів тварин і, передусім, в людини й миші, де прогрес в секвенировании геномної ДНК особливо значний (см. Главу III). До речі, що проведений недавно комп’ютерний аналіз геному людини дозволяє переддумати його присутність серед його некодирующей частини особливого, поки що незрозумілого генетичного коду, зміст і значення залишаються загадковими (?).

Розділ 2.7 Мобільність геному, облігатні і факультативные елементи генома.

До цього часу ми розглядали основні структурні еліменти геному людини, становище що у відповідність до уявленнями класичної генетики досить постоянно.

Починаючи з 1950;х років стали накопичуватися даних про істотавании значної частини мобільних генетичних елементів, що їх у геномі перестав бути обов’язковим, які топографія і кількість може варіювати у різних клетках, тканинах і в різних індивідуумів (McClintock, 1984; Berg,.

Howe, 1989). У прокариот такі елементи дістали назву транспозонов. Їх структура і функції досить добре изучены. Відмінною рисою мобільних елементів является здатність існувати як і інтегрованому з хромосомой вигляді, і у вигляді окремих макромолекул — эписом, плазмід, вірусних частинок. Майже 50 різних сімейств мобильных елементів описано у дрозофіли. Разом ці последовательности становлять близько 12-ї% гаплоидного набора.

(Golubovsky, 1995). У геномі ссавців міститься до 50.

000 диспергированных копій ретропозона LINE розміром около.

6500 пар основанийю. Сімейство Aluповторів, що містить от.

300 до 500 тисяч копій, також належить до мобільних елементів геному (Сharlesworth et al., 1994). Явище лизогенді, тобто присутність вірусних послідовностей у складі ДНК чоловіки й наявність фрагментів генів людини у вірусних геномах, слугує однією із прикладів мобільності ДНК й можливості «горизонтальній «передачі спадково закрепленних ознак між видами. Мобільні ДНК, зазвичай, ставляться до факультативним елементам. Як зазначалося, немає чітких меж між облигатными і факультативними елементами геному, оскільки може бути взаємний перехід від одного стану до іншого. Структурні локусы чи сегменти хромосом можуть трансформуватися на факультативні елементи з допомогою амплификации, інтеграції в мобільні елементи чи шляхом освіти цитоплазматических ретротранскриптов. Проратний перехід від факультативних елементів до облигатным осуществляется у вигляді инсерций, транспозон-индуцированных перебудов і зворотної транскрипции.

Факультативні елементи перебувають у геномі як популяции інформативних макромолекул. Зміни, що у них під впливом зовнішніх чинників, носять зовсім інший пхерактер проти класичними мутаціями в структурних локусах. Для описи змін — у факультативних елементах запропонований термін «варіації «(Голубовський, 1985). Цей терхв вперше використаний Жакобом і Воллманом для описи поведення эписом (Jacob, Wollman, 1961). Варіації можуть приводить до змін на генотипическом рівні, тобто до мутациям, внаслідок простого переміщення факультативних элементов чи зсуву у співвідношенні між факультативними і облігатными елементами. У таких випадках мутації зустрічаються одновременно в багатьох індивідуумів. Такі зміни упорядочены, можуть коїтися одразу у багатьох локусах і отличаются високої сайт-специфичностью. Локалізація структурних перебудов, що виникають внаслідок варіацій, предопределена початкової топографією факультативних елементів на хромосомах. І, насамкінець, самі варіації може бути индуцированы звичайними «не-мутагенными «чинниками, такі як температура чи межлинейные кроси (Golubovsky, 1995). Факультативні елементи можна розглядати як оперативна пам’ять геномало, оскільки у часто спонтанне виникнення мутаций в облигатных елементах опосередковано їх активацією. Считается, зокрема, що инсерционный мутагенез причина спонтанного виникнення 70% видимих мутацій у природних популяціях дрозофіли. Проте, в людини поки зарегистрированы лише одиничні випадки виникнення мутацій внаслідок переміщення мобільних елементів геному (Vidaud et al., 1993).

Розділ 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные сайты.

Перераховані вище компоненти геному невипадковим образом пов’язані з послідовностями нуклеотидів. І це сенсі можна говорити про існування в геномі людини структур вищого ієрархічного порядку. Прикладом служать изохоры — довгі, загалом, понад 300 кб сегменты.

ДНК, гомогенні композиційно підстав чи з GC-уровням.

62% геному складається з GC-бедных изохор і над ними локалізовано близько 34% генів, 31% геному представлений GC-богатыми изохорами, що містять 38% генів, й у 3% изохор, обогащенных.

GC-последовательностями (про H3 изохор), находится 28% генів (Mouchiroud et al., 1991; Saссone et al.,.

1993). Отже, існують відносно невеликі ділянки ДНК, у яких щільність генів у 10 -20 разів більше, ніж у інших последовательностях.

Інший спільною рисою геному людини є те, що in vivo значна частина цитозиновых залишків в молекулі ДНК метилирована, т-є перебуває у формі 5-метилдезоксицитидина. Експериментальне вивчення характеру метилування грунтується на зіставленні рестрикционных фрагметов, утворющихся після обробки ДНК эндонуклеазами, котрим сайти впізнавання однакові утримують у собі цитозин, а діють ці ферменти по-різному, залежно від цього, перебуває це підставу в метилированном змозі або немає. Зокрема, рестриктазы — Msp1 і Hpa11, дізнаються післядовательность CCGG, та на відміну від Msp1, Hpa11 не расщепляет ДНК у його сайтах, де внутрішній CpG динуклеотид мітилирован. Деякі сегменти геному, особливо це стосується повторюваним послідовностям, повністю метиловані у місцях 5 «-CCGG-3 «і лише частково метиловані в розмірі 5 «-GCGC-3 «- сайтах рестрикції для Hha1. За інших сегментах спостерігається характерний малюнок часткового метилування в розмірі 5 «-CCGG-3 «послідовностях (Behn-Krappa et al., 1991). Різні індивідууми, незалежно від своїх етнічного походження, мало різняться характером метилування ДНК тільки в і тієї ж типах тканин, тоді як у процесі онтогенетической диференціювання відбуваються значних змін малюнків метилування. У перевиваемых культурах клітин опухолевого походження число метилированных сайтів різко уменьшено.

Висловлено припущення щодо наявності прямого зв’язку між метилированием ДНК і станом генетичної активності у клітинах. Існує клас білків, які специфічним проразом пов’язуються з метилированными ділянками ДНК, робить їх недоступними на дію низки ферментів, зокрема, візможна, й у полимераз. Отримано багато прямих экспериментальных доказів ролі метилування ДНК в інактивації эукариотических промоторів, отже, й у регуляції активности генів. Навпаки, гипометилирование промоторной області генів, особливо CpG острівців, зазвичай, свидетельствует про функціональної активності генів. Показано, що незвичні структури в молекулі ДНК, як і экзогенная.

ДНК, інкорпорована у процесі генетичної трансформации, нерідко піддаються метилированию. Відомо, що метилирование відіграє в інактивації X хромосоми у самок, в регуляції експресії генів у процесі розвитку, і навіть безпосередньо залучено в феномен хромосомного (геномного) імпринтингу, що з відмінностями пенетрантности деяких алелів залежно від своїх походження, тобто проходження через материнський чи батьків гаметогенез (баранов, 1991).

У GC-богатых изохорах локалізовано велике количество.

CpG острівців — послідовностей від 500 до 2000 п.о., пхерактеризующихся дуже високий змістом гуанина і цитозина.

(G+C > 60%), які у вигляді кластерів неметилированных CpG дуплетов й дуже званих, G/C боксів — локусів, родинних сайту впізнавання одного з транскрипционных чинників Sp1 — (G)4C (G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;

Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова є багато сайтів впізнавання для чутливої до метилированию эндонуклеазы.

HpaII, і навіть сайти для редкощепящих рестриктаз, котрі дізнаються неметилированные CpG дуплеты. Зокрема, більш 80%.

Nor1-сайтов пов’язані з CpG-богатыми острівцями. Як правило,.

CpG острівці локалізовано в розмірі 5 «- що фланкують послідовникностях, 5 «-зкзонах і п’яти «-интронах всіх вивчених хаузкипинг-генов і 40% тканеспецифических генів. CpG острівці являются характерною рисою транскрибируемых ділянок геному. Їх ідентифікація в клонованих послідовностях геномних бібліотек істотно полегшує пошук конкретних структурних генів (см. раздел 2.4). Найбільша щільність CpG острівців зокрема у теломерных ділянках хромосом 1, 9,.

15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis, 1994). Точні молекулярные методи реєстрації СрG острівців показали, що й число в геномі людини наближається до 45 000 (.

Antequera, Bird, 1993).

Можна зазначити існування у геномі людини сайтів, гиперчувствительных до дії ДНК-азы 1 і структурале від основної маси хроматина. Присутність таких сайтів показано багатьом генів ссавців і, по-видимому, це необхідне, але з достатня умова їх експресії. Локалізація гиперчувствительных сайтів може меняться у розвитку й під дією гормонів. У недоторых випадках ці ділянки маркірують становище транскрипционных регуляторних елементів геному, діючих як і покладительном, і у негативному напрямах. За інших случитиях це області функціонально активних генів, що у деспирализованном стані перебуває й мають однонитевую структуру.

Саме через такі однонитевые ділянки ДНК особливо выско чувствительны до ДНК-азе 1. У цьому їх властивості грунтується метод ник-трансляции in situ, дозволяє безпосередньо на хромосомных препаратах візуалізувати функціонально активні райони хромосом. Для цього він хромосомні препарати обрабатывают ДНК-азой 1, після чого безпосередньо них з поміццю ДНК-полимеразы проводять синтез ДНК у присутності мечіных нуклеотидів. У цьому мітка включається переважно лише у ділянки хромосом, где перебувають функціонально активные гени (Verma, Babu, 1989).

ГЛАВА YIII.

БІОЛОГІЧНІ МОДЕЛІ СПАДКОВИХ ХВОРОБ ЧЕЛОВЕКА.

Розділ 8.1. Генетичні лінії животных.

Велика роль дослідженні проблем генетики человека та медичної генетики належить мутантным генетичним лініях тварин і звинувачують, особливо, генетичним лініях мышей.

(Конюхов, 1969, 1980; Корочкин, 1978). Високий відсоток подібності по нуклеотидными послідовностям між кодующими, регуляторними і навіть интронными областями гомологичных генів ссавців і авторитетної людини, і навіть наявність значної частини консервативних груп зчеплення з ідентичним расположением генів поруч із можливостями використання дуже потужних експериментальних підходів для ідентифікації і клонування генів лінійних тварин дозволяють проводити паралельні дослідження, значно що прискорюють ефективність пошуку миру і молекулярного аналізу індивідуальних генів человека.

Багатьом моногенных захворювань людини тварини, які мають мутації в гомологичных генах, найкращі, а й у єдиними моделями на дослідження молекулярных основ патогенезу і детального відпрацьовування оптимальних схем лечения, зокрема і із застосуванням методів генної терапии.

(см. Главу IX). Пошук таких біологічних моделей, передусім, ведеться, серед вже існуючих генетичних ліній тварин із встановленим типом наслідування певних аномальних ознак. Найважчою у своїй є доказательство ідентичності мутантних генів і первинних біохімічних дефектів, в людини й у лінійних животных.

У різних розплідниках світу, зокрема у Росії, вже створені і підтримуються кллекции, що існують уже від десятків до кілька сотень генетичних ліній різних экспериментальных тварин — мишей, пацюків, кроликів, собак та інших. (Конюхов, 1969; 1980; Staat, 1969; Hogan et al, 1989; Бландова та інших., 1990). У тому числі генетичні лінії мишей найбільш многочислены насамперед через високе плодючості, зручності змісту, відносної легкості экспериментального маніпулювання цілого ряду інших причин. Деякі з цих ліній є випадкові знахідки, інші, які більшість, одержані результаті дії різних мутагенних чинників. Так, дуже багато біологічних моделей отримали шляхом біохімічної селекції потомства мишей самців, опрацьованих сильними мутагенами — этилнитрозмочевиной, триэтиленмеламином чи опромінених Рентгеном. То існували змодельовані мишах альфа-талассемия, полицитемия, нирковий ацидоз (Erickson, 1988). Проте, такий спосіб підлозічения животных-моделей, хоч і ефективніший, ніж пошук спонтанно мутованих особин, також грунтується на чистої случайности не дозволяє цілеспрямовано змінювати структуру потрібного гена.

Процес створення таких генетичних ліній зазвичай включає відбір особин з фенотипическими відхиленнями; аналіз наслідування цих фенотипческих ознак; тривале білякородственное розведення відселектованих особин. При моногенному успадкування такі лінії можуть або повністю складатися з мутантних гомозигот, або підтримуватися через гетерозиготных особин у разі зниженою життєздатності і нарушения плодючості у гомозигот.

У першому етапі пошуку адекватної моделі будь-якого моногенного спадкового захворювання керуються подібністю клінічних проявів течії хвороби та фенотипом мутантних тварин. Проте, самого цього подібності недостаточно (Конюхов, 1969). Необхідно довести гомологичность генотипической природи можна побачити порушень, тобто доказать, що в людини і в тварин (мишей) фенотипічні зменения обумовлені мутаціями в гомологичных генах. Величезна світова генетична колекція мишей насчитывет кілька сотень ліній, у кожному у тому числі різні дефекти наследуются по моногенному типу. Спонтанні біологічні моделі спадкових хвороб відомий і досить повно вивчені багатьом інших експериментальних та домашніх животных.

Звісно ж дивовижним, що, попри велике подібність геномів ссавців та наявність близьких по первичіншої структурі та тотожних виконуваних функцій структурних генів, для значній своїй частині спадкових хвороб людини генетические аналоги серед тварин досі не знайдено (Конюхов, 1969).

Це обмеження нині то, можливо преодалено шляхом цілеспрямованого конструювання генетичних модельных ліній тварин. Експериментальні основи такий підхід якого добре розроблено (Erickson, 1988; Аллен та інших., 1990;

Melton, 1993; Stewart et al., 1994). І тому використовують техніку культивування й трансфекції ембріональних стволовых клітин (см.ниже), відбір in vitro клонів із «потрібними генетческим змінами і пересадку в зародки чи соматические тканини тварин. Для аналізу експресії мутантних геновий in vivo з оцінкою їх біологічного дії особливо зручними виявилися трансгенні животные.

Розділ 8.2. Трансгенні животные.

Трансгенних тварин одержують у результаті искусственного запровадження — трансгеноза, чужорідного генетичного матіриала, що становить з себе фрагмент гена або ту післядовательности ДНК, в запліднену яйцеклітину чи ранні зародки ссавців. Такі моделі ідеальними експериментальними системами на дослідження молекулярно-генетических основ онтогенезу, вивчення функції чужерідного гена, оцінки його біологічного дії на организм, і навіть для різних маніпуляцій зі специфическими клітинними клонами in vivo. Розроблено неякдо способів отримання трансгенних тварин. Історично более раннім і дуже застосовуваним до нашого часу является микроиньекция чужорідної ДНК в пронуклеус — ядро оплодотворенной яйцеклітини. Існують детальні цього методу (Аллен та інших., 1990; Hogan et al, 1989). Суть методу у тому, під контролем мікроскопа з допомогою мікроманипулятора у чоловічий пронуклеус заплідненої яйцекльотки тонкої голкою (до 1 мікрона) вводять близько двох пиколитров розчину ДНК. Чужорідна ДНК, спочатку вільно що у нуклеоплазме, протягом кількох наступних ділень дробления випадково інтегрує одного з сайтів каабо хромосоми, тобто вбудовується в ДНК-реципиента.

У цьому, як показали експерименти з міченої ДНК, в различных бластомерах однієї й тієї ж дробящегося зародка интеграція може статися у різні хромсомные сайти й число інтегрованих копій ДНК у кожному з цих сайтів може значительно варіювати. Проте, оскільки сам ембріон розвивається, по суті, вже з бластомера, переважають у всіх клітинах такий особини після народження чужорідна ДНК звичайно знаходиться тільки одного якомусь хромосомному сайті, хоча в різних особин вона інтегрується по-різному й у різні сайти. Після запровадження чужорідної ДНК в пронуклеус яйцеклітину трансплантируют самке-реципиенту. Частка трансгенних тварин за прийдешнім таких самок варіює від 10% до 30%. Це означає, що удобный механічний варіант трансфекції чужорідних генів у ранній стадії ембріогенезу є надзвичайно эффективным.

Ідентифікацію трансгенних тварин виробляють шляхом аналізу геномної ДНК на наявність екзогенних послідовностей, іввикористовуючи у своїй методи блот-гибридизации чи ПЛР. Экспресцю введеного гена аналізують шляхом ідентифікації специфических мРНК і/або відповідних білкових продуктів в разособистих тканинах трансгенного животного.

Інший, більш прогресивніший спосіб отримання трансгенних тварин грунтується у тому, що трансфекції подвергается не зигота, а тотипотентные ембріональні власні стовбурні клітини (см.ниже), які потім трансплантують в порожнину бластоцисты (Gardner, 1978). Цей метод та її вирішальні претамущества у плані генетичного моделювання докладно розглянуті розділ 8.4.

Зазвичай, иньецированная ДНК при вбудовування в хромосому утворює блок з багатьох тандемно розташованих допий, у своїй число одиниць повтору у різних особин може варіювати від одиниці за кілька сотен.

Після інтеграції введеної ДНК в хромосому різні генетические конструкції стійкі і стабільно передаються потомству відповідно до законами Менделя. Вбудовування введенной ДНК в функціонально значимі галузі геному може спричинить їх дестабілізації і супроводжуватися появою мутацій, спектр яких різноманітний. Таким чином, тварини, отримані під час введення однієї й тієї ж гена, судутий різнитися як у сайтах інтеграції, і по количеству копій вбудованої чужорідної ДНК, а окремих випадках, за рівнем мутабильности і з типам индуцированных мутаций.

Отже, кожне трансгенну тварина у сенсі уникально.

Трансгенні тварини є черезвычайно зручним обектом для аналізу ролі окремих елементів гена в регуляції його роботи. Так, зіставлення характеру експресії запровадженоного гена у тварин, різняться за довжиною фланнкирующих послідовностей иньецированной ДНК, дає можливість пронаружить елементи гена, контролюючі його у різних типах тканин. Для полегшення аналізу регуляторних последовательностей гена часто вводять генетичні конструкції, сочеякі тануть ці елементи з геном-репортером, експресія якого виявляється у появу відомої й легко обумовленою ферментативной активності. Використання для трансгеноза рекомбинантных молекул ДНК, що становлять різні комбинації регуляторних елементів і які кодують последовательностей, веде до глибшого розуміння молекулярних механизмов активації генів у різних типах тканей.

Як вказувалося, випадковий інтеграції чужерідний ДНК нерідко індукує мутації порушує експресію нормальних генів реципієнта. Нерідко спостережувані втклонения у розвитку виявляються аналогічними чи подібними з роботи вже відомими спадковими порушеннями в людини й подобные тварини також можна використовувати як генітических моделей захворювань. Такий підхід застосували щоб одержати моделей таких захворювань, в патогенезі яких на вирішальній ролі грає ефект дози генів. Зокрема, шляхом трансфекції зиготи мишей генами бета-глобина, колагену, реніно, антигенів гістосумісності удалося одержати біологические моделі таких захворювань, як бета-талассемия, незвершенный остеогенез, гіпертонія і діабет, соответственно.

(Erickson, 1988). В усіх цих випадках запровадження дополнительной дози экспрессирующего гена зумовлювало нарушению балланса білкових генопродуктов у клітинах як і следствие цього, було причиною патологічних процессов.

Розділ 8.3. Експериментальне моделирование.

Інший варіант біологічного моделювання грунтується на отриманні тварин із певними дуже специфічними, але ненаследственными змінами. Ці тварини також можна використовувати для аналізу молекулярних основ патогенезу і розробки методів адекватного лікування. Розглянемо кілька прикладів подібного експериментального моделирования.

Застосування згаданої технології трансгеноза (запровадження генів у пронуклеус) можна використовувати, зокрема, для направленного отримання тварин із виборчими дефектами.

(каліцтвами) тих чи інших тканин та органів. Метод укладаєся щодо можливості селективною елімінації тих специфічних типів клітин, які відсутні чи дефектні в хворих з моделируемым типом захворювання. Такі тварини можна отримати при иньекции в зародок рекомбінантною ДНК, утримуючищей будь-якої цитотоксический ген, наприклад, ген дифтерийного токсину, під контролем що працюють у определенних типах клітин регуляторних елементів ДНК. При активуции цих контролюючих елементів на определеной стадії развітія експресія токсичного гена призводить до виборчої загибелі всієї специфічної популяції клітин, тобто таку систему діє і як дуже точний скальпель.

Подальша модифікація методу залежить від использованді для трансгеноза умовно летального гена, яким є, наприклад, ген тимидинкиназы вірусу Герпесу. Клітини, экспрессирующие цей ген, функціонують цілком нормальале. Проте, про всяк стадії онтогенетического розвитку можна викликати їх селективну загибель під час введення тварині ганцикловира — противогерпесного препарату. Цю систему дає більше можливостей для експериментального аналізу ролі специфических клонів клітин на процесі розвитку, а такдля вивчення патологичеких процесів, що з загибеллю цих клітин. Така методологія застосовується також розробки генотерапевтических підходів на лікування некоторых ненаследственных, зокрема онкологічних заболеваний (див Главу IX).

Дуже багатообіцяючим методом моделювання представляется спрямоване вимикання роботи певних генів шляхом введення в доимплантационные зародки антисмысловых мРНК.

Такий підхід застосований, зокрема, під час спроби моделірования хвороби Гоше — лизосомного захворювання, обумовленийного дефіцитом бета-глюкуронидазы (Bevilacqua et al., 1988).

Природно, у цьому разі вимикання експресії гена носить транзиторный характер, тобто моделлю, по суті, является саме тварина — реципієнт антисмысловой мРНК матрицы.

Інший приклад експериментального моделювання грунтується на пересадці тканин чи клітин атимусным иммунодефицитным мишам nu/nu. У мишей лінії у зв’язку з відсутністю тимусу й вираженим уродженим імунодефіцитом немає отторжение трансплантированных чужорідних тканин. Понад те, таким тварин може статися диференціювання трансплантированных підшкірно ембріональних зачатків і регенерація пересаженных шматочків тканин із різних органів інших напрямів тварин і людини. Приміром, шматочки трахеї пацюки з нанесеними ними клітинами бронхогенного епітелію людини, імплантовані підшкірно атимусным мишам, формують структуру поверхового епітелію, подібну з тим, що є в бронхах людини. Саме такою шляхом миші nu/nu були активно використовуватимуться аналізу експресії мутантних вариантов гена муковісцидозу людини, і навіть випробування еффективности корекції цього генетичного дефекту з допомогою методів генотерапії. У разі мутантні эпителиальные клітини пацієнтів із муковісцидозом спочатку піддавали трансфекції ретровирусными чи аденовирусными векторами, несущими, поруч із геном — репортером, полноразмерную кДНК нормального гена муковісцидозу. Відносна простота подобных моделей і можливість генетичного маніпулювання з клітинами людини до їх трансплантації атимусным мишам справиют цей підхід дуже на місце рішення багатьох експериментальних питань. Основні недоліки таких моділей пов’язані з труднощами забезпечення і розведення атимусных мишей та його низькою життєздатністю. Генетичні лінії животных цьому плані мають значні преимущества.

Розділ 8.4. Конструювання модельних генетичних чиний животных.

Сучасний рівень експериментальної ембріології млекопитающих i сучасні досягнення молекулярної генетики дозволяють здійснювати спрямоване отримання генетичних моделей спадкових хвороб шляхом введення сайт-специфических модифікацій в геном ссавців. Такий великий якісний прорив у генетичному моделюванні став возмодружин завдяки появі принципово нову технологію надьпулирования з ранніми зародками ссавців. Особливо важливими цьому плані виявилися дві нові методичних підходу: отримання зародышей-химер, які з клітинних клонів різних зигот, шляхом введення тотипотентних клітин на порожнину бластоцисты (Gardner, 1978) й розробка технології культивування клітинних векторів, про эмбриональных стовбурових ембріональних клітин (Evans, Kaufman, 1981). З іншого боку, з’явилися методи сайт-специфического перенесення клонированных послідовностей ДНК в геном эукариот, основанні на відборі клітинних клонів, у яких після трансфекции відбувається инсерция екзогенної ДНК в гомологичном сайті геномної ДНК без будь-якого порушення последовательности.

ДНК на місці встраивания.

Конструювання генетичних моделей повинні предшествовать ідентифікація і з порівняльного аналізу двох гетерологичных генів — гена людини, внаслідок порушення роботи которого розвивається моделируемое захворювання, та її гомолога у обраного для моделювання тваринного. При виборі об'єкта моделювання, насамперед, керуються методическими можливостями експериментального маніпулювання з животными. Важливе значення має тут подібність які кодують областей гетерологичных генів по нуклеотидным послідовностям. Найчастіше миші видаються найзручнішим обьектом для моделювання. Сучасний алгоритм формирования генетичної лінії тварин із мутаціями в заданому гені передбачає: (1) наявність культур тотипотентних, тобто талановитими в необмеженому розвитку і дифференцировке, эмбриональных стовбурових ембріональних клітин; (2) створення з урахуванням рекомбинантных ДНК генно-інженерних конструкцій для спрямованого перенесення генів; (3) трансфекцию цих конструкцій в культури ембріональних стовбурних клітин наступним скринингом і південь відбором клонів зі специфічними генетичними модификациями;

(4) запровадження відібраних модифікованих клітин на зародок на стадії бластоцисты методом Гарднера для одержання химірних трансгенних тварин; (5) відбір химерних особин, несущих модифіковані гени у різних тканинах і органах;

(6) селекцію особин, гетерозиготних з цієї мутації; (7) инбредное розведення і селекцію гомозигот (Рис. 8.1).

Як згадувалося раніше, ідеальної системою для направленного перенесення мутацій в геном ссавців є эмбриональные власні стовбурні клітини — ЕСК (Evans, Kaufman, 1981;

Erickson, 1988; Labosky et al., 1994). Первинні культури цих клітин отримують з клітин бластоцисты (внутрішньої клеточної маси) або з первинних статевих клітин ранніх селтимплантационных зародків. При вирощуванні на живильному шарі з ембріональних фібробластів ЕСК зберігаються в недифференцированном стані від трьох місяців і до року. Водночас може бути кілька разів заморожені і оттаяны без втрати здібності до дифференцировке. ЕСК, запроваджене бластоцель.

(порожнину бластоцисты), зберігають свою тотипотентність і могут брати участь у формуванні, практично, всіх эмбриональных зачатків органів що розвивається зародка. У результате утворюється тварина — химера, що складається з клеточных клонів різних типів: клітин вихідного батьківського генотипу і ЕСК. Якщо такі клітини різняться, наприклад, по генам забарвлення вовни, тварина — химера матиме поперечную чи плямисту забарвленість. У цьому все тварини, независимым чином отримані внаслідок запровадження одинакошиї по генотипу зародки одному й тому ж лінії клітин, різнитимуться друг від друга характером плямистістю, бо всі химери різні по набору клітинних клонів, розвинених і дифференцировавшихся введеною в зародок ЕСК. Химерні тварини, які мають ЕСК диференціювалися на клітини, і дали початок повноцінним зрілим гаметам будуть стійко передавать своїм нащадкам генетичну інформацію, що міститься в ЕСК. Таких тварин ингда називають зародковими трансмиттерами. При схрещуванні його з мишами дикого типу частинутомков буде оголошено вже гетерозиготна по мутантным генам ЕСК, тобто нестимуть мутацію в гаплоидном стані кожному типе клітин. Це однаковою мірою стосується й мутацій, івкусственно запровадженим попередньо в ЕСК. Схрещуючи таких гетерозигот, можна отримати роботу тварин, гомозиготных по заданийіншої мутації. Природно, останнє досяжно в тому разі, якщо мутація бракуватиме летальної в гомозиготном стані у тварин цього вида.

Можливість вести селекцію потрібних мутантних чи трансгенних клонів ЕСК і потім їх використати в качестве клітинних векторів знайшло широке використання у генетическом моделюванні. Спочатку цієї мети ЕСК обрабатывали різними мутагенами (этилнитрозомочевиной) отбирали клони клітин, несучих мутацію у властивому гені, і далі використовували їх задля створення ін'єкційних химер по Гарднеру.

У такий спосіб на мишах отримали модель хвороби Леш-Нихана — мутація гена гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы.

(Hooper et al., 1987). З розробкою технології адресної доставки чужорідної ДНК в гены-мишени цей спосіб генетического моделювання став особливо ефективним. Сайт-специфическая модифікація генів ЕСК досягається з допомогою гомологичной рекомбінації між екзогенної і хромосомної ДНК. При трансфекції більшість проникли в ядра молекул рекомбинантной ДНК зберігається там протягом днів як кільцевих эписом й надалі втрачається або відбувається інтеграция трансфецирующей плазміди в геном клітинихазяїна шляхом негомологичной рекомбінації, тобто у випадкові сайти хромосомної ДНК. У цих клітинах експресія запроваджених генів стійко зберігається. Частота інтеграції екзогенної ДНК может бути підвищено під час використання лінійних плазмід і специальных, переважно, ретровірусних векторів экзогенной.

ДНК (див. Главу IX). Випадки стабільної інтеграції экзогенной.

ДНК може бути легко виявлено, якщо трансфецирующие плазміди чи вектора містять селектируемый маркерный ген. Найчастіше за ролі маркера використовують прокариотический ген neo, зіобщающий клітинам опірність неомицину. Клітини, у яких відбулася інтеграції такий плазмідами в хромосомну ДНК, становитимуть стійкі клони при вирощуванні на середовищі G418, що містить неоміцин, тоді як інші клони клітин будуть у умовах деградировать.

Розділ 8.5. Методи спрямованого перенесення генов.

Найважливішим кроком по дорозі штучного отримання мутантной лінії тварин є відбір клонів ЕСК з сайт-специфической модифікацією певного гена. Проте, випадки инсерции екзогенної ДНК в ген-мишень дуже рідкісні, їхня загальна частота, зазвичай, вбирається у 10−6. Робляться спроби генетичної модифікації ЕСК про те, щоби підвищити у яких частоту гомологичной рекомбінації. Ідентифіковані неякі гени, контролюючі той процес у мишей і в чолостоліття. Проте, у разі схеми спрямованої модифікації генів мають включати селекцію потрібних клонів клітин. Вперше спрямована сайт-специфическая модифікація було виконано на гені гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы (див. вище) і було отримана ще одне генетична лінія мишей, моделирующая викликану дефектом в HPRT-гене хвороба Леш-Нихана у чоголовека (Thomas, Capecci, 1987). Успіх цих досліджень, насамперед, обумовлений існуванням простих схем отбора клітин із функціонуючим і нефункционирующим HPRT-геном на селективних середовищах. Важливо також, що цей ген локалізований в Ікс-хромосомі й у ХУ-клетках він представлений однієї копией.

За цих умов випадки модифікації гена, викликані инсерцией екзогенної ДНК в правильному становищі, легко идентифицируются — Рис. 8.1 (див. Главу X).

Нині запропоновано кілька варіантів для спрямованого перенесення неселектируемых генів з допомогою дополнительной инсерции в трансфецирующую плазміду селектируемого маркерного гена у стані, у якому його экспресця відбувається за умови правильного вбудовування векторної послідовності в ген-мишень (рис. 8.2). Так, маркерный ген neo, поміщений у инсертируемую область ДНК плазміди без власного промотора, може экспрессироваться лише з під контролем будь-якої іншої промотора хромосомної ДНК. І тому инсерция екзогенної ДНК має відбутися до області гена-мишени без зсуву рамки считывания.

При випадкової інтеграції експресії маркерного гена не будет.

Отже, відбір неомицин-устойчивых клітин призведе до різкого збільшення частоти клонів, у яких відбулася гомологічна рекомбінація між зкзогенной і геномної ДНК. А на цьому принципі грунтується використання генетичних конструкций з геном neo, не що містить поли-А послідовності в 3 «області. Подальший пошук гомологичных рекомбинантов серед G418-устойчивых клітин проводять шляхом блот-гибридизации, використовуючи як ДНК-зонда фрагмент векторної селледовательности, розташований поза цілеспрямовано стерпного ділянки екзогенної ДНК.

Особливо перспективною на сегоднешний день представляется метод позитивно-негативной селекції (Melton, 1994). Метод поєднує відбір клітин, у яких відбулася інтеграція екзогенної ДНК, із селективною элиминацией тих, де убудовування сталося з допомогою негомологичной рекомбинации.

І тому маркерный селектируемый ген neo з регуляторними послідовностями инсертируют в стерпну область ДНК плазмідами, а поза цій галузі убудовують умовно летальний вірусний ген тимидинкиназы герпесу (HSV-tk). При інтеграції такого вектора в геномную ДНК шляхом гомологичной рекомбинации HSV-tk ген не инкорпорируется в хромосому, тоді як із негомологичной рекомбінації цей ген житиме в неомицин-устойчивых клітинах. Обробка таких клітин противогерписным агентом — ганцикловиром, супроводжуватиметься гібілизні всіх клонів, экспрессирующих вірусну тимидинкиназу.

(Рис. 8.3).

Відбір клітин із модифікованим геном він може пропереводитися з допомогою ПЛР. У цьому не використовують будь-які маркерні гени і/або селектируемые середовища. Олигопраймеры для амплификации вибирають в такий спосіб, що з них гомологичен сусідньої з сайтом інтеграції послідовності модифицируемого гена, а інший відповідає ділянці инсертируемій екзогенної ДНК (Рис. 8.4). Метод дозволяє виявляти присутність п’яти правильно модифікованих клітин среди.

50 000. Після трансфекції клітини поділяються на групи, у кожному у тому числі проводять дослідження за допомогою ПЛР. При позитивному відповіді групу клітин розбивають на підгрупи і процедуру повторюють до того часу, доки вдається ізолювати потрібні клоны.

Надісланий вимикання генов-мишеней то, можливо досягнуто кількома способами. Так звані, нульові мутації можна отримати шляхом вбудовування плазміди, що містить, поруч із экзонными послідовностями модифицируемого гена і селектируемым маркерным геном, сильні транскрипционные і трансляційні стоп-сигналы. Причому у зруйнованому з допомогою инсерции экзоне транскрипція припиняється, у результаті утворюється укорочений білок, незахищений від дії клеточних протеаз.

Більше досконалої є розроблена недавно техника подвійний заміни гена. І тому використовують ЕСК, дефіцитні по ферменту HPRT — НМ1 (Melton, 1994). У першому етапі ген-мишень инактивируют шляхом заміни однієї з экзонов і що прилягають послідовностей на HPRT мини-ген. Причому у нокаутирующем векторі HPRT маркер фланкується ДНК последовательностями, гомологичными місцеві вставки в ДНК гена-мишені. У цей самий вектор включений і ген вірусної тимидинкиназы.

(Рис. 8.5). Після трансфекції відбираються клітини позитивні по.

HPRT й негативні по вірусної тимидин-киназе. Саме таких клітинах з високим рівнем ймовірності відбулася гомологичная рекомбінація заміняючи однієї з экзонов на инсертированний мини-ген HPRT. Факт такого вбудовування доводиться з допомогою ПЛР. На наступний етап инсертированный HPRT мини-ген заміняють на відсутній фрагмент гена-мишени, в доторый попередньо вносять цікаві для дослідника мутации. У цьому альтернативний вектор несе самі фланкирующие.

ДНК-последоваельности гена-мишени, що перший (нокаутирующий) вектор. Клітини HPRT мінус у цьому, 2- м етапі запросто нестимуть гомологичную рекомбінацію вмонтованийіншої конструкції мини-HPRT гена і альтернативного фрагмента вихідного гена. Факт такий рекомбінації контролюється з поміццю ПЛР. Отже, замість звичайного вимикання функції гена, яка досягається вже в 1-му етапі, дана технологія дозволяє вносити до структури гена дикого типу різні, заздалегідь сплановані зміни, зокрема і специфическиє мутації, аналогічні таким при спадкових хворобах в людини. Отже, даний підхід дає змогу здійснювати тонке генетичне моделювання і досліджувати особенности функції мутантного гена in vivo.

Для запровадження специфічних мутацій у визначені экзоны гена використовують, звані «hit & run «вектори (Hasty et al., 1991). Перспективним також представляється использование дріжджових YAC-векторов, несучих повнорозмірні кДНК-овые послідовності гена. Оскільки рівень гомологичной рекомбінації у дріжджів досить високий, на такі конструкції легко вводити специфічні мутації і далі івкористувати їх задля трансфекції ЕСК й отримання трансгенних тварин 4.

Відбір клонів ембріональних стовбурних клітин, у яких відбулася спрямована модифікація гена-мишени, в значительіншої ступеня, визначає успіх відновлення всього комплексу робіт зі створення модельної генетичної лінії. Проте, і подальші етапи програмних засобів, які включають отримання химерних трансгенних тварин, ідентифікацію зародкових трансмиттеров.

(химер, які продукують трансфецированные статеві клітини) і селекцію гетерозиготних, та був гомозиготных мутантнах особий, вимагають великий кваліфікації, праці та часу. Осложняющим обставиною і те, що химерні тварини нерідко мають знижену життєздатність і плодючість. І це то, можливо справедливе й щодо гетерозиготних мутантных особин. У гомозиготном стані инсертированные мутації можуть лише знижувати життєздатність і плодючість, а й мати летальним чи полулетальным ефектом вже у пренатальному періоді. У разі лінія підтримується через відбір і схрещування гетерозигот.

Попри величезні методичні труднощі й високу вартість, спрямоване отримання моделей спадкових болезней виправдовує витрачені зусилля. Мутантні тварини представляють унікальну можливість досліджувати патофизиологические процеси, що розвиваються в організмі внаслідок нарушений роботи певного гена, аналізувати вплив специфічних мутацій на фенотип, тестувати нові лекарственные препарати відчувати різні терапевтичні підходи. Велика також роль генетичних ліній з розробки методів генної терапії (див. Главу IX).

ГЛАВА IY.

ТИПИ І НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦІЙ. МЕТОДИ ДНКДИАГНОСТИКИ.

Розділ 4.1 Мутантні аллели, характеристика і типи мутаций.

Кожен генетичний локус характеризується відповідний рівень мінливості, тобто присутністю різних алелів чи варіантів послідовностей ДНК в різних индивидуумов.

Що стосується гену, аллели поділяються на дві групи — нормальні, чи аллели дикого типу, у яких функція гена не порушена, і мутантні, що призводять спричиняє порушення роботи гена. У найрізноманітніших популяціях й у будь-яких генів аллели дикого типу є переважати. Під мутацією розуміють усі зміни у послідовності ДНК, незалежно від своїх локалізації і сфери впливу на життєздатність особини. Отже, поняття мутації є широким проти поняттям мутантного аллеля. Доречно, проте, помітити, що у наукову літературу порівняно часто які в популяціях варианты послідовностей генів, не що призводять до помітним порушень функцій, зазвичай розглядаються як нейтральні мутації чи полиморфизмы, тоді як поняття «мутація «і «мутантный аллель «найчастіше вживаються як синонимы.

Як згадувалося раніше, різні зміни у нуклеотидіншої послідовності транскрибируемых областей ДНК можуть по-різному виявлятися в фенотипе. Частина не надає ніякого впливу структуру і функцію відповідного білка. Прикладом можуть бути заміни нуклеотидів, не приводящие для заміни амінокислот з вырожденности генетического коду. Мутантні аллели, своєю чергою, може бути підрозділені втричі класу: (1) мутації, які ведуть повної потіре функції (loss-of-function), (2) мутації, що супроводжуються кількісними змінами відповідних мРНК і первинних білкових продуктів і (3) доминантно-негативные мутації, зщо змінюють властивості білкових субодиниць в такий спосіб, що вони надають повреждающий ефект на життєздатність чи функционирование экспрессирующих типів клітин (gain-of-function мутації). Найбільшим ушкоджувальним дією мають мутации, що призводять або до утворення безглуздого білка, чибо до передчасному закінчення його синтезу, тобто делеции чи инсерции, не кратні трьом нуклеотидам і тому викликающие зрушення рамки зчитування, і навіть нонсенс мутації - заміни нуклеотидів, у яких утворюються терминирующие стоп-кодоны. Прояв таких мутацій залежить від своїх внутригенной локализации. Чим ближче до мутації до 5 «кінцю гена, тобто до началу транскрипції, тим коротше їх білкові продукти. Такі абортивні (truncated) білки нездатні до модифікаціям і швидко деградируют.

Фенотипическое прояв замін нуклеотидів в кодонах, так нназываемых миссенс мутацій, залежить від природи відповідних амінокислотних замін в білці і зажадав від функциональной значимості того домену, у якому це произошло.

Так, заміни амінокислот в активних центрах білків можуть сопровождаться повної втратою його функціональної активності, тоді як значно серйозніші порушення у других частинах білка справляють істотно меншого впливу на фенотип. Мутації з кінця экзонов і интронов (так называемые сплайсинговые мутації) часто порушують процессинг переклвичного РНК-транскрипта, у результаті відбувається або неправильне вирізання відповідної интронной області й трансляція безглуздого подовженого білка, не захищеного від протеолитического дії внутрішньоклітинних ферментів, чибо вирізання экзонов й освіту делетированного білка. У обох випадках сплайсинговые мутації, зазвичай, обуславливают важке перебіг хвороби. Порушення в регуляторних проластях генів супроводжуються кількісними змінами відповідного продукту і зачіпають структури та функциональной активності білка. Прояв таких мутацій определяется, зрештою, пороговою рівнем концентрації білка, у якому його функція ще залишається. Зазвичай, регуляторні мутації менш серйозні й володіють більш выраженным плейотропным (множественым) ефектом проти мутаціями структурних генов.

Щодо недавно виявлено новий колектив про динамічних мутацій, чи мутацій експансії, що з нестабільністю числа тринуклеотидных повторів в функционально значимих частинах генів. Багато тринуклеотидные повторы, локалізовані в транскрибируемых чи регуляторних проластях генів, характеризуються високий рівень популяційної мінливості, у якого немає фенотипических порушень (Willems, 1994). Хвороба розвивається буде лише тоді, коли кількість повторів у тих сайтах перевершує опреділений критичний рівень. Успадкування таких мутацій, зазвичай, відрізняється від класичного Менделевского типа. Їх характерні: різна пенетрантность разом із неповним домінуванням; геномный імпринтинг (відмінності феєнотипических проявів залежно від цього, отримана мутація від чи то з батька) і феноменом антиципації - нарастание тяжкості прояви захворювання на наступних поколениях (Willems, 1994).

Класичним прикладом мутацій експансії є синдром ламкою Х-хромосомы (FraXA), обумовлений присутністю видовжених CCG повторів в розмірі 5 «-нетранслируемой регуляторної області FMR1-гена (Xq27.3). Аналогічні нестабільні повтори виявлено ще трьох ламких сайтах, причому дві з них.

(FraXE і FraXF) розташовані на півметровій дуже незначному відстані дистальнее FraXA. В усіх життєвих чотирьох випадках CCG-повторы локализованы поблизу CpG острівців, у своїй збільшити кількість копій триплетов вище певного порогового рівня сопровождается гиперметилированием всієї регуляторної GC-богатой області, через що і відбувається різке зниження доходів і повне вимикання транскрипционной активності - мутації на кшталт «втрати функції «(loss-of-functions). Отже, область CCG-повторов у тих локусах так можна трактувати, як своєрідний cis-действующий елемент транскрипції (Willems,.

1994, Mandel, 1994).

Інший тип динамічних мутацій описаний для шести разособистих важких аутосомно-доминантных нейродегенеративних розладів (див. Главу X). Всім цих захворювань обнаружено присутність видовжених CAG-повторов у відкритій рамці зчитування (ORF). Ці повтори транслюються в довгі полиглютаминовые треки, може бути локалізовані в.

ДНКщо пов’язують доменах відповідних білкових продуктов.

Через війну білкові молекули набувають нових властивостей, порушують нормальні метаболічні зв’язку. Отже, нестабільні CAG-повторы так можна трактувати, як gain-of-function — мутації. Інтенсивно обговорюється також можливістю участі амплификации CAG-повторов у формуванні схильності до таких частим розладам центральної нервової системи, як шизофренія і маніакально-депресивний психоз. Прикладом третьої групи хвороб експансії служить миотоническая дистрофія. У цьому захворюванні величезні CTG.

(чи CAG) повтори локалізовано в 3 «-нетранслируемой області гена. Вони також розглядаються, як чинники, порушують нуклеосомную організацію гена і які його транскрипцию.

Докладніше хвороби експансії розглянуті в Главі X.

Розділ 4.2. Генетична гетерогенність спадкових заболеваний.

Однією з важливих узагальнюючих підсумків молекулярно-генетических досліджень моногенных хвороб стало доказательство їхній генетичній гетерогенності. Остання то, можливо викликана різними причинами. Насамперед, виявилося, що хоча б біохімічний ефект (фенотип) то, можливо обумовлений мутаціями у різних генах. З іншого боку, мутации однієї й тієї ж гена, як встановлено, можуть спричинить зовсім різних клінічним проявам. Наприклад, мутации гена адренорецептора, сцепленого з Х-хромосомой, може бути причиною нейродегенеративного захворювання — болезни.

Кеннеді, якщо вони захоплюють область тринуклеотидных повторів (Глава X), й те водночас спричинить синдрому тестикулярной фемінізації, тобто порушень статевої дифференцировки, якщо вони зачіпають інші послідовності цього ж гена. Крайнім вираженням такий гетерогенності може служити приклад із геном рецептора тирозинкиназыRET, різні мутації його можуть спричинить 4-му цілком різних спадковим синдромам, таких як сімейна медуллярная карцинома щитовидної залози, хвороба Гиршпрунга, множественная ендокринна неоплазия тип 2А (МЭН-2А) і тип 2B (МЭН-2B).

(Hayningen, 1994). Такі фенотипічні розмаїття проявищ мутацій однієї й тієї ж гена дістали назву авлельных серій. Термін використовується вже близько 20 років на описи груп товарів із кількох моногенных спадкових заболеваний, клінічні прояви яких дозволяють предполагатку їх зв’язку з різними генами, тоді як біохімічні і/або генетичні дослідження доводять їх аллельную природу, тобто у основі їхніх патогенезу лежать різні мутації однієї й тієї ж гена.

Нині відоме понад 100 таких болезней.

(Romeo, McKusick, 1994). До кожного захворювання з такої серії аллелизм мутацій вже доведено на молекулярному уровне.

Причини подібного фенотипического розмаїття можуть бути різними: (1) локалізація мутантних алелів в функциональале різних доменах білка; (2) принципово різний механізм дії мутацій (loss-of-function, gain-of-function); (3) присутність у тому самому гені модифицирующего мутантного аллеля чи поліморфізму і (4) вплив генетичного оточення на прояв мутантного аллеля, тобто його взаємодію Космосу з певними аллелями гена-модификатора і навіть несколькими такими генами. Поглиблений молекулярно-генетичний аналіз практично кожного спадкового захворювання указывает з його значну генетичну гетерогенність, пов’язанийную з різними мутаціями гена. Деякі приклади аллельных серій та генетичної гетерогенності захворювань розглядатимуться докладніше в Главі X.

Розділ 4.3 Номенклатура мутаций.

Для практичних цілей головним чином, для читання наукової літератури, важливо знати, як записуються мутации.

Донедавна єдиної номенклатури записи мутацій немає. У 1992 р. двома американськими вченими Артуром.

Боде і Лап-Чи Тсуи було запропоновано універсальна стандартна система для позначення різних мутацій (Beudet, Lap-Сhee.

Tsui, 1993). Її розраховано як у запис амінокислотних замін в білках, і на нуклеотидные заміни і перестановки в.

ДНК. У першому випадку, кожної амінокислоті відповідає однобуквенный символ (Табл.4.1), зліва записується нормальний варіант амінокислоти, справа — мутантний, а розташований у центрі номер відповідає місцю заміни в ланцюжку первинного продукту трансляції. Наприклад, запис D44G означає заміну аспарагина на гліцин 44-го становищі полипептидной ланцюга, а.

A655E — аланина на глутамин в пложении 655 білкового продукта. Так записуються різні варіанти амінокислотних замін при миссенс мутаціях. Буквою Х позначається місце зупинки синтезу полипептидной ланцюга при нонсенс мутаціях. Например,.

Q39X означає заміну глицина на стоп сигнал в 39-му кодоне, а.

W1282X — триптофан-триплета на стоп-кодон вагітною 1282.

Отсутвие одній або кількох амінокислот позначають значком.

^-дельта. Так, найчастіша мутація, яка веде до муковисцидозу-^F508 — означає відсутність фенілаланіну в 508 становищі трансмембранного регуляторного білка муковисцидоза. Полиморфизмы, пов’язані з рівноцінною по функціональної значимості заміною амінокислот, записують через черточку.

Наприклад, M/V470 — метіонін чи валин вагітною 470.

Таблиця 4.1. Символи аминокмслот.

————————————T————————-T———————.

¦ Амінокислоти 1¦ 0 Трилітерний 1¦ 0 Однобуквенный 1¦

¦ 1¦ 0 символ 1¦ 0 символ 1 ¦

+———————————-+————————-+———————+.

¦ Аланин 1¦ 0 Ala 1¦ 0 A 1 ¦

¦ Аргінін 1¦ 0 Arg 1¦ 0 R 1 ¦

¦ Аспарагин 1¦ 0 Asn 1¦ 0 N 1 ¦

¦ Аспарагінова кислота 1¦ 0 Asp 1¦ 0 D 1 ¦

¦ Asn і/або Asp 1¦ 0 Asx 1¦ 0 B 1 ¦

¦ Цистеин 1¦ 0 Cys 1¦ 0 З 1 ¦

¦ Глутамин 1¦ 0 Gln 1¦ 0 Q 1 ¦

¦ Глутаминовая кислота 1¦ 0 Glu 1¦ 0 E 1 ¦

¦ Gln і/або Glu 1¦ 0 Glx 1¦ 0 Z 1 ¦

¦ Гліцин 1¦ 0 Gly 1¦ 0 G 1 ¦

¦ Гистидин 1¦ 0 His 1¦ 0 H 1 ¦

¦ Изолейцин 1¦ 0 Ile 1¦ 0 I 1 ¦

¦ Лейцин 1¦ 0 Leu 1¦ 0 L 1 ¦

¦ Лізин 1¦ 0 Lys 1¦ 0 K 1 ¦

¦ Метіонін 1¦ 0 Met 1¦ 0 M 1 ¦

¦ Фенилаланин 1¦ 0 Phe 1¦ 0 F 1 ¦

¦ Пролин 1¦ 0 Pro 1¦ 0 P 1 ¦

¦ Серин 1¦ 0 Ser 1¦ 0 P. S 1 ¦

¦ Треонин 1¦ 0 Thr 1¦ 0 T 1 ¦

¦ Триптофан 1¦ 0 Trp 1¦ 0 W 1 ¦

¦ Тирозин 1¦ 0 Tyr 1¦ 0 Y 1 ¦

¦ Валин 1¦ 0 Val 1¦ 0 V 1 ¦

L———————————-+————————-+———————;

Принципова схема запису і нумерації нуклеотидів приведено на Рис. 4.1. Відлік нуклеотидів в молекулі ДНК начинается з першого смислового кодона, отже нуклеотид під номером +1 відповідає першому нуклеотиду в молекулі кДНК.

Угору за течією (чи справа-наліво від 3 «до 5 «-кінцю) від першого кодона нуклеотиди записують зі знаком «- «, вниз за течією (від 5 «до 3 ») — зі знаком «+ ». Багатьом генів відсутність точних даних про стан ініціюючого сайту та наявність кількох місць ініціації транскрипції істотно ускладнюють нумерацію нуклеотидів. Нуклеотиди экзонов обознасподіваються заголовними літерами, интронов — прописными.

У Табл.4.2. дано приклади позначення різних мутацій з допомогою як амінокислотною, і нуклеотидної нумерации. Нуклеотидная система записи дуже багато важить для позначення делеций, инсерций, сплайсинговых мутацій і полиморфизмов, які пов’язані з замінами амінокислот чи происходящими в нетранслируемых частинах гена. Що стосується делеции чи инсерции однієї чи двох нуклеотидів наводиться їх літерне позначення. Наприклад, 441delA, 485insTA. При делеции чи инсерции трьох і більше нуклеотидів зазначається лише їх кількість. Так, 852del22 означає делецию 22 нуклеотидів, начиная з 852-го нуклеотида, а 3320ins7 позначає вставку 7 пар підстав після нуклеотида 3320. Що стосується великих вставок чи делеций їх розміри указыаются в килобазах, например

2115ins13kb, чи позначаються відповідні инсертированные/ делетированные структурні елементи геному. Так,.

2115insAlu означає инсерцию Alu-повтора після нуклеотида.

2115. При позначення сплайсинговых мутацій записують номер крайнього нуклеотида у найближчому до мутації экзоне, число нуклеотидов (зі знаком «+ «у разі 3 «кінця экзона і з знаком.

" - «у разі 5 «кінця) і характеру нуклеотидної замены.

(Рис. 4.1, Таб.4.2). Наприклад, 711+5G-T позначає заміну G на Т в 5-му підставі интрона, наступного за экзоном, заканчивающимся 711 нуклеотидом.

Розділ 4.4. Ідентифікація структурних мутацій, ізоляція мутантных ДНК.

Ідентифікація мутантних алелів, тобто виявлення порушень в первинної нуклеотидної послідовності ДНК, є прямим методом молекулярної діагностики спадкових захворювань. Великі перебудови — делеции, дуплікації, інверсії, транслокации — розміром як 1 Мb, які заторкують цілі гени і навіть кілька генів, може бути виявлено на цитологічних препаратах з использованиїм техніки високого дозволу хромосомного аналізу (аналіз дифференциально забарвлених прометафазных хромосом). Ще більшая що дозволяє здатність (до 50 кb) можна досягти під час роботи на спеціальним способом приготовлених (розтягнутых) интерфазных хромосомах з техніки гибридизации in situ (FISH — Глава II).

Мутації, які змінюють довжину рестрикционных фрагментів, можуть бути встановлені шляхом блот-гибридизации рестрицированной геномної ДНК з відповідними ДНК-зондами на стадіях генітического аналізу, попередніх молекулярному клонування гена. До таких мутацій ставляться досить протяженные, але з идентифицируемые цитогенетически, внутригенные делеции, инсерции і дуплікації, і навіть точкові мутації, локалізовані в сайтах рестрикції. Неодмінним умовою реализации методу блот-гибридизации на допомогу пошуку подібних мутаций служить наявність ДНК-зонда, що є або частиною гена, або тісно зчепленої з цим геном клонированной.

ДНК-последовательностью. Під час пошуку таких мутацій геномную.

ДНК від здорового донора і хворого обробляють часто щепящими рестриктазами, піддають электрофорезу, блот-гибридизации з міченим ДНК-зондом по стандартною схемою (Глава I) та друзі проводять з порівняльного аналізу розташування бэндов на зарадиоавтографе. Особливо інформативними зазвичай є рестриктазы Msp1 і Taq1, які дізнаються сайти CGGG і TGGA, соответственно. Наявність СpG послідовностей ці сайти особливо рясно піддаються спонтанного мутированию.

(см. раздел 4.5). Наявність протяжних делеций, або точкових мутацій в сайтах рестрикції призводить до змін розмірів рестрикционных фрагментів. Цілеспрямований пошук інших точечных мутацій (не які зачіпають сайти рестрикції) і небольших структурних аномалій можлива лише для клонованих генів з відомою нуклеотидної послідовністю значеннєвих ділянок ДНК. Методи ідентифікації подібних мутацій основаны, переважно, на використанні полімеразної ланцюгову реакцію у її різних модифікаціях (см. Главу I, і навіть розділи 4.5 і 4.6).

Для аналізу мутантних алелів, передусім, необхідно мати ізольовані послідовності мутантного гена, доторые можна отримати або шляхом клонування чи амплификации мутантной кДНК, або з допомогою специфічної амплификации окремих экзонов, їх частин 17-ї та регуляторних областей гена з допомогою як матриці геномної ДНК пациентов (Рис. 4.2). У першому випадку відбирають клоновані к-ДНК-последовательности мутантного гена, проводячи скринінг кДНК-овых бібліотек, сконструйованих зі специфічних тканій чи культур клітин хворого. Причому у ролі зондів використовують кДНК-овые послідовності нормального гена.

Іншим джерелом які кодують послідовностей мутантного гена може бути мРНК, ізольована з экспрессирующих тканин чи клітин хворого. Мутантную кДНК отримують шляхом специфічної амплификации перекрывающихся послідовникностей які кодують областей гена, використовуючи як матрицы тотальну кДНК, отриману при зворотної транскрипції злированной мРНК. Перевагою цього підходу є те, що праймери для амплификации обирають з экзонных областей, нуклеотидные послідовності яких, зазвичай, становятся відомі невдовзі після ідентифікації і клонування гена. Нерідко ізоляція мутантной мРНК утруднена в связи з недоступністю зразків тканин чи, у яких відбувається експресія потрібного гена (мозок, печінка та ін.). Однако, виявлення слідових кількостей, так званої, незакінної чи эктопической мРНК у багатьох клітках і тканинах, зокрема у клітинах крові, дозволяє преодалевать й інші труднощі (Kaplan et al., 1992). Успіх як і процедури отримання мутантной кДНК пов’язаний, насамперед, з разработкой ефективних методів виділення, тож зворотної транскрипції мРНК зі збереженням усіх типів кДНК, включаючи й ті, котрим відповідні мРНК є у незначних концентрациях.

(наприклад, мРНК дистрофіну при м’язової дистрофії Дюшенна.

(см. Главу X). Єдиним принциповим обмеженням методов детекции мутацій в кДНК-овых послідовностях являются неможливість виявлення мутацій в регуляторних і інтронных частинах гена. Такі мутації можуть бути встановлені лише за аналізі геномної ДНК пациента.

Одержання геномної мутантной ДНК звичайно представляє складнощів, оскільки він то, можливо ізольована з будь-яких клеструм чи тканин хворого незалежно від характеру експресії досліджуваного гена. Проте, ампліфікація цілих экзонов візможна лише за знанні нуклеотидних послідовностей що фланкують интронных областей, серед яких і виробляють добір специфічних олигопраймеров. Секвенування интронов є досить трудомістку завдання, решенную далеко ще не всім клонованих генів. Отже, до ограничениям цього підходу слід віднести необхідність повної інформації про структуру гена й про його переклвичной нуклеотидної послідовності. З іншого боку, об'єктом тестування можуть лише порівняно невеликі області гена, звідси щоб одержати повнішої інформації необходимало ампліфікація багатьох экзонов.

Стратегія ідентифікації мутацій може бути різною й у кінцевому підсумку, залежить від того, чи маємо ми працювати з раніше невідомими мутаціями, або метою аналізу є скринирование вже мутацій. У першому випадку обектом дослідження найчастіше служать клоновані чи амплифицированные кДНК-овые послідовності, тоді як із молекулярной діагностиці відомих мутацій, зазвичай, анализируют амплифицированные фрагменти геномної ДНК.

Розділ 4.5. Первинна ідентифікація точкових мутаций.

Будь-які типи мутацій може бути виявлено шляхом прямого секвенування мутантной кДНК чи окремих экзонов і найчастіше первинний пошук порушень в які кодують областях гена осуществляют саме так. Сам метод секвенування вже було рассматрен раніше (см. Главу I, раздел 1.6). Для деяких генів, мають невеликі розміри, метод прямого секвенирования успішно застосовується як основний метод сканування мутацій. Так було в частковості, особливо зручним виявилося його застосування детекции мутацій в порівняно невеликих за величиною генах, таких, наприклад, як ген чинника IX свертывания крові (гемофілія У). Використання эктопической мРНК щоб одержати амплифицированных кДНК-овых фрагментів відкриває особливо широкі змогу застосування методу прямого секвенирования.

Разработаные останніми роками модифікації методів ПЛР значно полегшили секвенування амплифицированных фрагментів і підвищили ефективність. Так було в частковості, передхибна варіант асиметричною ПЛР, коли за амплификации кінцентрация однієї з олигопраймеров кілька десятків разів перевищує концентрацію іншого праймера, у результаті синтезується переважно лише одне, потрібна для секвенирования ланцюжок ДНК. З цією самі цілі (отримання одноцепочечной ДНК) запропоновано використання магнітних часток отримують за фіксованим з їхньої поверхні стрептавидином. У цьому одне із праймеров щодо ПЛР метится биотином. Відтак до продуктам амплификации додають магнітні частки з пришитим стрептавидином. Завдяки міцному зв’язування біотин — стрептовидин, мічена биотином послідовність ДНК фиксируется на магнітних частинках. З допомогою лужного лізису з частинок видаляють другу немеченую комплементарную последовательность ДНК, якою і використовують із секвенування. Ще одному варіанті амплификацию проводять у присутності праймірів, несучих сайт впізнавання для ферменту Т7 — РНК полімерузы. Після амплификации у системі in vitro проводять транскрипцію амплификата з допомогою Т7-РНК полимеразы і образовавшуюся одноцепочечную РНК використовують із секвенирования.

— метод GAWTS (genome amplification with transcript sequences).

Проте, у випадку секвенування полноразмерной кДНК чи всіх экзонов для генотипирования мутацій у отдельных пацієнтів досить занадто багато роботи, дорого і потребує багато часу. Тому на згадуваній практиці частіше проводять попередній відбір простішими методами амплифицированных, інколи ж клонованих фрагментів ДНК, може бути містять мутації, та був секвенируют лише ділянки ДНК. Методи пошуку фрагментів ДНК, може бути містять мутації, засновані на порівняльного аналізу мутантних і нормальних послідовностей за цілою низкою фізичних і хімічних характеристик, які у значною мірою варіюють залежно від типу мутаційного ушкодження. Слід підчеркнути, що незалежно від методу детекции мутації і практически незалежно від її природи (заміни нуклеотидів, справіции, дуплікації тощо.) точні молекулярні характеристики кожної мутації можна отримати лише шляхом прямого секвенирования. За наявності амплифицированном фрагменті звестных сайтів рестрикції становище мутації то, можливо передварительно уточнено. І тому продукти амплификации разрезают відповідної эндонуклеазой і досліджують більш короткиє фрагменты.

Найпростіше виявляються мутації, які змінюють длину амплифицированных фрагментів, бо такі порушення легко виявляються при электрофоретическом аналізі. Так, протяженные делеции, захоплюючі цілі экзоны, може бути вивиявлені зі зміни довжини рестрикционных фрагментів, гибридизующихся зі специфічними ДНК-зондами. Простіша і ефективна методика виявлення таких мутацій в генах, сцепленних із соціальною статтю, полягає в одночасної амплификации разособистих экзонов, найчастіше тих, хто у такі перестройки, так званий мультиплексный варіант ПЛР. Разница у розмірах та числі амплифицированных фрагментів дозволяє легко ідентифікувати такі мутації на электрофорезе.

(Рис. 4.2). Особливо широко його використовується для ідентификации делеций в гені дистрофіну, долю яких приходится близько 60% всіх мутацій, що призводять до міодистрофії Дюшенна (см. Главу X). За відсутності делеций все амплифицированні фрагменти після электрофоретического поділу праці й приблрашивания можна поспостерігати на вигляді окремих смуг. Якщо досліджуваної ДНК із экзонов делетированы, не буде відповідні їм смуги на электрофореграмме (Рис. 4. 2). Обираючи специфічні ділянки гена для гамплификации, можна оцінити розмір делеции з точністю до відділових экзонов, і навіть визначити її внутригенную локализацию.

Метод цей, проте, не виявляє подібні делеции, перебувають у гетерозиготному змозі або локалізовані в аутосомных генах, оскільки нормальна гомологичная последовательность геномної ДНК може бути матрицею для амплификации будь-яких фрагментів. Цей підхід вживають щодо аналізу справіций в аутосомных генах лише у випадках, коли можливий доповнити ПЛР кількісної оцінкою результатів амплификации — так звана кількісна ПЛР. Оригінальний метод ідентифікації подібних делеций у гетерозигот грунтується на використанні як матричної ДНК для ПЛР кДНК, підлозіченной шляхом зворотної транскрипції з эктопической мРНК або з мРНК, ізольованій з экспрессирующих даний ген тканин чи культур клітин пацієнта. На відміну від нормального гомолода, в мутантной молекулі кДНК які межують з делецией экзоны зближені. Якщо ролі олигопраймеров для ПЛР будуть выбрани послідовності з цих галузей гена, лише мутантная кДНК служитиме матрицею для амплификации небольшого ділянки між праймерами з що фланкують делецию экзоновий. У нормальної послідовності кДНК цю ділянку може бути великий, щоб пройшла амплификация.

Практично, щоб виявити гетерозигот по протяжним внутригенным делециям проводять мультиплексную ПЛР з использованием системи олигопраймеров, які забезпечують амплификацию фрагментів, повністю перекрывающих всю молекулу кДНК. Наличие делеции реєструють по появі продуктів амплификации незвичного размера.

Невеликі делеции і вставки нуклеотидів не призводять до відсутності амплифицированных фрагментів ДНК, але змінюють їх розміри. Ці зміни може бути зареєстровані при электрофорезе продуктів амплификации в полиакриламидном чи агарозном гелях (Рис. 4.3). Саме це метод використовується для детекции найчастіше трапляється мутації в гені муковисцидоза — делеции трьох нуклеотидів^F508. Після выявления різниці між нормальною і мутантной ДНК за довжиною рестрикционных чи амплифицированых фрагментів гена необхідно провести секвенування незвичного фрагмента, із єдиною метою опрерозподілу змін — у первинної структурі мутантной ДНК післядовательности проти нормальной.

При мутаціях гена, що становлять заміну однієї чи кількох нуклеотидів, довжини амплифицированных фрагментов залишаються постійними, проте, деякі физико-химические властивості мутантних молекул ДНК змінюються. Так, напризаходів, при гібридизації однонитевых ДНК, комплементарных нірмальной і мутантной ниткам ДНК, виникають структурні нарушения на місці негомологичного спарювання. З урахуванням цих особенностей розроблено різні варіанти пошуку мутантних фрагментів ДНК та ідентифікації у яких точкових мутацій. Ведущими з цих методів є: метод аналізу конформационного поліморфізму однонитевой ДНК — SSCP, денатурирующий градиентный гель-электрофорез — DGGE, метод хімічного розщепівления некомплементарных сайтів (CMC), метод гетеродуплексного аналізу (HA) і, нарешті, власне метод секвенирования.

До основних рис цих методів наведені у Табл.4.3.

Таблиця 4.3. Переваги й недоліки основних методів переклвичной ідентифікації мутаций.

———-T————-T————T——————T————————.

¦метод ¦ розмір ¦ %% ¦ точність ¦ сканування ¦

¦ ¦фрагмента¦детекции¦картирования+————-T———+.

¦ ¦ (п.о.) ¦мутацій ¦ мутації ¦ экзонов ¦ кДНК ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

+———+————-+————+——————+————-+———+.

¦SSCP ¦ 250 ¦ 80% ¦ немає ¦ +++ ¦ + ¦

¦DGGE ¦ 600 ¦ 95% ¦ немає ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦СМЗ ¦ 1700 ¦>95% ¦ так ¦ + ¦ +++ ¦

¦PCR DS¦ 500 ¦>99% ¦ так ¦ ++ ¦ ++ ¦

¦НА ¦ 300 ¦ 80% ¦ немає ¦ ++ ¦ + ¦

L———+————-+————+——————+————-+———;

" + «- придатність методу на сканування геномної ДНК і кДНК.

SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) — метод аналізу конформационного поліморфізму однонитевой ДНК, передложенный (Оrita et al.1989, Сlavac, Dean, 1993) грунтується на реєстрації відмінностей у электрофоретической рухливості одненитевых ДНК, однакових за величиною, але різняться внаслідок нуклеотидних замін по просторової организации молекул (Рис 4.4). Скручування чи конформація невеликих однонитевых ДНК істотно залежить від своїх нуклеотидної послідовності, отже заміна жодного підстави у молекулах однакового розміру призводить до зміни їх простийранственной структури. Метод включає амплификацию специфических сегментів ДНК розміром від 50 до 300 пар підстав, зазвичай, у присутності мічених трифосфатов, денатурацію образовавшихся продуктів ПЛР і нативний высокоразрешающий элекрофорез в полиакриламидном гелі. Іноді амплификацию с. проводят без використання мітки, але давайте тоді для кращого разделения.

ДНК та забезпечення однозначного ідентифікації бэндов на электрофореграмме використовують спеціальні гелі - Hydrolink або MDE (AT.

Biochem, USA), і навіть чутливіші проти этидиумом бромидом методи фарбування, такі як забарвлення серуба. На процес конформації впливають різні зовнішні чинники — температура, концентрація акриламида і гліцерину в гелі, іонна сила буферних растворов.

(Сlavac, Dean, 1993). Оптимальний добір цих параметрів позволяет ефективно розділяти амплифицированные фрагменти ДНК, різняться навіть всього однією нуклеотид. Конформационный метод виявлення точкових мутацій швидко набув широкого поширення завдяки їхній простоті й можливості обготівковувруживать будь-які типи замін. Ефективність детекции мутацій при розмірах амплифицируемого фрагмента менш 200 п.о. становить 70−95%, але за довжині фрагмента, перевищує 400 п.о., можливість виявлення мутацій зменшується до 50%.

DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis) — метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза, грунтується на залежності властивостей плавлення (чи денатурації) невеликих двухнитевых молекул ДНК від своїх нуклеотидної послідовникности, а від співвідношення A-T і G-C пар в досліджуваних фрагментах (Маєрс і др., 1990; Fodde, Losekoot, 1994). Объясняется це тим, що G-C зв’язок більш міцна порівняно з зв’язком між нуклеотидами A і T. Такі розбіжності у дінамике плавлення можуть бути встановлені шляхом порівняння подвижности нормальних і мутантних двухнитевых фрагментів ДНК за її электрофорезе в денатурирующих умовах (Рис. 4.5). Градиент денатурації досягається різницею температур, різної концентрації сечовини чи формальдегіду в гелях. За цих умов однакові за величиною двухнитевые молекули ДНК, відмінні по нуклеотидної послідовності, денатурируют порізного. Розроблено комп’ютерний алгоритм, дозволяющий пророкувати характер плавлення залежно від нуклеотидной послідовності (Lerman, Silverstein, 1987). При электрофорезе амплифицированных двухнитевых фрагментів ДНК в гелі з лінійно зростаючим градієнтом концентрацій денатурирующих агентів плавлення ниток ДНК відбувається у суворо специфічною для даної послідовності області, эквивалентной температурі плавлення — tm, тобто такою температуре, коли він кожне подружжя підстав з 50%-ой ймовірністю може з'єднатися чи розійтися. З початком плавлення просування двухнитевого фрагмента ДНК в гелі різко замедляется внаслідок складної просторової конфігурації молікул, причому ця затримка триватиме до того часу, доки настане повна денатурація ДНК. У результаті відбувається поділ фрагментів ДНК, різняться по нуклеотидному складу. У такий спосіб вдається ідентифікувати лише около.

50% однонуклеотидных замін в фрагментах ДНК довжиною від 50 за кілька сотень нуклеотидів. Пов’язано це про те, що з проходженні ДНК через гель може початися вже часткова денатурація кінців молекул ще до його досягнення оптимальної області плавлення. Тому мутації, локалізовані поблизу кінців гамплифицированных ділянок ДНК, надають меншого впливу на процес плавлення і тому можуть виявлятися. Эффективность виявлення мутацій з допомогою градиентного денатурирующего електрофорезу може істотно підвищена з допомогою приєднання до кінців амплифицированной геномної ДНК синтетических фрагментів GC-нуклеотидов, завдовжки кілька десятків пар підстав. Такі монотонні тугоплавкі кінці виконують роль своєрідних затискачів і різко збільшують шанси виявлення всім точкових мутацій, незалежно від своїх локалізації всередині досліджуваного фрагмента ДНК. Ця модификация робить метод дуже чутливим (см. Таб.4.2). На відміну від SSCP придатний ще великих амплифицированних фрагментів ДНК. При дослідженні фрагментів до 600 п.о. ефективність виявлення мутацій цим методом достигает.

95%. Найчастіше DGGEметод застосовується для скринінгу мутаций в амплифицированных экзонах, причому у ролі матриці використовують геномную ДНК. Цей метод може бути з успіхом застосований також і аналізу индуцированных мутацій, оскільки дозволяє вловлювати точкові мутації, виниклі навіть у одіншої зі ста опрацьованих мутагеном клітин. До вад метода слід віднести технічну складність отримання одномірного градієнта денатурирующего агента в полиакриламидном гелі, і навіть високу вартість штучно синтезированных.

GC-концов.

HA (Неteroduplex analysis) — гетеродуплексный аналіз позволяет ідентифікувати мутації, перебувають у компаунде чи гетерозиготному стані. Слід зазначити, що з подавляющего більшості пацієнтів із генними хворобами, наследуемыми по аутосомно-рецессивному типу, мутації в гомологичных хромосомах перебувають у компаунде, тобто у кожному з гомологічних генів є функціонально значимі порушення, та їх молекулярна Природа і внутригенная локалізація различны.

Виняток припадає лише мажорні мутації, частота що у популяції сягає десятків відсотків. Прикладами таких мутацій є^F508 в гені муковісцидозу чи R408W мутация в гені фенілкетонурії. Принцип HA-метода у тому, що з амплификации відносно невеликих фрагментів генів гетерозигот чи гомозиготных компаундов мутація то, можливо локалізована лише одній з гомологичных ниток матричіншої ДНК. Тож у амплификационной суміші поруч із двома типами гомодуплексов утворюються гетеродуплексы між нормальіншої і мутантной ланцюжками ДНК. Такі гетеродуплексные молікулы ДНК мають іншу электрофоретичеcкую рухливість по сравнению з гомодуплексами (не несхожими між собою по підвижности) з допомогою конформационных особливостей у місцях розбіжності нуклеотидів (mismatch) (Рис. 4.6). Ці розбіжності може бути виявлено при электрофорезе у звичайному полиакриламидном гелі. Значно ефективніше поділ гомоі гетеродуплексов можна досягнути під час використання нових варіантів гелів — Hydrolink або MDE. Можливість ідентифікації точкових мутацій у такий спосіб на фрагментах.

ДНК менш 300 п.о. сягає 80−90%. Детекция мутацій осуществляется як изотопным, і неизотопными методами.

(Grompe, 1993).

CMC (Chemical Mismatch Cleavage) — метод хімічного розщеплення некомплементарных сайтів, грунтується на здібності деяких хімічних агентів специфічно розривати нитку ДНК на місці локалізації неспаренного підстави (Рис. 4.7). Так, цитозин чутливий до дії гидроксиламина, а тимин — до дії тетроксида осмію. Деякі модифікації методу використовують чутливість тиміну і гуанина до карбодиимиду.

Наступна обробка пиперидином призводить до повного розриву молекули ДНК в модифікованому сайті. Виявлення мутацій здійснюють з допомогою мічених ДНК-зондов, відповідних, зазвичай, нормальним варіантів послідовності ДНК.

Такими зондами може бути синтезовані олігонуклеотиди, клоновані послідовності ДНК чи амплифицированные фрагменти (Cotton, 1990; Cotton, Malcolm, 1991).

Під час проведення дослідження еталонну мічену ДНК смешивают з головою тестируемой ДНК (чи РНК). Тестованими зразками ДНК можуть бути клоновані ДНК, оброблені відповідними эндонуклеазами, або амплифицированные фрагменти. Суміш нагрівають до денатурації двухнитевых молекул і далі охолоджують, аби створити умови для образования дуплексов. За наявності мутацій в тестируемых образцах.

ДНК в гетеродуплексах, які з’явились у результаті гібридизації між однонитевыми молекулами еталонною і тестируемой ДНК, утворюються місця негомологичного спарювання. Після опрацювання відповідними хімічними агентами ідентифікація і локализация мутантних сайтів в досліджуваних ділянках ДНК с. проводится шляхом електрофорезу і авторадиографии. Поява укороченных фрагментів ДНК на электрофореграмме (а точніше непробычных бэндов у нижній частині гелю) свідчить про наявність мутантного сайту, а визначення величини укорочених фрагментов однозначно визначає локалізацію цього сайту в вихідної тестируемой молекулі ДНК. Сучасні модифікації метода.

CMC дозволяють ідентифікувати до 95−100% мутаций.

(Grompe, 1993). Великими перевагами цього являются:

(1) можливість досліджувати довгі ділянки ДНК — до 2 кб, (2) здатність одночасно виявити і локалізувати кілька мутацій щодо одного фрагменті ДНК і (3) можливість одночасно використовувати кілька ДНК-зондов на допомогу пошуку мутацій — мультиплексный варіант методики. До недостатков можна віднести високу токсичність використовуваних хіміческих реактивів. Остання то, можливо частково ослаблена використанням карбодиимида для ідентифікації GT гетеродуплексов.

Дуже близьким за принципом до CMCметоду є метод розщеплення гетеродуплексов РНКазой А. Для цього він создаются умови для освіти гетеродуплексов між тестируемій ДНК і комплементарної їй радіоактивно міченої РНК пробій. Після обробітку РНКазой, А відбувається розрізування молекул.

РНК у місцях порушення спарювання підстав. Місця точкових мутацій визначаються як у разі СМЗ, за величиною образовавшихся фрагментів після електрофорезу і авторадиграфии.

Необхідність використання радіоактивно міченої РНКпроби і можливість детекции лише 50% точкових мутацій чимитируют широке застосування методу (Grompe, 1993).

Первинна ідентифікація мутацій можна здійснити шляхом аналізу порушень над нуклеотидної послідовності гена, а амінокислотною послідовності відповідного полипептидного продукту. І тому виділяють тотальну мРНК з лейкоцитів крові, проводять зворотний транскрипцію, амплифицировуют специфічні экзоны кДНК (метод RT-PCR), встраивают амплифицированную область ДНК в экспрессионную систему і аналізують зчинений продукт. Цей метод ефективний в детекции мутацій в протяжних генах, содержащих велика кількість экзонов, як-от ген міопатії Дюшенна чи ген нейрофиброматоза 1.

Розділ 4.6. Молекулярне сканування відомих мутаций.

Розглянуті вище методи виявлення мутацій предполагают обов’язкове секвенування містять їх сегментів ДНК із єдиною метою точної ідентифікації нуклеотидних порушень, оцінки їхньої фенотипического прояви й визначення причетності до хворобі розвиватися. Тому рідко використовують у практической діагностики та при популяційному скринінгу гетерозигот. Після описи мутації з’являється можливість анализа простішими способами, які потребують секвенирования.

Як згадувалося, мутації, які змінюють довжину амплифицированних фрагментів, можуть бути встановлені з допомогою нативного електрофорезу в полиакриламидном чи агарозном гелях.

З миссенс мутацій найбільш просто діагностуються ті заміни нуклеотидів, що призводять до зникнення чи проразованию сайту впізнавання для котрійсь із рестриктаз.

Вони виявляються зі зміни довжини амплифицированного фрагмента ДНК саме його обробки відповідної эндонуклеазой.

Тому відразу після ідентифікації мутації проводиться компьютерный пошук можливих сайтів рестрикції на місці локализации заміни підстави. Можливість такого події досить велика, оскільки кожної з кілька сотень відомих у час рестрикционных эндонуклеаз сайтом впізнавання служить своя специфічна послідовність ДНК, середні розміри якої складають 5 — 6 нуклеотидов.

Якщо природних рестрикционных сайтів на місці мутації знайти вдається, то такі сайти можна створити штучно. Зокрема, розроблено методику створення з допомогою ПЛР нових сайтів рестрикції в мутантних аллелях, але не аллелях дикого типу — метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенезу (Ng et al., 1991; Eiken et al., 1991). І тому амплифицируемый ділянку ДНК вибирають в такий спосіб, щоб 3 «-кінець однієї з праймеров непосредственно примикав до мутантному сайту (Рис. 4.8). Саме це праймер неповністю комплементарен матричної ДНК. У нього ззмінюють одне із нуклеотидів з 3 «-кінця те щоб разом із нуклеотидом мутантного, але з нормального сайту тут утворювався сайт рестрикції для котрійсь із ендонуклеаз. Тоді після рестрикції і електрофорезу продуктів амплификации геномної ДНК у індивідуумів, які містять даноную мутацію, на электрофореграмме житиме один нерестрицированный фрагмент, у гетерозигот з’явиться два дополнительных фрагмента, відповідних за довжиною рестрицированним сегментам ДНК, і в гомозигот по мутації будуть присутні лише два фрагмента.

Концептуально близькими до цього варіанта є метод який отримав назву «ампліфікація рефрактерной мутаційної системи «- amplification refractory mutation system — ARMS. У основі методу лежить нездатність Taq1 термофильной полимерази до амплификации фрагмента за наявності несоответствия.

(mismatch) між матричної ДНК і трьох «-кінцем однієї з олигопраймеров (Newton et al., 1989; Bottema et al., 1990). Суть методу залежить від оновременном проведенні двох ПЛР, кожної у тому числі однією з праймеров служить аллель-специфическая мутантна чи нормальна олигонуклеотидная последовательность, відповідно. Причому у ролі другого прайміра щодо двох реакцій вибирають те ж олигонуклеотидную послідовність, отож у обох випадках можуть амплифицироваться ділянки ДНК однаковою протяженности. Мутантный сайт в аллель-специфических праймерах распохибна над центрі, а ближчі один до 3 «-кінцю, і найчастіше займає передостанню позицію. При певних умов, найважливішим із якого є концентрація іонів магнію в розчині, наявність сайту негомологичного спарювання в 3 «-області прайміра перешкоджає початку синтезу ДНК. Отже, при наличии мутації в досліджуваної матричної ДНК амплифицированные фрагменти утворяться тільки у разі, якщо за аллель-специфического праймера вибирається мутантна последовательность, тоді як із використанні нормального олигонуклеотидного праймера ПЛР блокується (Рис. 4.9.). Метод найшов широке застосування детекции мутацій при фенилкетонувдз, бета-талассемии, муковісцидозі, при типировании генов.

HLA системи. Проте, складності у підборі праймеров й у выборе оптимального режиму ПЛР обмежують широке застосування цього. Разом про те, його незаперечною перевагою є можливість застосування повністю автоматичного сканирования.

Так само перевагою мають і нові методи детекции стану гена, засновані на лигировании синтетичних олигонуклеотидных зондівOLA (oligonucleotide ligation assay).

Під час проведення цих реакцій специфічні ДНК чи РНК післядовательности досліджують шляхом застосування їх як матриці для ковалентного зв’язування двох пар олигонуклеотидных зондів (Landegren, 1993). ДНК-зонды для лигирования підбирают в такий спосіб, щоб були повністю комплементарны нормальному фрагмента ДНК у сфері локалізації мутації, причому сама нуклеотидная заміна повинна бути з кінця двох праймеров. Зазвичай, у одне із зондів вводять радіоактивну чи флюоресцентную мітку, а інший — мітять биотином. Після гібридизації при суворо стандартних умовах синтезовані олигонуклеотидные послідовності зшивають ДНК-лигазами з термофильных мікроорганізмів. Такі ферменти працюють при високих температур і зберігають свою активність за умов, необхідні проведення денатурації молекул ДНК. При наличии мутації в тестируемой молекулі ДНК на кінці однієї з зондів утворюється сайт некомплементарного спарювання, непосередньо примикає доречно лигирования. Наявність терминального неспаренного підстави у смежно розташованих послідовностях ДНК-зондов різко пригальмовує лігирования і за певних умов проведення реакції зшившикі між зондами у разі немає. Метод включає кілька послідовних циклів гібридизації, лигирования і денатурації. Розпочинаючи з другого циклу, матричної ДНК для гібридизації зондів поруч із тестируемой пробою служать також лигированные послідовності. Надалі проводять электрофоретический аналіз мічених однонитевых фрагментов.

ДНК. Система успішно апробована на мутаціях глобиновых геновий при серповидно-клеточной анемії і на мутації delF508 при муковисцидозе.

Універсальним методом детекции замін підстав є метод аллель-специфических олігонуклеотидів — ASO, що включає амплификацию фрагментів ДНК і подальшу дотчи слот-гибридизацию з міченими аллель-специфическими олигонуклеотидами (Reiss, 1991). І тому синтезують два типу олигонуклеотидных послідовностей зазвичай розміром 19 пар підстав, у яких мутантний сайт займає центральне положение. Кожен з цих олигонуклеотидных зондів комплементарен нормальному чи мутантному варіантів ДНК, соответственно. Умови гібридизації підбирають в такий спосіб, щоб дуплексы утворювалися лише за повної комплементарности гібридних пар. У умовах амплифицированные фрагменти ДНК без мутації будуть гибридизоваться тільки з нормальним зондом, ДНК гомозигот по мутації - тільки з мутантным і ДНК гетерозигот — з обома олигонуклеотидами.

(Рис. 4.10). Для зменшення перехресною аллель-специфической гібридизації в реакційну суміш додають 30-кратный хатиструм конкурентного немеченого олигонуклеотидного ДНК-зонда.

Розроблено зручні модифікації методу ASO з допомогою аллель-специфических ДНК-зондов, мічених биотином чи пероксидазой хрону (Лебедєва і др., 1994).

Найбільш швидким, економічним і дуже зручним методом сканірования точкових мутацій є модифікований вариант.

ASO, так звана гибридизационная система зворотного дот-блота (reverse dot-blot hybridisation system) (Saiki et.al., 1989). Метод дозволяє одночасно скринировать сразу багато точкових мутацій і доступний автоматизации.

(Chebab, 1993). І тут проводять гібридизацію мічених продуктів ПЛР, зазвичай що становлять окремі экзоны, з фіксованими на нейлонових фільтрах аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами (ASO). Попередню иммобилизацию мутантних і нормальних ASO-зондов на мембранах осуществляют з допомогою приєднання гомополимерных T-хвостов з дезоксирибонуклеотид-трансферазой на кінці. У цьому олигонуклеотидные послідовності залишаються вільними і може брати участь у гібридизації з міченими амплифицированными фрагментами ДНК. Після відмивання несвязавшихся молекул ДНК радиоавтографические чи кольорові плями на фільтрах стають помітними лише у місцях локалізації олігонуклеотидів, підлогуностью комплементарных тестируемой геномної ДНК. Реакцію, зазвичай проводять у присутності іонів тетра-алкиламмония, які зменшують залежність температури плавлення від композиції підстав. Це дозволяє вживати однакові умови гібридизації щодо різноманітних олігонуклеотидів, тобто вести пошук відразу кількох типів мутацій, локалізованих щодо одного й тому самому экзоне гена. Він покладено основою разработки спеціальних систем, виділені на одночасної детекции найпоширеніших мутацій в досліджуваному гене. Система є стрічковий фільтр (здирати) з нанесеними плямами олигопраймеров, кожен із яких соответствует певної мутації. Стрип вміщують у розчин зі сумішшю тих мічених амплифицированных экзонов, які можуть містити тестируемые мутантні аллели і аналітиків створюють умови для аллель-специфифческой гібридизації. У такий спосіб сканують одновренно 42 мутації, відповідальні серповидноклеточную анеми, 34 мутації при муковісцидозі (Сhebab, 1993).

Дуже проста метод виявлення й ідентифікації описаних раніше мутацій в амплифицированных фрагментах ДНК грунтується на аналізі характеру электрофоретического поділу продуктів ПЛР в MDE-гидросвязывающих гелях у присутності високих концентрацій сечовини. Ці гелі сприяють формированию гетеродуплексов у процесі електрофорезу, причому розташування дуплексов дуже специфічно щодо різноманітних мутантных алелів, локалізованих щодо одного й тому самому амплифицированном фрагменті. Це дозволяє як виявляти, але з високим рівнем ймовірності ідентифікувати відомі мутации. У мультиплексном варіанті методики може бути одновременный пошук мутацій у кількох амплифицированных фрагментах. Простота та висока швидкість аналізу сприяють разработке з урахуванням поділу в MDE-гелях схем максимальної автоматизации процесу пошуку миру і ідентифікації відомих мутаций у пацієнтів і гетерозиготних носіїв мутаций.

Отже, методи виявлення мутацій досить різноманітними і постійно вдосконалюються. Передусім, молекулярному аналізу піддають ті гени, ушкодження яких сопровождаются розвитком найчастіших захворювань. Дослідження проводять або у сім'ях великий ризик, де вже є більные з тим чи іншим моногенным захворюванням для виявлення гетерозиготних носіїв, або у популяціях, де є велика вибірка з онкозахворюваннями та можна припустити високу частоту гетерозиготних носіїв мутацій. У цьому вибір конкретних схем ідентифікації мутантних алелів, зачасту, визначається діагностичними можливостями лабораторій та вартістю аналізів. Особливу увагу приділяють пошуку тих алелів, що зустрічаються в популяціях із високим частотою. Саме з таких мутацій розробляють простіші й ефективні методи молекулярної діагностики, позволяющие тестувати з онкозахворюваннями та проводити скринінг гетерозигот серед їх родичів або серед певних груп населения.

Найважливішою характеристикою мутантного аллеля є його кореляція із тяжкістю течії захворювання, тобто феєнотипическое вираз мутації в гомозиготном й у гетерозиготном стані, соціальній та компаунде коїться з іншими мутантними аллелями тієї самої гена. Багатьом моногенных хвороб обготівковувружено велика кількість алелів, котрі за своєму клиническому прояву може бути підрозділені різні групи, від дуже м’яких, надають незначний повреждающий ефект, до летальних чи полулетальных, що обумовлюють смерть пацієнтів в ранньому віці. Отже, молекулярная діагностика мутацій може мати що б значение для прогнозування розвитку захворювання і вибору адекватній тактики лікування. Такі скринирующие програми нині розроблені й успішно здійснюються в багатьох країнах для таких поширених захворювань як серповидноклеточная анемія, муковісцидоз (Rene et al., 1994). Реалізація цих програм поруч із великий мідіцинской користю дає і масу соціальних проблем, недоторые із яких розглянуті ниже.

ЗАПРОВАДЖЕННЯ У МОЛЕКУЛЯРНУ ДІАГНОСТИКУ І ГЕНОТЕРАПИЮ.

СПАДКОВИХ БОЛЕЗНЕЙ.

В.Н.Горбунова, В. С. Баранов.

ГЛАВА I. СТРУКТУРА І МЕТОДИ АНАЛІЗУ ДНК.

Розділ 1.1 Загальні уявлення, центральна догма, генітический код.

Розділ 1.2 Виділення ДНК, її синтез і рестрикция.

Розділ 1.3 Блот-гибридизация по Саузерну, гібридизація in situ.

Розділ 1.4 ДНК-зонды, клонування, векторні системы.

Розділ 1.5 Геномные і к-ДНК-овые бібліотеки генів, їх скрининг.

Розділ 1.6 Секвенування послідовностей ДНК.

Розділ 1.7 Полімеразна ланцюгова реакция.

ГЛАВА II. ГЕНОМ ЛЮДИНИ, СТРУКТУРА ГЕНОВ.

Розділ 2.1 Визначення геному та її основних элементов.

Розділ 2.2 Повторювані послідовності ДНК.

Розділ 2.3 Мультигенные сімейства, псевдогены, онкогены.

Розділ 2.4 Сучасне визначення поняття «ген », транскрипція, регуляторні елементи генов.

Розділ 2.5 Мерехтливість геному, полиморфные сайти рестрикции, ПДРФ-анализ.

Розділ 2.6 Вариабильные мікроі минисателлитные ДНК.

Розділ 2.7 Мобільність геному, облігатні і факультативные елементи генома.

Розділ 2.8 Изохоры, метилирование, гиперчувствительные сайты.

ГЛАВА III. ГЕНЕТИЧНІ КАРТИ, ПОЗИЦІЙНЕ КЛОНИРОВАНИЕ.

Розділ 3.1 Класифікація генетичних карт, оцінка сцепления.

Розділ 3.2 Соматическая гібридизація, цитогенетический аналіз, картування анонімних последовательностей ДНК.

Розділ 3.3 Генетичні індексні маркеры.

Розділ 3.4 Хромосом-срецифические бібліотеки генів, пульсуючий гель-электрофорез.

Розділ 3.5 Позиційне клонування, прогулянка і стрибки по хромосомі, ідентифікація і ізоляція генов.

Розділ 3.6 Каталог генів і генних хвороб МакКьюсика.

Міжнародна програма «Геном людини » .

ГЛАВА IY. ТИПИ І НОМЕНКЛАТУРА МУТАЦІЙ. МЕТОДИ ДНК;

ДИАГНОСТИКИ.

Розділ 4.1 Мутантні аллели, характеристика і типи мутаций.

Розділ 4.2 Генетична гетерогенність спадкових заболеваний.

Розділ 4.3 Номенклатура мутаций.

Розділ 4.4 Ідентифікація структурних мутацій, ізоляція мутантних ДНК.

Розділ 4.5 Первинна ідентифікація точкових мутаций.

Розділ 4.6 Молекулярне сканування відомих мутаций.

ГЛАВА Y. ПОПУЛЯЦІЙНИЙ АНАЛІЗ МУТАЦІЙ. ЭНДОГЕННЫЕ.

МЕХАНІЗМИ СПОНТАННОГО МУТАГЕНЕЗА.

Розділ 5.1 Популяційний аналіз мутацій, поліморфізм, неравновесность по сцеплению.

Розділ 5.2 Частоти спонтанного мутагенеза.

Розділ 5.3 Ендогенні механізми виникнення мутаций.

Розділ 5.4 Механізми підтримки створення і поширення мутаций в популяциях.

ГЛАВА YI. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ АНАЛІЗ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНОВ.

Розділ 6.1 Диференційна активність генів, вибір адекватних біологічних моделей.

Розділ 6.2 Аналіз регуляторних елементів гена, ізоляція як дослідження мРНК, штучні транскрипционные системы.

Розділ 6.3 Аналіз трансляції, ДНК-экспрессионные системы.

ГЛАВА VII. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТИ ПРЕНАТАЛЬНОЙ.

ДІАГНОСТИКИ СПАДКОВИХ БОЛЕЗНЕЙ.

Розділ 7.1 Прямі й опосередковані методи молекулярної диагностики.

Розділ 7.2 ДНК-диагностика що за різних типах наследования.

Розділ 7.3 Групи ризику, пошук гетерозиготних носітьлей мутаций.

Розділ 7.4 Особливості застосування молекулярних методів у пренатальної діагностиці моногенных болезней.

Розділ 7.5 Доімплантаційна діагностика, загальна схема пренатальної діагностики, точність прогнозирования.

ГЛАВА YIII. БІОЛОГІЧНІ МОДЕЛІ СПАДКОВИХ БОЛЕЗНЕЙ.

ЧЕЛОВЕКА.

Розділ 8.1 Генетичні лінії животных.

Розділ 8.2 Трансгенні животные.

Розділ 8.3 Експериментальне моделирование.

Розділ 8.4 Конструювання модельних генетичних чиний животных.

Розділ 8.5 Методи спрямованого перенесення генов.

ГЛАВА IX. ГЕННА ТЕРАПИЯ.

Розділ 9.1 Визначення, історична довідка, програми генної терапии.

Розділ 9.2 Типи генотерапевтических втручань, вибір клеток-мишеней.

Розділ 9.3 Методи генетичної трансфекції у генній тірапии.

Розділ 9.4 Конструювання векторних систем і совершенствование методів трансформації клітин чоголовека.

9.4.1 Основні векторні системы.

9.4.2 Методи фізичного перенесення чужорідної ДНК у клітини эукариот.

9.4.3 Липосомный метод трансфекции.

9.4.4 Рекомбинантные вирусы.

9.4.5 Перспективи створення «ідеальних «векторних систем.

Розділ 9.5 Генотерапія моногенных спадкових заболеваний.

Розділ 9.6 Генотерапія ненаследственных захворювань: пухлини, инфекции.

Розділ 9.7 Деякі етичні і соціальні проблеми геніншої терапии.

ГЛАВА X. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ.

МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Розділ 10.1 Хромосомная локалізація та принципи классификации генів спадкових болезней.

Розділ 10.2 Метаболічні дефекти лизосомных ферментов. Хвороби накопления.

Розділ 10.3 Хвороби експансії, викликані «динамічноми «мутациями.

Розділ 10.4 Моногенные спадкові хвороби, диагностируемые молекулярними методами в России.

10.4.1 Муковисцидоз.

10.4.2 Миодистрофия Дюшенна.

10.4.3 Гемофілія А.

10.4.4 Гемофілія B.

10.4.5 Хвороба Виллебранда.

10.4.6 Фенилкетонурия.

10.4.7 Синдром Леш-Нихана.

10.4.8 Хвороба Вильсона-Коновалова.

10.4.9 Адрено-генитальный синдром.

10.4.10 Спінальна м’язова атрофия.

10.4.11 Атаксия Фридрейха.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

ГЛАВА Y.

ПОПУЛЯЦІЙНИЙ АНАЛІЗ МУТАЦІЙ. МЕХАНІЗМИ СПОНТАННОГО.

МУТАГЕНЕЗА.

Розділ 5.1 Поліморфізм, неравновесность по сцеплению.

Молекулярна ідентифікація мутантних алелів і разработка ефективних методів їх діагностики в хворих і в ґетерозиготных носіїв є тим експериментальної базою, що дозволяє досліджувати поширеність мутацій у різних етнічних групах і популяціях. Одночасно візможен аналіз зчеплення мутантних алелів коїться з іншими генетическими маркерами і - оцінка цій основі гаданих механизмов виникнення й підтримки в популяціях наблюдаемого рівня мінливості. Але як можливість перейти до опису основні цілі і методів популяционного аналізу мутацій впределим точніше дві основні поняття, часто використовуваних під час проведення подібних дослідженнях — це поняття полиморфизма і неравновесности по сцеплению.

Генетична мінливість локусу у певному поповіляции вимірюється рівнем поліморфізму, і кількісним виражением цього заходу служать частоти алелів. У однолокусной двухаллельной системі частоти двох варіантів алелів — А1 и.

А2, позначаються літерами p і q, соответвственно, і (p+q=1).

Коли говоримо, що у популяції існує поліморфізм по мутації, це що означає, що її частота вище певного выбранного відповідно до якимись причинами умовного уровня, найчастіше вище 5%. Высокополиморфными вважаються локусы з близькими значеннями частот алелів. У великих популяціях зі випадковим характером схрещування, тобто у панмиктических популяціях, діє закон Харди-Вайнберга, за яким частоти гомозиготных особин в популяції рівні p!2 і q!2, соответстенно, а частка гетерозигот дорівнює 2pq. Таким проразом, в двухаллельной моделі частота гетерозигот в популяции по полиморфным локусам становить від 10% і більше, а, по высокополиморфным локусам може становити 50%. Якщо алелів в локусі більше двох, загальна частота гетерозигот в популяції дорівнює 1 — (p1!2 + p2!2 + … + pn!2), де pk — частота аллеля Ak, k = 1, 2, … n і p1 + p2 +… + pn = 1.

У цьому частка гетерозигот в популяції зростає увеличением числа алелів і становить максимального краю в каждой групі із n алелів за однакової кількості їх частот. Таким образом, зі збільшенням числа алелів, можна зустріти із рівними імовірностями, частота гетерозигот в популяції буде стремиться до одиниці, тобто подовляющее число особин в популяции будуть гетерозиготными у цій локусу. Така ситуація й у высокополиморфных микросателитных повторів, зокрема STR, що робить їх поряд з іншими преимуществами найзручнішими генетичними маркерами.

Як ми вже згадували, частими моногенными наследственными захворюваннями вважаються такі, у яких одне болюче дитина зустрічається серед 2000 — 10 000 новонароджених, тобто q!2 коливається не більше 1 /2000 — 1/10 000. Соответственно, частота мутацій — q, у тих генах становить от.

0.5% до 2.5% і гетерозиготних носіїв — 2pq, достигает 1% - 5%. Для рідкісних захворювань частоти гетерозигот становить десятих часткою відсотка. Тим ні менш, з урахуванням, що це спільне кількість різних моногенных заболеваний становить близько 5000 нозологій, виявляється, що, загалом, кожна людина є носієм мутантних алелів близько 10 генів. У випадку, набір цих генів различен в різних покупців, безліч лише у сім'ях, де батько й мати є носіями мутацій однієї й тієї ж гена появляется.

25%-ый ризик народження хворого ребенка.

До цього часу ми розглядали мінливість щодо одного локусе.

— A. Поняття неравновесности по сцеплению визначає отношения між мінливістю у двох локусах — A і B. Ситуація тут то, можливо двоякою. Якщо мінливість у тих локусах незалежна, то аллели двох локусів зустрічаються в популяції у випадкових комбінаціях. Проте, якщо аллели різних локусів тільки в комбінаціях зустрічаються частіше, ніж у сусідніх, то говорят, що є неравновесность по сцеплению. Количественно цей зв’язок оцінюється з допомогою детермінанта нерівновесности по сцеплению — d. Розглянемо, чому дорівнює детерминант неравновесности по сцеплению в двухлокусной двухаллельіншої системі. Нехай Pnm, де n=1,2 і m=1,2, частоти чотирьох можливих, у цьому випадку типів гамет — A1B1, A2B2, A1B2,.

A2B1, а Pn і Rm — частоти алелів локусів A і B, соответственно. Якщо поєднання алелів в гаметах випадкові, то теоретично очікувані частоти гамет чотирьох типів рівні твору частот які входять у ці гамети алелів, то есть.

Pnm=Pn*Rm. І тут твір частот двох типів гапозначок (A1B1 і A2B2), що у стані «тяжіння », одно твору частот гамет може «відштовхування «.

(A1B2 і A2B1), тобто P11*P22 = P1*P2 *R1*R2 = P12*P21. Однако, якщо поєднання алелів в гаметах невипадкові, то ці твори різні. Їх різницю служить мірою нерівновесности по сцеплению — d. Отже d = ¦P11*P22 — P12*P21¦ За відсутності неравновесности по сцеплению d = 0. Верхня грака d = 0.25. Максимальна неравновесность по сцеплению характеризується повної відсутності двох типів гамет, знаходячищихся або у стані «тяжіння », або у стані «відталкивания », за одночасного рівність частот двох типів гамет.

Мутації у різних локусах виникають, зазвичай, незалежно друг від одного й наявність неравновесности по сцеплению, очевидно, відбиває те що, що мутація у одному з локусів виникла хромосомі, несучою певний аллель іншого локусу, і далі ця хромосома отримала распространение в популяції. Неравновесность по сцеплению є дуже важливою популяційної характеристикою, що дозволяє будувати висновки про порядку і примірному часу виникнення різних мутацій, і навіть оцінювати можливі механізми їх підтримки поповіляции. Виявлення сильної неравновесности по сцеплению міжду специфічними мутаціями гена й певними аллелями маркерних локусів має важливе практичного значення. Часто спостерігається неравновесность по сцеплению між мутантними аллелями гена і водночас кількома маркерными локусуми. І тут аналіз маркерних гаплотипов, тобто наборів алелів різних локусів, локалізованих лише у хромосоме, дає можливість із високою імовірністю оценивать характер мутаційного ушкодження і простежувати його успадкування у сім'ях больного.

Розділ 5.3 Частоти спонтанного мутагенеза.

Вважається, що сьогодні середня частота спонтанного возникновения мутацій в структурних локусах людини коливається в пресправах від 10(-5) до 10(-6) однією гамету за кожне поколение. Проте, їх кількість може значно варіювати до різних генів, змінюючись не більше від 10(-4) для высокомутабильных локусів до 10 (-11) у найбільш стійких частинах генома. Ці розбіжності залежать від багатьох факторів, і, насамперед, від характеру мутаційного ушкодження, від механізму виникнення мутації і локалізації порушення. Велике значение також має сам ген, протяжність його які кодують проластей й ті функції, які виконують контрольовані їм молекулы у забезпеченні життєдіяльності клітин та всього организиа, загалом. Приміром, порушення роботи генів, продукция яких необхідна на ранніх стадіях ембріогенезу, може спричинить загибелі плоду. Такі мутації важкі для діагностики й у практичної медицині ми найчастіше маємо справа тільки з мутаціями, яка виявляє летального еффекта на ранніх стадіях ембріонального розвитку. Тим ні менеї, цілком можливо, що ранні ембріональні літали составляет чималий відсоток серед мутантних алелів різних генів і вносять певний внесок у зниження репродуктивної функции.

Особливої уваги заслуговує проблема мутування в.

STR-сайтах й у VNTRлокусах, часто які у час для геномної дактилоскопії та молекулярної диагностики.

Ці ділянки геному, мінливість у яких обумовлена различиями серед тандемных повторів, формально можна зарахувати до розряду высокомутабильных. Відразу підкреслимо, проте, що пручимоє зіставлення темпів мутування в які кодують областях геному й у мініі микросателлитных послідовностях ДНК, очевидно, некоректно, оскільки фізична основа изменчивости, що спостерігається у тих функціонально і структурно различающихся локусах цілком різна. Мутабильность в.

STR-сайтах обумовлена нестабільністю числа повторів, приніж виникаючі мутації зачіпають, зазвичай, лише весьмало обмежену кількість кластерированных копій, найчастіше 1 чи 2. Такі тандемные повтори рідко спостерігаються в значеннєвих послідовностях ДНК. Виняток припадає лише мутації експансії, але й них характерно (1) существование значної частини алелів дикого типу, які один від друга невеликим числом копій, і (2) значні відмінності за довжиною повторюваного ділянки між нормальними, і мутантними варіантами гена. З іншого боку, мінливість в.

STR-сайтах основу своєї носить нейтральний характері і потому темп мутування у тих локусах уникає жорсткому контролю із боку природного отбора.

Прямі засвідчили, що у вона найчастіше частота виникнення спонтанних мутацій в микросателлитных.

STRсайтах варіює не більше від 0.1% до 0.45% на гамету, що має враховуватися під час використання цих маркерів в практичної медицині. Частота мутування в вариабильных.

(C-A)nповтори, використовуваних як індексних маркерів в Genethon — картах зчеплення становить 0.05% на гамету.

Показано, що з низки VNTR-локусов (MSB2) частота мутирования сягає 0.7% на гамету. Для інших локусів (М17) обготівковувружено достовірне перевищення швидкості мутагенезу в запологишевых клітинах проти соматичними. Багатьом досить стабільних STR-локусов виявлено суттєві межпопуляционные відмінності за частотою алелів, що дозволяє вживати цю мінливість для генетичної характеристикі окремих популяцій. У той самий час інші STR-сайты значительно частіше піддаються спонтанного мутированию, що зводить до врівноважування паттерна алелів і робить ці марціры малопридатними для популяційних досліджень. Є дані, що в вариабильных STR-локусах частота спонтанних мутацій може становити 5% на гамету за поколение.

(Jeffreys et al., 1988).

Розділ 5.3. Ендогенні механізми виникнення мутаций.

Основну частина мутацій, які ведуть спадковим болезням, становлять точкові мутації, делеции й у меншою степені инсерции і дуплікації. У цьому, як свідчить детальний з порівняльного аналізу, частота, тип і локалізація цих мутаций аж ніяк невипадкові і залежать від багатьох, поки що невиясненных ендогенних механізмів мутагенезу. На користь висновку свідчить унікальний характер спектра мутацій кожного з багатьох десятків генів, первинна структура.

ДНК і типи мутацій яких добре вивчені. Так, для многих структурних генів домінуючими за широким спектром й частоти являются точкові мутації (ген трансмембранного регуляторного білка муковісцидозу, ген фенилаланингидроксилазы, ген фактора IX cвертывания крові, бета-глобиновый ген і мн ін.), тогі як й інших — досить довгі структурні перестройки типу делеций, дуплікацій і инсерций (гени дистрофіна, чинника VIII згортання крові, 21-гидроксилазы).

(см. Главу X). До структурних чинників, визначальним эндогенные механізми мутагенезу, можна віднести (1) наявність прямих і зворотних повторів і симетричних елементів поблизу місця перестройки; (2) високу концентрація СpG динуклеотидов; (3) наявність внегенных послідовностей ДНК, гомологичных фрагментами структурного гена; (4) мобільні елементи генома.

Природно, що реалізація цих структурних чинників у ті чи інші типи мутацій можлива лише процесі репликации.

(1,2) і рекомбінації (3) ДНК хромосом.

Як докладно розглянуто у серії робіт D. N Cooper и.

M.Кrawczak (1990, 1991), його присутність серед первинної структурі ДНК прямих повторів, ідентичних повторюваних послідовникностей, инвертированных повторів, шпилечных структур, квазипалиндромных послідовностей і симетричних елементів геному (наприклад CTGAAGTC) нерідко веде до утворення петель при реплікації ДНК внаслідок ковзаючого порушення спарювання (slipping mispairing) батьківської і дочірньою цепий ДНК. Нові структурні елементи ДНК або уничтожаются ферментами системи репарації, що веде до делециям, чибо зберігаються дублюються, що зумовлює дупликациям і инсерциям, у своїй виниклі зміни закріплюються при наступних раундах реплікації. Автори дійдуть наступним висновків: (1) виникнення подібних мутацій відбувається не випадково, але залежить від особливостей первинної структуры.

ДНК на місці перебудови; (2) основу структурних перестроек.

ДНК лежать помилки реплікації; (3) принципово подібні модічи ендогенного мутагенезу характерні як делеций, так инсерций. Вважається, що став саме механізм ковзаючого нарушения спарювання відповідальний мутації експансії, приводящие швидкого збільшення кількості тринуклеотидных повторів і спричиняє порушення роботи відповідних генів, і навіть за високу мінливість, спостережувану у багатьох місцях локалізації мініі микросателлтных тандемных повторов.

Нещодавно показано, що підвищеною ендогенної мутагенностью мають взагалі усе послідовності ДНК, находящиеся у певному конформационном стані, приміром у стані вигину (bent DNA) (Milot et al., 1992). Відомо, що ця конформационная структура ДНК властива промоуторованим частинам генів, місцях початку реплікації (origins of replication), місцях контакту хромосом з ядерною матриксом.

Саме це ділянки ДНК є місцями посадки ферментів топоизомераз, втягнутих у процеси реплікації, транскрипции, рекобинации, зокрема, як з’ясувалося, й у процес негомологичной (незаконноїillegitimate) рекомбнации. Вустановлено, що став саме негомологичная рекомбінація може приводить як до внутригенным делециям, дупликациям та інших мутацій на молекулярному рівні, а є однією з основних причин великих структурних хромосомних перебудов типу транслокаций, інверсій і других.

Заміни чи втрати окремих підстав в геномної ДНК можуть бути внаслідок порушення процесів реплікації і репарації. Помилки в ДНК матриці, викликані дією заговорили українською уреждающих зовнішніх агентів, або спонтанної деградацією оснований закріплюються у наступних циклах реплікації. Основні типи спонтанної деградації включають втрату підстав і процесс дезаминирования. Особливо чутливі до дезаминированию цитозиновые залишки. Встановлено, що з хребетних почти половина всіх цитозиновых залишків в ДНК метилирована в.

5-ом становищі. Процес метилування особливо рясно захватывает області повторів 5 «CpG 3 », розташовані і в середині генів, і у їх промоторных частинах. При дезаминировании.

5-метилцитозин перетворюється на тимин. У циклі наступної реплікації, що виник результаті дезаминирования мисмэтч.

(T-G) може або коррегироваться в нормальний варіант (С-G), або спричинить мутацій типу трансцизий (Т-G) чи (С-А).

Природно, що гени, мають у своїй структурі великий відсоток CpG підстав, особливо рясно піддаються спонтанному мутированию типу трансцизий. Зокрема, переважання таких крапкових мутацій відомо для генів чинників IX и.

VIII згортання крові, для гена фенілкетонурії і других.

Так, з 76 мутацій гена чинника ІХ ст 21 разі знайдено трансцизии CpG — TpG чи СрА (Green et al., 1990). Преобладание таких мутацій зазначено й у 22 CpG дуплетах гена фенилаланингидроксилазы в хворих на фенілкетонурію (Abadie et al., 1989).

Іншою важливою чинником ендогенного мутагенезу служить наявність тісно зчеплених з генами гомологичных последовательностей ДНК (псевдогенов). У мейозе що ситуація нереддо призводить до нерівній гомологичной рекомбінації як наслідок цього, до генної конверсії, сопровождающейся структурными перебудовами типу делеций, дуплікацій тощо. Подобный механізм мутацій, як з’ясувалося, є домінуючою для гена 21-гидроксилазы (Morel, Miller, 1991), і навіть для гена чинника VIII згортання крові (Lakich et al., 1993).

Важлива роль помилок рекобинации в етіології структурних поломок гена особливо очевидна під час аналізу гена дистрофіну, мутации котру ведуть до міопатії Дюшенна. Відомо, що у 60% випадків мутації цього гена є делеции, захватывающие чи кілька сусідніх экзонов. Відомо також, що переважна більшість делеций зосереджене у двох «гарячих «районах цього за величиною гена.

(2,2 МБ), і навіть частота внутригенных рекомбінацій майже 4 рази більше, чим можна припускати, виходячи з її размерів (Oudet et al., 1992). Цікаво зазначити, що у однієї з цих гарячих точок (интрон 7) недавно виявлено кластер транспозоноподобных повторюваних последовательностей.

Питома вага мобільних (транспозонподобных) елементів типа.

Alu і Line повторів (див. Главу 2) у виникненні генних мутаций остаточно не з’ясований. Є поодинокі спостереження про реальному перемещнии цих елементів на кшталт конверсії та його інтеграції в структурні гени аденозиндезаминазы, аполипопротеина З, чинників VIII і IX згортання крові, кальмодулина (Vidaud et al., 1993).

Розділ 5.4 Механізми підтримки створення і поширення мутаций в популяциях.

Частоти і характеру розподілу мутацій в популяціях залежать від багатьох чинників, головними серед яких є частоти мутагенезу і тиск природного відбору. Значительное впливом геть той процес багатодітній родині і структурні особливості популяцій, такі як розміри, ступінь географической і етнічної ізольованості, величина інбридингу, характер міграції населения.

Всім мутацій, виникаючих з допомогою підвищеного уровня спонтанного мутагенезу, характерні наступні особенности.

— невипадковий характер внутригенной локалізації мутацій, подібність типів порушень за відсутності повної молекулярної ідентичності з-поміж них. На відміну від спонтанних мутацій, вызыванных ендогенними причинами, для мутацій, индуцированных дією несприятливих чинників довкілля, промышленными і сільськогосподарськими шкідливостями, іонізуючим опроміненням, хімічними агентами та інших, специфіки в типах мутацій й у характері їх локалізації немає. У поповіляциях, що у області дії таких несприятливих чинників, підвищиться частота мутацій у різних генах, проте спектр индуцированных мутацій буде досить по-різномуобразным.

Розглянемо тепер вплив відбору процес поддержания створення і поширення мутацій в популяціях. Багато гени моногенных спадкових захворювань рецессивны, тобто мутации у яких в гетерозиготному стані не надають шкідливого впливу життєздатність. Тому після виникнення мутація може поширюватися в популяції до певної концентрації, мало наражаючись элиминирующему дії природного відбору. Надалі частота цієї мутации досягне рівноважного гніву й нічого очікувати підвищуватися з допомогою выщепления гомозиготных особин, життєздатність і репродуктивні якості яких різко знижено. У цьому скорость елімінації мутації з популяції різко сповільнюється за незначного зниження її частоти та практично, після виникнення мутація може зберігатися в популяції уже багато десятків і навіть сотень поколінь. Різні мутації можуть випадково отримати популярнішими в изолированных популяціях чи серед груп населення, відмінних підвищеним рівнем інбридингу. У цілому нині, за відсутності давшиления відбору стосовно гетерозиготным особам загальна кінцентрация мутантних алелів в популяції визначається частотого спонтанного виникнення, у своїй пул мутацій складатиметься з великої кількості різноманітних алелів, каждый яких буде представлений рідкісними і навіть поодинокими випадками у різних популяциях.

Проте, специфічні мутації можуть одержати значительно ширше поширення тому випадку, коли гетерозиготные особини мають будь-які селективні преимущества. Таким ефектом може мати сама мутація, а більш імовірна можливість неравновесности по сцеплению між цієї мутацією і селективными аллелями іншого локусу. Гетерозиготи можуть одержати перевагу за зміни умов окружающей середовища, у якихто екстремальних ситуаціях чи серед певних груп населення. Приміром, мутації, повышающие стійкість організму до дії інфекційних агентів, можуть одержати стала вельми поширеною під час масових епідемій. Одночасно підвищиться частота всіх алелів інших локусів, що у неравновесности по сцеплению з цією мутацією. Мутантні аллели, щоб забезпечити селективне претамущество гетерозигот, стають переважати у багатьох популяціях, в повному обсязі ізольованих друг від друга. У цьому найбільша частота таких алелів буде наблюдатся в районах, де вплив підтримує відбору було максимальным.

(наприклад, центрі епідемії). Віддаляючись від прийняття цього району концентрація таких мутантних алелів буде уменьшаться, причому їх розподіл у різних популяціях корелюватиме з характером міграції населення. Такий пхерактер розподілу певного мутантного аллеля в частково ізольованих популяціях по зв’язують з так званим ефектом засновника чи родоначальника.

Дослідження спектрів розподілу мутацій в различных популяціях дозволяє робити припущення щодо можливого походження таких ушкоджень кісткової та тих механізмів, які у основі їхньої поширення серед населения.

Розглянемо найімовірніші інтерпретації різних варіантів розподілу алелів в популяціях. Мутації, представлені у одиничних хворих чи групі родинних індивідуумів і яким немає специфічної внутригенной локализации, очевидно, є результатом природного мутационного процесу. Якщо якихось популяціях концентрація мутацій у різних генах підвищена, мабуть, вони у дії зовнішніх несприятливих чинників, индуцирующих виникнення порушень у структурі ДНК. Там, коли локалізація і типи мутацій носять специфічний характер можна припустити наявність особливих молекулярних механизмов контролю підвищеного рівня мутагенезу в определеннных районах геному. Поширення специфічних мутацій в злированных популяціях відбувається поза їхній рахунок обмеженого розміру й підвищеного рівня інбридингу (ефект родоначальніка). І, нарешті, виявлення градиентного розподілу мутацій, превалирующих у різних, частково ізольованих популяціях дозволяє припускати селективне перевагу гетерозиготних носіїв мутацій на певних етапах эволюционного развития.

Отже, зіставляючи спектри розподілу однетипных мутацій жителі різних континентів, різних країн, люди, які належать до різним расам і національностей можна визначити рівень генетичної близькості між всіма цими групами і реконструювати їх филогенетические отношения (Cavalli-Sforza, Piazza, 1993). Однією з практичних наслідків цих досліджень є можливість прогнозировать найімовірніші мутації у різних генах у пациентов різного етнічного походження, що зумовлює сужению спектра пошуку специфічних мутацій. Особливу увагу у сенсі представляють найпоширеніші мутации.

(наприклад delF508 при муковісцидозі; R408W — при фенилкетонурии і ще). Для профілактики спадкових заболеваний необхідна розробка ефективних і найпростіших методов молекулярної діагностики таких мутацій як в хворих, і у гетерозиготних носіїв з проведення скринирующих програм серед населення і побудову виявлення максимально візможного числа родин зі підвищеним ризиком народження хворого ребенка.

ГЛАВА VII.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТИ ПРЕНАТАЛЬНОЇ ДИАГ;

НОСТИКИ СПАДКОВИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Розділ 7.1 Прямі й опосередковані методи молекулярної диагностики.

Локалізація і клонування кДНК-овых последовательностей генів відкривають принципово нові можливості диагностики спадкових захворювань, засновані на дослідженні мутантних алелів у пацієнтів, членів їхнім родинам або в предполагаемых гетерозиготних носіїв патологічних мутаций.

Це однаково стосується й пренатальної діагностиці, яка може бути з допомогою молекулярних методів аналізу ранніх стадіях розвитку плода.

(см. 7.5). Ці самі підходи цілком прийнятні діагностики до появи будь-яких клінічних чи біохімічних симптомів хвороби (досимптоматическая діагностика), що дозволяє випрацюватимете, і розпочати раціональну тактику лікування (випереджаюча терапія), і навіть ефективно виявляти гетерозиготних носітьлей у сім'ях великий ризик, що є важливою чинником профілактики спадкових хвороб. Вирішальними преимуществами молекулярної діагностики є її універсальність, можливість вільно використовувати для аналізу будь-які ДН-содержащие клітини чи тканини, причому аналіз то, можливо походить з любых стадіях онтогенезу, починаючи з стадії зиготы.

Принципово розрізняють пряму непряму ДНК-диагностику мононогенных спадкових хвороб. У випадку, використання прямих методів діагностики можливе лише для клонованих генів з відомою нуклеотидної послідовникностью полноразмерной кДНК, у своїй необхідно випередительное генотипирование мутантних алелів від батьків. Що стосується прямий діагностики обьектом молекулярного аналізу является сам ген, точніше мутації цього гена, ідентифікація доторых і як основне завдання дослідження. Такий підхід ефективний в наявності наявності точної інформації про природі, частоті і локалізації найпоширеніших (доминирующих за частотою) мутацій відповідних генів, і навіть про наявність у них особливо легко мутирующих «гарячих «точок. До таких належить мутація delF508 й інших мутацій при муковісцидозі, делеционные мутації при міодистрофії Дюшенна, мутація R408W при фенілкетонурії, інверсійна мутація при гемофілії А, протяжна делеция при адрено-генитальном синдромі, експансії триплетных повторів у разі «динамических «мутацій при синдромі ламкою X-хромосомы і за ряді других нейродегенеративних захворювань (див. Глави IV і X). Методы, використовувані для спрямованого пошуку цих мутацій, докладно розглянуті в Главі IV. Нерідко (муковисцидоз, фенілкетонурія, серповидно-клеточная анемія) ці методи вдалося автоматизувати, що дозволяє одноверменно тестіровать відразу кількох (до 30 і більше) різних мутаций.

У цьому з’являється можливість виявляти свыше.

95−98% мутантних хромосом, що робить доцільним і економически виправданим скринирование всієї популяції країн на виявлення мутантних особин для наступної организации ефективних профілактичних заходів, вкладених у попередження народження хворих дітей. Такі програми з муковисцидозу вже успішно проводяться у низці країн Західіншої Європи (Великобританія, Данія, Франція) та Північної Америки.

Головна перевага прямого методу — це висока, доходящая до 100%, точність діагностику і відсутність необходимости аналізу сім'ї щодо її информативности.

(см.ниже). Остання обставина особливо важливо задля проведення пренатальної діагностики важких, найчастіше летальних спадкових хвороб (муковісцидоз, миодистрофия Дюшенна, гемофілія Проте й ін). Такі сім'ї нерідко звертаються за медико-генетической допомогою вже коли хворий дитина помер. Так, за нашими спостереженнями до 80% родин зі високим рискому муковісцидозу звертаються про необхідність дородовиття діагностики вже по смерті хвору дитину (Baranov et al., 1992).

Проте, дуже багато спадкових хвороб, котрим мутації не описані або знайдено маложорных мутацій в досліджуваних популяціях. І дуже навіть в усіх отих випадках, коли є мажорні мутації, водночас, описани численні мало поширені (до одиничних випадків), звані мінорні мутації. З іншого боку, всегтак зберігається можливість присутності у пробанда неизвестных мутацій, а клонування гена хвору людину з метою прямого секвенування, навіть обмеженого лише значеннєвий його частиною — кДНК, які завжди можливе силу очевидных фінансових і тимчасових обмежень такий підхід. Ці труднощі успішно долаються наявністю непрямых.

(непрямих) методів молекулярної диагностики.

Цей історично ближчий підхід грунтується на использовании зчеплених з геном поліморфних маркерів, з допомогою яких проводиться ідентифікації мутантних хромосом (точніше хромосом, несучих мутантний ген) у сім'ях великий ризик, тобто в батьків хворого й його найближчих родичів. Нині непрямі методи молекулярної діагностики принципово можливі практично всім моногенных заболеваний з відомою локалізацією контролюючого гена, кожного з яких розроблена зручна система позаі внутригенных поліморфних індексних маркерів (см. Главу III).

Понад те, непрямі методи молекулярної діагностики придатні для тих хвороб, гени яких ще идентифицированы і мутації невідомі. Єдиним і неодмінною умовою цього служить наявність поліморфних сайтів рестрикции або коротких тандемных повторів типу STR, що у безпосередній близькості до мутантного гена чи, що ще краще, усередині нього (переважно у интронах). З допомогою цих полморфных сайтів вдається маркувати мутантні аллели гена і простежити їх передачу нащадку (див. Главу 111). Ранні иследования непрямим методом проводилися майже з допомогою поліморфних сайтів рестрикції - двухаллельіншої системи, інформативна ємність якої перевищує 50%, а реальна кількість гетерозигот за цією ознакою в популяции, найчастіше, виявляється істотно нижчий 0.5. Следовательно, у разі лише половина гетерозиготних носителей спадкового захворювання, викликаного рецессивной мутацією якогось гена, то, можливо доступна непрямий молекулярної діагностиці з допомогою одного полиморфного сайту рестрикції. Підвищення інформативності в случае.

ПДРФ-анализа може бути досягнуто лише шляхом збільшення кількості поліморфних сайтів. Як првило, для діагностики необходимо чимало, а 3−4 поліморфних сайту, що зовсім ні в першій-ліпшій нагоді можливо. Чимало понять з поліморфних сайтів локализованы поза генів на відстанях, у яких кроссинговер може у помітному відсоток випадків спотворити результати диагностики. З іншого боку, практичне використання рестрикционных сайтів найчастіше утруднено через брак чи великий вартістю відповідних эндонуклеазных рестриктаз.

Всі ці недоліки можуть бути усунуті при использованді як молекулярних маркерів высокополиморфных тандемно повторюваних коротких триі тетрамерных повторов.

(STR) (див. Главу III). Багатьом генів знайдено унікальні патерни поліморфних алелів, які відрізняються числу «коровых «едининц повторюваних послідовностей нуклеотидов.

Такі «кількісні «полиморфизмы, як вже упоминалось.

(см. Главу III), дуже поширені з усього геному і є у интронных і що фланкують областях багатьох генів. Поява наприкінці 1994 р 0.7-сантиморганной карти генома людини, побудованої з урахуванням высокополиморфных динуклеотидных (C-A)n повторів, зробило реальним маркірування, практично, будь-якого картированного гена. Особливу диагностическую цінність представляють внутригенные маркери, для доторых різко знижена ймовірність кроссинговера з мутантними аллелями гена, отже, особливо висока точність діагностики. З іншого боку, як з’ясувалося, багато внутригенные полиморфные короткі тандемные повтори виявляють сильне нерівновага по сцеплению з деякими мутантними аллелями гена, що полегшує їх ідентифікацію в отягощенных сім'ях. Індекс гетерозиготности таких полиаллельных мініі микросателитных систем нерідко перевищує 0.8. Їх застосування дозволяє маркувати, тобто зробити информативными (див. 7.4) для ДНК-діагностики майже всі сім'ї великий ризик за наявності хвору дитину чи доступности для молекулярного аналізу його патанатомического малотериала .

Вивчення поліморфних маркерів хворий пробанда і батьків і з’ясування аллельной природи молекулярного марціра, зване «визначення фази зчеплення «(см. раздел.

7.4), лежить в основі для подальшої діагностики косвенными методами (Євграфов, Макаров, 1987). Застосування непрямих методів молекулярної діагностики передбачає й у качестве обов’язкового попереднього етапу дослідження частоти алелів відповідних поліморфних сайтів в анализируемых популяціях, серед з онкозахворюваннями та гетерозиготних носітьлей мутацій, і навіть визначення ймовірності рекомбінації і неравновесности по сцеплению між маркерными сайтами і мутантными аллелями гена. Такі дослідження з поміццю методів блот-гибридизации по Саузерну, або ПЦР.

(см. разделы 1.3.; 1.7; 2,5). У першому випадку у розпорядженні дослідника повинні прагнути бути відповідні ДНК-зонды, у сотром — повинні прагнути бути відомі нуклеотидные послідовності районів ДНК, які включають відповідні полиморфные сайти, для вибору олигопраймеров (див. Глави II, 1V).

Розділ 7.2. ДНК-диагностика що за різних типах наследования.

Нагадаємо, що дуже багато моногенных захворювань наслідується по рецессивному типу. Це означає, що з аутосомной локалізації відповідного гена хворіють лише гомозиготные носії мутацій. Гетерозиготы клінічно здорові, але із однаковою ймовірністю передають своїх дітей мутантний чи нормальний варіанти гена. Отже, протягом длительного часу мутація в прихованому вигляді може передаватися з покоління до покоління. При аутосомно-рецессивном типі наслідування в родоводів хворих, що або не доживають до репродуктивного віку, або мають різко сниженные потенції до розмноженню, рідко вдається виявити хворих родичів, особливо, за висхідною лінії. Виняток таких з підвищеним рівнем інбридингу, що виникає або з допомогою високої частоти близькоспоріднених шлюбів, або з допомогою шлюбу людей з однакових ізольованих популяцій обмеженою чисельності. Хворі діти з імовірністю 25% народжуються у його сім'ях, де обидва рвдителя є гетерозиготными носіями мутацій однієї й тієї ж гена. Можливе також народження дитини в тадідька лисого сім'ї, де хтось із подружжя несе мутацію, а сотраю мутація виникла гамете його партнера в останній момент, передшествующий запліднення. Частка таких родин у загальної групі ризику щодо невелика, а ризик повторного народження, у них хвору дитину вбирається у загальної частоти спонтанного виникнення мутацій у цьому гені. Для хвороб, зчепленийных із соціальною статтю, тобто контрольованих генами, локализоваными в.

Х-хромосомі, характеризуєтся тим, що хворіють переважно мальчики, тоді як носіями є девочки.

Y-хромосома містить обмаль генів, більшість із яких (близько 20) картировано в так званої псевдоаутосомной області короткого плеча, гомологичной такою на доротком плечі X-хромосомы. Найважливішим істинним геном Y-хромосоми, тобто геном, представленим лише з цієї хромосоме, є ген SRY (Yp21.1), детерминирующий розвиток статі по чоловічому типу. Мутації цього регуляторного гена до порушень статевої диференціювання (XY-женщины), яке перенос внаслідок помилок рекомбінації псевдоаутосомных районовий коротке плече X-хромосомы обумовлює синдром реверсії статіSex reverse (XX-мужчины) (McElreavey et al.,.

1993). Практично важливо, що навіть невеликого околоцентромерного фрагмента довгого плеча Y-хромосоми при кариотипе XX є беззастережною показанням видалення зачатків гонад таким індивідуумів у зв’язку з високої вероятностью експресії гена Gba, що призводить до їх злокачественному переродженню — гонадобластоме (Giquel et al., 1992). У отличие від Y-хромосоми, велика за величиною X-хромосома людини несе до 5% всіх структурних генів, чимало з яких вже ідентифіковані (див. Главу III).

Усі рецессивные аллели Х-хромосомы в хлопчаків виявляються, тому що розташовані в гемизиготном стані. Дівчатка могут хворіти у разі, якщо вони гомозиготны по мутации.

Така можливість зовсім може бути здійснений у ній, де хворий їхнього батька, а мати є носителькою мутації і передала дочері свій мутантний аллель. Якщо батько хворий дівчинки здоровий, можна припустити, що мутація виникла його гамете, яка брала участь у заплідненні. Х-сцепленные заболевания в дівчаток (миодистрофия Дюшенна, гемофілія А) може бути наслідком сукупної прояви мутації цих генів у однего із батьків і делеции відповідних фрагментів кульгавосом в іншого. У цих окремих випадках в дівчат, як і в хлопчиків, мутації Х-сцепленных генів перебуватимуть в гемизиготном состоянии.

При доминантном успадкування у розвиток хвороби достаточно одного мутантного аллеля. Такі хворих із вероятностью 50% народжуються у сім'ях, де із батьків болен.

Дуже рідко хворі діти з домінантним типом наслідування можуть народитися й у здорових батьків на результаті мутирования одній з гамет. Проте, ймовірність повторного народження хворої дитини такій сім'ї така сама, як й у популяції загалом. Пренатальна діагностика домінантних хвороб проводиться нечасто за низкою причин. По-перше, такі хвороби становлять відносно невеликий відсоток серед усіх моногенных захворювань. По-друге, важкі хвороби, сопровождающиеся смертю в ранньому віці чи наводячищие до безпліддя, не передаються у спадок, а з’являються щоразу наново внаслідок мутації при дозріванні гамет.

А для запобігання народження хворих, що доживають до репродуктивного віку, але й мають залишити потомство, є політичним питанням дискусійним. Проведение пренатальної діагностики таких захворювань приймається з урахуванням багатьох конкретних обставин. Актуальність цієї проблеми стала дуже очевидним останніми роками, коли було відкрита численна група домінантних нейродегенеративных захворювань (див. Главу IV), які проявляються порівняно пізно, нерідко вже у репродуктивному віці, важко протікають і, по суті, немає скільки-небудь реальіншої терапії. Для таких захворювань першочергового значення набувають методи досимптоматической діагностики з использованием методів ДНК-аналізу (см. Главу X).

Значно більше поширені моногенные хвороби з частковим домінуванням й неповної пенетрантностью. Для подобных захворювань ризик народження хворої дитини отягощенной сім'ї залежить від конкретних значень цих параметрів, які, своєю чергою, визначаються молекулярними механизмами, лежать основу формування такої роду відхилень від Менделевского типу наследования.

Розробка молекулярних методів діагностики хвороб, викликаних мутаціями в мітохондріальних генах, як свідчать дослідження останніх (McKusick, 1994), набуває особливого значення. Зазвичай, основу різних митохондриальных хвороб лежать порушення у системі окисного фосфорилювання. Оскільки деякі тканини мають повышенной чутливістю до таких порушень, подібна кліническая картина захворювань можна спостерігати внаслідок мутацій різних мітохондріальних генів. Успадкування таких хвороб істотно відрізняється від Менделевского типу, в превую чергу, через материнського характеру наслідувань мітохондрій, наявності у зиготе і переважають у всіх клетках організму значної частини копій мітохондріальних кульгавосом, через особливості сегрегації цих хромосом під час ділення клітин та, нарешті, через ті кількісних і якісних змін — у мітохондріальній ДНК, які соровождают процессы онтогенетической диференціювання клітин та старіння репетуванняганизма.

Всім «мітохондріальних хвороб «характерний матіринский тип спадковості й присутність мутантних алелів лише у частини хромосом (так звана гетероплазмия), частка з яких може варіювати у різних тканинах. Зазвичай, существует певне граничне значення частки мутантних хромосом, перевищення якого веде до появи і прогрессированию захворювання. Скорочення кількості мітохондрій, що походитьщее гаразд при старінні, може призвести до збільшення частки мутантних хромосом в определнных тканинах і тим самим бути причиною хвороби. Не випадково тому, що з многих.

" мітохондріальних хвороб ", характерно пізніше початок. З огляду на функціональних особливостей мітохондріальних генів годинуто спостерігається кумулятивний ефект двох і більше мутацій, локализованных у різних генах. Важливим представляється також та обставина, що у мітохондріальних генах OXPHOS-комплекса частота виникнення мутацій вище, ніж у ядерних генах, які кодують субьединицы окисного фосфорилирования.

(McKusick, 1994).

Розділ 7.3. Групи ризику, пошук гетерозиготних носітьлей мутаций.

Відповідно до вищевикладеного, точна діагностика разом із детальним аналізом типу наслідування тієї чи іншої захворювання має визначальне значення для формирования груп ризику, тобто відбору сімей, у яких можливість народження хворих дітей підвищена. Насамперед, це сім'ї, де вже зараз є чи був дитина, який потерпав будь-яким моногенным на захворювання. Для аутосомно-рецессивных хвороб з великою ймовірністю вважатимуться, що мати цієї дитини є гетерозиготными носіями мутантних алелів відповідного гена і соціальний ризик повторного народження хворої дитини такій сім'ї становить 25%, незалежно від результатів попередніх пологів. Тож у такі випадки рекомендується обов’язкова пренатальна діагностика плоду за будь-якої наступної беременности.

Для зчеплених із соціальною статтю захворювань важливою практичної завданням є виявлення випадків спонтанного виникнення мутацій у батьківському поколінні. Для таких поширених захворювань, як миодистрофия Дюшенна і гемофілія А, почти.

1/3 всіх випадків має спонтанне походження. У цьому мутації гена дистрофіну, зазвичай, творяться у оогенезе, тобто в матері, а мутації гена чинника Y111, зазвичай, появляются під час сперматогенезу в діда хвору дитину (см.

Главу X). На відміну від сімей, у яких мати гетерозиготна, ймовірність повторного народження хворої дитини сім'ях зі спонтанною мутацією вбирається у среднепопуляционіншої частоти, і тому не потрібно проводити пренатальную діагностику плоду при наступних беременностях. Специального розгляду у цьому разі заслуживает, однако, питання гонадного мозаицизма, тобто наявності у гонадах матері генітически нормальних і мутантних ооцитов. Особливо великий ризик такої міри у разі міодистрофії Дюшенна. Гонадный мозацизм через свою органної специфіки досить важко доби мовити чи спростувати. Тим більше що, вважається що 6,7% шппрадических випадків иодистрофии Дюшенна обумовлена гонадным мозаицизмом в (Essen et al., 1992).

Докладний медико-генетичне консультування сімей, де зареєстровані спонтанні випадки народження дітей с.

Х-сцепленными захворюваннями разом із відповідними лабораторними, зокрема і молекулярними дослідженнями, зазвичай, дозволяють з відповіддю про походження мутації. Так, гетерозиготное дотримання в то, можливо запідозрена, зокрема, за змістом відповідних білковых продуктів (наприклад, чинника Y111 згортання крові при гемофілії А; дистрофіну в м’язах і креатинкиназы в сыворотке крові при міодистрофії Дюшенна) або за допомоги спеціальных ДНК-методов, дозволяють ідентифікувати мутантний аллель в. Якщо диференціювання цих випадків невозможна чи доведено, що мутація хворий дитини перестав бути спонтанної, слід предпологать, що мати є гетерозиготной носителькою і з 50%-ой ймовірністю буде передувать хвороба своїм синам. І тут пренатальна діагностика обов’язкова і має супроводжуватися визначенням статі плоду. Слід, проте, підкреслити, що запровадження чоловічої статі плоду нині це не показанням для переривання вагітності, що у 50% случаїв вони мають від X-хромосому з аллелем гена і є цілком здоровими. Визначити, яку саме X.

— хромосому (з чи мутантным аллелем) отримав судущий хлопчик, і є саме молекулярної диагностики.

З допомогою прямих і непрямих методів ДНК-діагностики ця задача вже вирішується для дуже багатьох зчеплених зі статтю захворювань (см. Главу X).

Найефективнішою мірою профілактики спадкових захворювань є виявлення гетерозиготних носіїв мутаций, бо за цьому вдається запобігти народження переклвого хворої дитини сім'ях великий ризик. Родичі хворого на із високою імовірністю може бути гетерозиготными носіями мутантних алелів, у тому випадку, коли може бути, вони підлягають обстеження під час першого очередь.

Для хвороб, зчеплених зі статтю, це родичі по женсдідька лисого лінії - сестри, доньки Неоніли та тітки пробанда. Їх діагностика дуже багато важить, оскільки можливість народження хворих синів в прийдешнім носительок мутацій дуже високий та залежною від генотипу чоловіка. При аутосомно-рецессивных захворюваннях половина сибсов батьків і 2/3 здорових сибсов хворого будуть гетерозиготными носіями мутації. Тож у тих сім'ях, де принципово можлива молекулярна ідентифікація мутантных алелів, необхідно обстежити максимальну кількість родичів хворого пробанда виявлення гетерозиготних носіїв. Іноді у великих сім'ях із розгалуженими родословными вдається простежити успадкування неидентифицируемых мутацій з допомогою непрямих методів молекулярної диагностики.

Для захворювань, поширених у певних поповіляциях чи якихось етнічних групах і обумовлених присутністю однієї чи кількох переважаючих і легко ідентифікованих мутантних алелів, можливо проведення тотального скринінгу на гетерозиготное дотримання цих мутаций серед певних груп населення, наприклад, серед беремінних жінок чи серед новонароджених. Вважається, що удобный скринінг економічно виправданий, у тому випадку, якщо проведенні процедури виявляються аллели, складові не менеї 90 — 95% всіх мутацій даного гена в досліджуваної поповіляции. Виявлені при подібних опитуваннях носії мутаций також становлять групу ризику, і надалі повинні прагнути бути аналогічно протестовані їх дружини. Проте, у тому разі, якщо мутація знайдено тільки в котрогось із батьків, можливість народження хвору дитину трохи вища популяційної частоти, але, звісно, значно меньше.

25%. Конкретне значення цієї ризику залежить загальної частоти мутацій відповідного гена в популяції. У цих сім'ях за бажання батьків також може бути проведена пренатальна діагностика, і простежено успадкування мутантного аллеля. За відсутності цієї мутації в плоді прогноз вважається благоприятным, незалежно від цього, які аллели дитина дістане від другого супруга.

Розділ 7.4 Особливості застосування молекулярних методів у пренатальної діагностиці моногенных болезней.

Таким кроком після відбору яка потребує пренатальної діагностиці сім'ї є комплексне молекулярне обследование її - батьків і, якщо така можливість, хвору дитину. Ці дослідження можуть бути досить тривалими і тому бажано їх проводити до вагітності. Результати молекулярного обстеження сім'ї є основою призначення і вибору способів проведення пренатальної діагностики. Після цього сім'я планує беременность, й у певний час жінка вступає у клініку для проводения процедури, які забезпечують паркан необхідні діагностики тканин плідного походження. У цьому следме враховувати, що означає визначення конкретних термінів цієї процедуры залежить багатьох медичних показань (в превую чергу, акушерських), які забезпечують максимальну безопасность подібного инвазивного втручання як матері, так майбутньої дитини (Баранов і др., 1994; Баранов, 1994).

Найбільш об'єктивна інформацію про наявності моногенного спадкового захворювання в плоду може бути отримана під час аналізу його ДНК і виявленні мутаційних змін — у кодирующих чи регуляторних послідовностях відповідних генів. Практична діагностика мутантних алелів у сім'ях великий ризик проводиться для захворювань з вагомим ім'ям спектром найчастіше трапляються мутацій. У цьому для каждой хвороби розробляються досить прості і найефективніші методи ідентифікації мутантних алелів. У настоящее час нараховується кілька сотень таких заболеваний і кількість їх швидко зростає (Baranov, 1993; баранов, 1994; см. Главу X).

Для генотипирования мутацій, тобто для з’ясування припологи мутантних алелів хворий і батьків используются різні стандартні методи, докладно викладені у главі IV. Вибір конкретного методу залежить від типу предполагаемых мутацій і південь від методичних можливостей диагностических центрів. За відсутності у пробанда найчастіших і ранеї описаних мутацій його ДНК то, можливо спрямована в спеціализированные молекулярногенетичні лабораторії для более докладного аналізу з усього комплексу методов ідентифікації мутацій до отримання й секвенирования мутантних кДНКвых послідовностей гена. Проте, таких досліджень дуже дорогі, вимагають багато праці та часу й тому звичайній клінічної практиці використовують нечасто. У таких випадках частіше вдаються до непрямим методам молекулярної діагностики (див. розділ 7.1). Для многих захворювань, ці методи ще залишаються єдино можливими (см. Главу X). Проте, як зазначалося, вони вимагають обов’язкового обстеження повної родини, включаючи хвору дитину. У його відсутності молекулярне маркирование мутантних генів у гетерозиготних батьків стає неможливим, отже, неможлива і пренатальна діагностика.

Ідентифікацію мутантних генів здійснюють шляхом сравнения маркерних генотипів батьків і хвору дитину. Не стався кроссинговер між маркерным локусом і геном, все хворі діти у ній повинен мати однаковий маркерный генотип. Тому, за проведенні пренатальної діагностики подібність генотипів плоду і пробанда є необхідною, однак у деяких випадках, зовсім не від достатня умова підтвердження наявності захворювання. Приміром, у гомозиготных по маркерові батьків діти матимуть однаковий генотип у цій локусу незалежно від присутності мутантних алелів гена. Необхідною умовою диференціювання нормальных і мутантних генів у носіїв мутацій був частиною їхнього сцепление з різними аллелями маркерного локусу. Тому, дискриминация мутантних генів від батьків можливе тільки з поміццю гетерозиготних маркерів. За цих умов мутантні гени батьків можуть визначити за тими маркерным аллілям, що є хворий дитини. Проте, ідентификация по маркерным аллелям обох мутантних генів возможлише на у випадках, коли батьки гетерозиготны, а пробанд (хворий) гомозиготен по маркерному локусу.

Можливість ідентифікації мутантних генів батьків з урахуванням аналізу маркерних генотипів визначає информативность сім'ї стосовно даному маркерові. На Рис. 7.1 представлені можливі маркерні генотипи у цілком і годинутично інформативних, соціальній та неинформативных сім'ях щодо їх шляхом блот-гибридизации з ДНК-зондом. Аналогичные схеми може бути складено й у випадках, коли маркерні генотипи визначаються шляхом аналізу містять полиморфные локусы амплифицированных фрагментів ДНК. У информативных сім'ях маркерный генотип хвору дитину відрізняєся від маркерних генотипів обох батьків і здорової сибса, тому треба простежити успадкування мутантних генів за будь-якої вагітності. І тут подібність маркерних генотипів пробанда і плоду достатньо несприятливого прогноза, а носії мутації матимуть батьківський генотип. У частково інформативних сім'ях ідентифікується лише з мутантних генів, оскільки маркерный генотип хворого ребенка збігаються з генотипом однієї чи навіть обох родителей.

І тут попри подібність маркерних генотипів плоду і пробанда можливість майбутньої дитини становить 50%.

Всі діти з іншим маркерным генотипом будуть здорові, але зловина з них нести одне із мутантних алелів. Неинформативный маркер непридатний для ідентифікації мутантних генів, отже, й у проведення молекулярної диагностики у цій сім'ї. За відсутності повної информативности необхідно досліджувати інші зчеплені з геном полиморфные локусы і вибрати як маркерів такі, доторые від батьків пробанда перебувають у гетерозиготному состоянии. У частково інформативних сім'ях робити пренатальную діагностику такою ж ступенем достовірності, як й у повністю інформативних сім'ях, за одночасного использованием двох поліморфних локусів, кожен із яких маркирует різні мутантні гени обох батьків. Інформативними виявляються також сім'ї, де з мутантних авплекай може бути ідентифікований прямим аналізом соответствующего ділянки гена, а наявність іншого мутантного аллеля доводиться з допомогою маркерного локусу. Багатьом моногенних спадкових захворювань кількість идентифицированних высокополиморфных локусів, тісно зчеплених з контролирующим геном, цілком достатньо, щоб більш 90% сімей великий ризик виявилися повністю інформативними, отже, придатними щодо у яких пренатальної діагностики з использоваанием молекулярних методів тестування стану плода.

Отже, за відсутності можливості прямий ідентификации відповідних мутантних алелів, аналіз информативности сім'ї слід розпочинати з найбільш поліморфних маркерных локусів. бо за цьому вірогідніша можливість те, що батьки хвору дитину виявляться гетерозиготами по обраному маркерові. При наступному виборі маркерів важливо також ураховувати наявність з-поміж них неравновесности по сцеплению, оскільки найчастіше інформативність родин у відношенні маркерів, що у сильному нерівновазі по сцеплению, буде однакова. Справді, невипадковий характер цисі транс-расположения алелів в нерівноважних по сцеплению локусах зумовлює підвищену ймовірність таких подій, у яких гомозиготы однієї зі маркерів виявляються гомозиготными і з іншого. Це ж справедливе й в отношении гетерозигот. Тому, за аналізі інформативності сім'ї, насамперед, слід вибирати маркерні локусы, які перебувають між собою у рівновазі по сцеплению.

Треба враховувати, що існують певні аллели полиморфных сайтів, розташованих близько до мутації, посталої одноразово багато років тому і распросранившейся в популяції, залишатимуться на вельми тісному нерівновазі по сцеплению.

Прикладом може бути неравновесность між delF508 (ориентировочный вік виникнення 30−50 000 років) і шести членным тетрамерным повтором TAGG в интроне 6 гена муковисцидоза.

(Chebab et al., 1993; Агбанглы та інших., 1994). Тож у сімях великий ризик з великою ймовірністю, конкретне значення визначається детерминантом неравновесности по сцеплению, гомозиготы у цій маркерному аллелю, нададуться також гомозиготами і з мутації, тобто будуть больны.

Звісно, пренатальний діагноз може бути засновано лише в цій інформації, проте, її треба враховувати при выработке комплексного висновок щодо здоров’я майбутнього ребенка.

В усіх випадках під час використання непрямих методів молекулярной діагностики слід також пам’ятати, що маркерный генотип плоду визначає наявність мутантних генів з точностью до ймовірності кроссинговера між мутантным аллелем і маркерным локусом. Тому, чим ближче розташований маркер стосовно мутантному аллелю, тим менша вірогідність помилки під час проведення пренатальної діагностики. Щоб підлогуностью уникнути чи, по вкрай мері, різко знизити вероятность такий помилки, бажано використовувати внутригенные маркери чи проводити одночасне тестування ДНК плоду з допомогою двох маркерних локусів, що фланкують мутантний авлель. Останній підхід особливо виправданий під час роботи з дуже протяжними генами (наприклад геном дистрофіну довжиною около.

2,2 мільйонів пар підстав), де ймовірність внутригенного кроссинговера за деякими даними може становити 2−2,5%.

Розділ 7.5 Доімплантаційна діагностика, точність прогнозирования.

Слід сказати, що це загальний підхід до молекулярному тестуванню, слабко від форми нозології, оскільки для аналізу генів і мутантних алелів використовується сам і тих самих методів (див. Глава IV). За наявності хворий або в її батьків ідентифікованих мутацій або за нахождении інформативних для даної сім'ї ДНК-маркеров проведення пренатальної діагностики стає можливим про всяк стадії розвитку та незалежно від терміні беременности.

ДНК-диагностика на на початкових етапах розвитку людини, безумовно, має методичні особливості і тісно сопвиряджена з прийомами экстракорпорального запліднення та трансплантації зародків. Ця обставина дозволяють выделити їх у самостійне науково-практичне напрям — доимплантационную діагностику генних і хромосомних болезней.

(Verlinsky, Kuliev, 1993). Попри очевидні успіхи цієї області, досягнуті у ряді закордонних лабораторій (доимплантационная діагностика муковісцидозу, деяких X-сцепленних захворювань — міодистрофії Дюшенна, синдрому ламкою X.

— хромосоми, гемофілії), дане напрям досліджень продовжує перебувати лише на рівні наукових розробок та немає широкого застосування. Об'єктом ДНК-діагностики цих стадіях розвитку можуть бути полярні тільця овулировавших яйцекльоток й окремі бластомеры зародка, отримані методом микрургии (Рис. 7.2). Недоліком цього підходу порівняно невисокий відсоток (до 30%) приживаності оперированных зародків після їх штучної трансплантації в матку. Докладно з методами доимплатационной діагностики, її сучасним станом і перспективами можна ознайомитися у вже цитованої монографії (Verlinsky, Kuliev, 1993). Є певні підстави вважати, що у через відкликання швидким зростанням кількості центрів экстракорпорального запліднення в Рісці, помітним збільшенням ефективності його роботи, оцениваемій за кількістю наступивших вагітностей та пологів, методи доимплантационной діагностики спадкових хвороб будуть привлкать себе все велика кількість дослідників. Проте, практична значимість такий підхід у вигляді його високу вартість і недостатньою надійності порівняно довго залишатиметься проблематичною, по крайнього заходу, з нашого стране.

Узагальнений досвід різних молекулярних діагностичних центрів світу однозначно свідчить у тому, що оптимальною для пренатальной діагностики є перший триместр беременности.

(10−12- тижня), оскільки за несприятливому прогнозі беременность то, можливо перервана звичайним медичним абортом.

Найчастіше молекулярну діагностику проводять громадяни й у другому триместрі вагітності (зазвичай на 17−21 тижнях). Необхідні для аналізу зразки ДНК плоду виділяють з біоптатів хориона.

(плаценти), клітин амниотической рідини (амниоцитов) або з лімфоцитів пуповинної крові з відповідних інвазивних процедур — хорионбиопсия, плацентобиопсия, амниоцентез чи кордоцентез, які під контролем уль тразвука (Рис. 7.3). Докладніше про ці методах, їх преимуществах і недоліках можна почути у монографиях і оглядах (Рарр, 1992; Баранов, 1994; Баранов і др.,.

1994). Діагностика у 2-му триместрі вагітності нерідко показана для неинформативных родин у разі тих нозологій, пренатальна діагностика яких принципова можлива путим біохімічного тестування первинних порушень (напризаходів муковісцидоз) чи оцінки будь-яких інших проявів болезни у плода.

Основним джерелом ДНК для діагностики в постнатальном періоді є лімфоцити крові. Рідше цих цілей івобслуговують інших тканин й біологічні рідини, містять клітинні елементи (слина, кістки, сеча). Якщо сім'я частково інформативна (ідентифікується або доступний молекулярної маркуванню лише одне мутантний аллель), також рекомендується діагностика у 1-му триместрі вагітності, оскільки він позволяет відкинути діагноз у 50% всіх плодів при аутосомно-рецессивных захворюваннях, що доводиться відсутністю идентифицируемого мутантного аллеля. Інакше подальша тактика визначається з побажань жінок і возможностей для уточнення діагнозу більш пізніх термінах развития (II-й триместр вагітності). Так було в разі пренатальної діагностики муковісцидозу результати молекулярних исследований може бути доповнені біохімічним тестуванням ферментов амниотической рідини на 18- 20-ї тижнях беременности.

(Горбунова та інших., 1991; Baranov et al., 1992); у разі гемофилии, А — прямим серологическим дослідженням активності чинника Y11 згортання крові (Aseev et al., 1994); у разі міодистрофії Дюшенна — иммуноцитохимическим аналізом дистрофіна в биоптатах м’язів плоду (Hoffman et al., 1992) і т.д.

Слід проте підкреслити, сучасний рівень молекулярных знання природі гена, його мутаціях і полиморфизмах дозволяє в ідеалі проводити молекулярну діагностику наиболее частих моногенных захворювань, практично, переважають у всіх случаях. Можливості молекулярної діагностики у що дуже обмежені (Baranov, 1993 ;див. Глава X). З іншого боку, ситуація ускладнюється порівняно пізнім (часто, вже під час вагітності) зверненням сімей великий ризик на пренатальную діагностику, яка дозволяє провести молекулярные дослідження його інформативності у його обьеме. Пов’язано це, насамперед, з поганою інформованістю населення на роботу відповідних медико-генетичних служб.

З усіх існуючих способів пренатальної діагностики методи, засновані на аналізі ДНК, є точніми, оскільки вони виявляють первинні порушення у структурі геновий. Це насамперед належить до тих захворювань, диагностику яких здійснюється шляхом прямий ідентифікації мутантных алелів. Тим ні менш, навіть у такому разі окончательное висновок про духовне здоров’я майбутньої дитини хоч і приближается до абсолютного, проте носить імовірнісний характер. Основним джерелом помилок під час проведення пренатальної діагностики служить можлива контамінація матеріалу плоду, використовуваного щоб поставити діагнозу, іншими тканинами, насамперед, материнського походження. Тому відразу після взяття діагностичного матеріалу шляхом біопсії хориона, амниоцентеза чи кордоцентеза проводять ретельну оцінку з допомогою різноманітних лабораторних методов.

Відмінність молекулярних методів тестування від біохімічних чи будь-яких інших залежить від їх підвищеної чувствительности і виділення величезної роздільної здатності. Забруднення матеріалу особливо небезпечне у випадках, коли прогноз дається на основе аналізу амплифицированных фрагментів ДНК. Потрапили в тестируемые зразки клітини чужорідного походження можуть селлужить джерелом донорської ДНК для ПЛР і тоді то, можливо отримано який відповідає дійсності висновок у тому, що вона буде здоровий. Ризик подібних помилок то, можливо значно зменшений під час роботи в стерильних умовах і за постановці аналізів у кількох паралельних пробах.

Звісно, у кожному діагностичному центрі можливі лабораторные помилки суто технічного порядку, які залежать від івпользуемых методів тестування. Проте, достовірність прогнозирования, заснованого у прямому аналізі мутантних алелів плоду, зазвичай, перевищує 99%. З використанням непрямих методів молекулярної діагностики з’являється додатковий ризик помилки, пов’язані з можливістю рекомбінації між мутантным аллелем і маркерным локусом (особливо в великих обсягах гена, як, наприклад, у разі гена дистрофина).

Конкретне значення цієї ризику залежить від взаємної расположения що використовуються діагностики маркерів і соответствующих мутантних алелів. Зазвичай, для молекулярної діагностики використовують маркери, частота рекомбінації яких з мутантными аллелями гена вбирається у десятих, котрий іноді сотих долей процента.

Що стосується несприятливого прогнозу стосовно здоров’я майбутньої дитини постанову по перериванні чи продовженні беременности приймають батьки виходячи з наданого у тому розпорядження загального укладання. Після народження дитину чи переривання вагітності бажано проводити верифікацію діагнозу всіма при цьому методами, зокрема й ті, які було використано щоб поставити пренатального диагноза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Попри всю різноманітність тим, порушених у монографії, весь викладений у ній матеріал, по суті, стосується з трьох основних проблем: 4(1) 0генетическое картування і геном чоголовека, 4(2) 0молекулярная діагностика генних хвороб, 4(3) генокоррекция спадкових дефектів і генотерапія. У решенді кожної з названих проблем досягнуто серйозні успехи.

Нагадаємо некотрые з них.

Відомо, перший ген людини (ген кольорової сліпоты-дальтонизма) картирован на Х-хромосомі людини в.

1911 г. Перший аутосомный ген — лише у 1968 р. До 1973 усім хромосомах чоловіка було картировано всього 64 гена, а к.

1994 р. на генетичних картах вже локалізовано понад 60 000 маркерних ДНК послідовностей (переважно, фрагментов кДНК экспрессирующихся генов-EST см. Главу III.), а также.

4более 05 000 повнорозмірних структурних генів. Завдяки многочисленным полиморфным сайтах й головним чином, микросателлитным молекулярным маркерам, створено докладні (1,5−2 сантиморганные) генетичні картки кожної хромосоми чоголовека. Це й дозволило вийти з функціонального до позиционному картированию, т 4о 0е 4сть 0картированию нових генів непосередньо на фізичної карті ДНК цілого генома.

На думку авторитетних фахівців із генетичному картированию як-от Пітер Гудфеллоу, Поль Вайссенбах та інших 4угих, 0дальнейшее нарощування щільності молекулярних марцірів на хромосомах людини вже втрачає сенс, тим паче, у процесі идетификации нових і нових генів методом EST, нові полиморфные сайти однаково знайдено. Так само оптимістично справи і з секвенированием, т 4о 0е 4сть 0выяснением первинної нуклеотидної послідовності всієї двометрової молекули ДНК людини. Досить зауважити, що та початкова вартість секвенування однієї пари нуклеотидов оцінювався у 1 $, нині становить вже близько сорока центів і продовжує знижується. Причина цього — широка автоматизации монотонного процесу секвенування. Так, 10 роботов фірми Applied Biosystems за тиждень секвенируют более 30 000 000 п 4ар 0о 4снований. 0Дальнейшее вдосконалення технології секвенування 4, 0создани 4е 0принципиально нових підходів (метод «чипів «-Мирзабеков А.Д., Ed. Southern),.

4повышающих вдесятеро 0степен 4ь 0автоматизации цього процесса в высокоспециализированных центрах дозволяє надіяться, що секвенування всього геному людини буде завершено у два 006 року, а цілком можливо і до 2 000 году!

Проте, саме собою завершення гігантського за задумом і грандіозного щодо реалізації наукового проекту «Геном людини «зовсім на означає, що пізнання геному завершен.

Вже сьогодні стає зрозуміло, що немає якогось усередненого геному людини, кожен геном як й у чоголовек суто індивідуальний. Ця індивідуальність геному проне лише з рівні окремої особистості, а й у рівні етнічних груп, націй, окремих популяцій і рас.

(Cavalli-Sforsa, 1994). Геном людину, як система динамичная, дуже різноманітний. Аналіз цього разнообразия.

(diversity) — одне з найважливіших продовжень програми Геном людини. Ще актуальне з’ясування «функциональной карти геному ». Секвенування дозволить розшифрувати порядок всіх 3 4.5 0×10 4! 09 нуклеотидів. Але це лише начало. Визначити кордону генів, з’ясувати становище багатопро чисельні регуляторних елементів, їх интронно-экзонную структуру і, нарешті, функціональне призначення кожного из.

60 000 генів, призначення яких невідомо — ось следующая воістину глобальне завдання молекулярної генетики.

Не виключено, що саме цьому шляху розв’язати загадку «надлишкової ДНК », зрозуміти еволюцію (філогенез) геному чоловіки й, можливо, розшифрувати партитуру симфонії жизни.

— т 4о 0е 4сть 0последовательность включення і вимикання генів у ході онтогенеза.

На генетичні карти людини вже у 1994 р. нанесено.

933 гена, мутації яких призводять до різним наследственным захворювань, причому більш 400 їх проклонированы, т 4о 0е 4сть 0выделены в чистому вигляді й размножены поза оргаизма чоголовека у складі ДНК фагов, вірусів, дріжджів і бактерій. Багатьом з цих генів, особливо, пов’язаних із найчастішими, соціально значимими захворюваннями, докладно вивчені спектри мутацій, охарактеризовані аллельные полиморфизмы і розроблено схеми молекулярної діагностики. Причому, якщо в.

1993 р. таких захворювань було виплачено близько 130 (Bob Williamson), то 1994 — більш 600. По Суті, вже нині кожен наследственный недуга, ген якого картирован, доступний молекуярной діагностику прямими чи непрямими методами.

Крім моногенных хвороб, проблеми молекулярної диагностики що у значною мірою вже вирішено, все більше уваги сьогодні приділяють мультифакториальным заболеваниям. На порядку денному молекулярна діагностика схильнийности до таких широкораспространенным недугам як атеросклетроянд, ішемія серця, онкологічні 4, психіатричні 0заболевания, діабет і мн 4огое 0друг 4о 0е. З’ясування генетичної природы цих хвороб, як і досимптоматическая діагностика багатьох моногенных хвороб з пізньої маніфестацією, ставить перед дослідниками 4, 0 т 4о 0е 4сть 0молекулярными біологами і лікарями 4, 0проблему доцільності такий досимптоматической діагностики, права особистості на винятковість знання власному геномі, точніше про те мутаціях і генетичних предрасположенностях які закодовані у ньому ще до його пикдения. Для деяких захворювань 4(0муковисцидоз, фенилкетонурия) така рання діагностика, безумовно, доцільна, оскільки дозволяє розпочати лікування на початок захворювання. А тим нозологій, де реальної терапії ми маємо (хорея Гентингтона, інші недуги «експансії «, миодистрофия Дюшенна та інших.) доцільність таку діагностику і, конфиденциальность отриманої інформації широко обсуждаются.

Так, вже нині цілком реальне казати про «генетичному паспорті новонароджених », т 4о 0е 4сть 0о тому, що вони невдовзі після народження, із допомогою автоматизованої системи вдасться проанализировать всього спектра найчастіших мутацій дуже поширених захворювань як моногенной і мультифакториальной природи 4, в 0том однині і генів, мутації яких із високим ймовірністю можуть призвести до раку молочної залози, товстого кошечника, до атеросклерозу, діабету і мн 4огим 0другим ттяжелым недугам. Жити 4, 0н 4и 0 В чим себе не обмежуючи, засунув як страус голову в пісок, або, знаючи, що з вас мутація в гені глутатионтранферазы, отже, висока вероятность хвороб легких (особливо раку) утриматися від курціния? Що ще краще, добровільні обмеження і періодичні огляди чи стан щасливого невідання, що загрожує немінуемой катастрофою? А скільки мультифиакториальных заболеваний можна запобігти, знаючи слабких і сильні сторони своєго геному! Нині США провдятся масові опитування населення, завдання яких з’ясувати доцільність досимптоматической діагностики у сім'ях великий ризик, доступность.

(конфіденційність) цієї інформації членам сім'ї, нанімателей, страхових компаній, і ін. Інакше кажучи, практично оволодівши плодом Древа Пізнання — власним геномомчеловечество поставлено постала дилема як зробити так те щоб користь від цього виявилася багато вагомішими, ніж потенційну шкоду. Не випадково, сьогодні її вже на новому, молекулярному рівні спливають ідеї «поліпшення людської породи «Фрэнсиса.

Гальтона, щоправда, неимеющие нічого спільного із примітивного ївшигеникой минулого. Здобули реальність, і здавалися неможливіми у минулому ідеї патентування окремих генів та його фрагментів, потенційно особливо перспективних для молікулярной діагностику і біотехнологій. Попри протести керівників програми «Геном людини «Френсіса Коллинса,.

Томаса Каски і реставрацію широкої наукової громадськості патентноспособность геному людини, по крайнього заходу, його отдельных фрагментів, генів (наприклад, гена BRCA-1- мутації которого різко збільшують ймовірність раку молочної залози) получила одобрени 4е 0 законодавчих комітетів США.

Ще більше етичних і моральних питань породжує генотерапия. Проте, у цій області намітилася певна еволюція поглядів як фахівців, і широкої общественности. Від повної неприйнятність такий підхід в 70−80-х готак 4×0уходящего століття до визнання безпеки (за дотримання необхідних правил) генноинженерных маніпуляцій на соматических клітинах. Тим більше що, логіка підказує, що в міру того й усе більше соматичних мутацій вдасться виправити з допомогою генної терапиии, тим значительней методично їх внесок лише на рівні статевих клітин. Тим більше буде шанс те, що 4при.

4вступлении 0 В шлюб гомозигот по аутосомно-рецессивным заболеваниям 4(а ймовірність такого події зростатиме по.

4мере вдосконалення методів лікування генетических.

4болезней) 0, діти 4будут здорові, хоч і отримають від своих.

4родителей мутантні гени. Це стане особливо реальним в.

4связи з успішної розробкою методології доимплантационной.

4диагностики спадкових хвороб. Тому 0 В наукової литтяратуре дедалі більше звучить тема генокоррекции лише на рівні статевих клітин чи ранніх зародків людини. Сучасний методоческий рівень поки що Демшевського не дозволяє з абсолютної уверенностью здійснювати спрямований перенесення гена на клітини, і клітини дробящихся зародків. Наразі цього вдалося досягти лише у експериментах з ембріональними стовбуровими клітинами, причому на 1-му етапі що виник організм, в действительности, є мозаиком по запровадженого гену (див. Главу.

V 4I 0II). Природно, але це означає, що проблему гомологогичной рекомбінації нормального і мутантного гена лише на рівні статевих клітин та ранніх зародків принципово неразрешима.

Проте, треба ще чимало часу, можливо не одне десятиліття XXI-го століття, колись, чим зумовлена ця завдання буде успешале вирішена. Нині думку фахівців і громадського загалу — максимально унеможливити попаданія чужорідного генетичного матеріалу на клітини, про те, щоб уникнути непередбачуваних, а, швидше за все, дуже сумних, наслідків людства такого трансгеноза.

Ні, однако, сомнений у цьому, що, якщо кінець ХХ-го століття ознаменований розшифровуванням молекулярної структури геному чолостоліття, то століття XXI прославиться з’ясовуванням його функцій на уровне окремих генів, генних співтовариств, хромосом, також всього геному вцелом в контролюванні процесів онтоі филогенеза.

Молодим людям, які вступають в ХХI століття, необхідно знать,.

4на якому етапі 0находится наука 4о структурі та функціях 0геном 4а людини. Це важливо лише з суто утилітарних, мідіцинских позицій (хоч цей аспект дуже важливий), але й позицій загальнолюдських. Бо всяке епохальне відкриття науки (саме таким і є розшифрування геному человека) донедавна використовувалося лише у благо, а й на шкоду людству (4п 0ечальный приклад тому — відкриття розщеплення ядра урану, породившее атомну бомбу). Неразумные експерименти з геномом людини можуть призвести до ще более страшним наслідків. Уберегти генофонд людства, всіляко оберігаючи його від ризикованих втручань, і навіть витягти максимальну вигоду від вже отриманої безцінної інформацією плані діагностики, профілактики і лікування многих тисяч спадково обумовлених недуг — ось завдання, яку треба вирішувати вже нині 4и градусів якої ми прийдемо у новий XXI століття !

ГЛАВА IX.

ГЕННА ТЕРАПИЯ.

Розділ 9.1 Визначення, історична довідка, программи генної терапии.

У широкому значенні слова генна терапія означає лікування шляхом введення у кістковій тканині чи клітини пацієнта значеннєвих селледовательностей ДНК. Спочатку генна терапія рассматривалась як виправлення дефекту в гені. Считалось, основним обьектом на лікування служитимуть моногенные спадкові захворювання людини, причому теоретически представлялася імовірною корекція генного дефекту як у соматичному рівні, і лише на рівні зародкових (половых) клітин. Численні експерименти зі створення трансгенних тварин, розпочаті після 1980 р., і навіть на культурах клітин внесли суттєві корективи у ці теоретические уявлення. По-перше, значно простіше виправляти не сам дефект в гені, тобто заміняти весь мутантний ген або його мутированный фрагмент на нормальний, а вести корекцію шляхом введення у організм пацієнта полноценале працюючого гена (зазвичай його кДНК). По-друге, попри вирішальні успіхи генної інженерії останніх, исследования по геннной терапії в людини здійснюються виключительно на соматичних тканинах, яких у нормі відбувається експресія дефектного гена. Генна терапія лише на рівні статевих і зародкових клітин людини через можливих серйозних селледствий для генофонду людства видаються вельми проблематичною і цьому етапі наших знань — малореальіншої. І, насамкінець, по-третє, вже розроблена і застосовується практично методологія генної терапії виявилася придатної на лікування як моногенных спадкових захворювань, а й таких найпоширеніших хвороб, якими є злоякісні пухлини, багатьох видів важких вірусних инфекций, включаючи снід, серцево-судинні та інші заболевания.

Зважаючи на ці обставини, генну терапію на етапі можна з’ясувати, як лікування спадкових, онкологических, деяких інфекційних (вірусних) та інших заболеваний шляхом введення генів у клітини пацієнтів із метою направленного зміни генних дефектів, або надання клітинам алевых функцій (Culver, 1994). Перші клінічних досліджень методов генної терапії було здійснено 22 травня 1989 г. з єдиною метою генетичного маркірування опухоль-инфильтрующих лімфоцитів у разі прогресуючій меланоми. Маркіровані прокариотическим геном neo, Т-лімфоцити були стійкі до неомицину і були легко отселектированы у культурі, що дозволило детально простежити долю в кровотоці і виборче накопичення в пухлинах (детальніше див. 9.5).

Першим моногенным на захворювання, в отношении якого було застосовані методи генної терапії, надався спадковий иммуннодефицит, обумовлений мутацією в гені аденозин-дезаминазы. 14 вересня 1990 г. в Бетезде (США).

4-х літньої дівчинці, страждаючою цим досить рідкісним заболеванием (1: 100 000), були пересаджені її власні лимфоциты, попередньо трансформовані ex vivo геном ADA.

(ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лікувальний ефект зафіксований у протягом кількамісячної, після чого процедура була повторена з інтервалом 3−5 місяців (Anderson, 1992;

Culver, 1994). Протягом 3-х років терапії загалом проведено 23 внутрішньовенних трансфузії ADA-трансформированных.

Т-лифоцитов без видимих несприятливих ефектів. У результаті лікування стан пацієнтки (Ашанти У. ДеСильва) наслише поліпшилося, що вона вести нормальний спосіб життя не боятися випадкових інфекцій. Так само успішним виявилося і лікування другий пацієнтки з цим заболеванием.

(детальніше див. розділ 9.5). Нині клінічних досліджень генної терапії цього захворювання проводять у Італии, Франції, Великій Британії та Японии.

Інші моногенные спадкові захворювання, в отношенді яких є офіційно дозволені протоколи і розпочато клінічних досліджень, стосуються сімейної гиперхолестеринемии (1992); муковісцидозу (1993); гемофілії У (1992); хвороби Гоше (1993). Що стосується багатьох інших захворювань медичні протоколи клінічних випробувань перебувають у стадії затвердження (див. розділ 9.5.). До 1993 р. лише у США до клінічних випробувань генно-інженерних конструкцій на чолостолітті було зроблено 53 проекту (Culver, 1994). До 1995 р. в мире число таких проектів зросла до 100 і більше 400 пациентов було безпосередньо залучено у ці дослідження (Hodgson, 1995). Переважна більшість таких проектів (86) касалось лікування онкологічних захворювань, і навіть спида.

Отже, від дослідів на тварин і звинувачують теоретичних побудов 80-х вже у 1990 року вдалося розпочати реальному лікуванню моногенных захворювань, кількість яких стрімко наростає. Природно, що такі революционные зміни могли виникнути тільки внаслідок вирішальних успіхів молекулярної біології в картировании генів, мутації яких призводять до спадковим захворюванням (см. Главу.

III), з’ясуванні молекулярної природи цих мутацій (см. Главу.

IV), б у секвенировании і клонуванні генів (см. Главы.

I і II), створенні генно-інженерних конструкцій (см. Главу.

II), відпрацювання й постійного вдосконалювання методів їх доставки.

(см.ниже). Слід також відзначити, що якісний скачок у сфері генної терапії, коли сама ген став рассматриваться як лікарський препарат, стало можливим тому, що попередні експериментальні і клінічні дослідження довели безпеку генної терапии.

Разом про те, й у сьогоднішніх дослідженнях з генної терапії необхідно враховувати, що наслідки манипулирования генами чи рекомбінантними ДНК in vivo вивчені недостаточно. Слід пам’ятати, що у організм людини послідовностей ДНК, не які перебувають під контролем свойственных їм регуляторних елементів, може спричинить важко передбачуваним измененим метаболічних процесів і сопровождатись функціональним дисбалансом. Сучасні уявлення про структуру геному та її взаємодію з екзогенними ДНК і вірусними послідовностями, часто які у качестве векторів для перенесення генів (див. 9.2), можуть зробитися недостатніми для прогнозування можливих нежелательных чи неконтрольованих наслідків такого вмешательства.

Тому, за розробці програм генної терапії принципиальное значення мають питання безпеки запропонованих схем лікування як самого пацієнта, так популяції в целом.

(Anderson, 1992; Miller, 1992). Важливо, щоб за проведенні випробувань очікуваний лікувальний ефект чи можливість получения додаткової корисною інформації перевершували потенциальный ризик запропонованої процедури. Не випадково, країни з найбільш просунутим рівнем досліджень у цій області, особливо у США, медичні протоколів із використанням смысловых послідовностей ДНК піддаються обов’язкової експертизе у комітетах і комісіях. Клінічні випробування запропонованої генотерапевтической процедури возможны тільки після її схвалення відповідним законодавчо затвердженим органом. У такими є: Консультативный Комітет із Рекомбінантним ДНК (Recombinant DNA Advisory.

Committee — RAC), Комітет із ліків і харчовим продуктам.

(Food and Drug AdministrationFDA), з наступним обязательным твердженням проекту директором Національного Институтечки Здоров’я (National Institute of Health) (Miller, 1992;

Anderson, 1992; Culver, 1994). У Європі такі протоколи sosтавляются і затверджуються відповідно до рекомендаціями Європейской Робочої Групи по Переносу Генів і Генної Терапии.

(European Working Group on Human Gene Transfer and Therapy).

(Cohen-Haguenauer, 1995). Програми генної терапії для клінических випробувань мають включати такі розділи: обоснование вибору нозології щодо курсу генної терапіі; визначення типу клітин, які підлягають генетичної модификации; схему конструювання екзогенної ДНК; обгрунтування біологічну безпеку введеної генної конструкції, куди входять досліди на культурах клітин та на модельних (трансгенних) тварин; розробку процедури її перенесення у клітини пацієнта; методи аналізу експресії запроваджених генів; оцінку клінічного (терапевтичного) ефекту; можливі побічні наслідки і на методи їхнього попередження (Culver, 1993; Cohen-Haguenauer, 1995).

Найважливішим елементом у програмі генної терапії є аналіз наслідків проведених процедур. Цей контроль с. проводят всіх етапах терапії, причому дослідження виконують різних рівнях. Насамперед, після перенесення гена осуществляют пошук модифікованих клітин на організмі пацієнта і опікуються динамікою цих клітин на певних тканях.

Цей пошук то, можливо полегшений за наявності маркерного гена в конструкції. Присутність послідовностей екзогенної ДНК в модифікованих клітинах найчастіше ідентифікують з поміццю ПЛР. На наступний етап виробляють аналіз експресії запроваджених генів шляхом ідентифікації і кількісної оцінки відповідного РНК-транскрипта, або білкового продукту гена. Там, коли може бути, проводять аналіз корекції первинного біохімічного дефекту. Потім, усі клопоти злученные дані зіставляють з результатами комплексного медицинского обстеження вносять необхідні виправлення і додавання в проведену схему лечения.

Розділ 9.2. Типи генотерапевтических втручань, вибір клеток-мишеней.

Розглянемо найбільш загальні принципи, які у основі побудови програм генної терапії. Отже, генна терапія передбачає запровадження послідовностей ДНК в клетки-мишені. Її проводять або з єдиною метою корекції спадкової патологии, посталої внаслідок генетичного дефекту, або щоб надати цим клітинам нових функцій, сприяють вустпоранення патологічних процесів. У першому випадку, в организм хворого вводять нормально працюючий гомолог дефектного гена. Другий підхід застосовують під час лікування, таких заболеваний, як пухлини чи інфекції. У таких випадках вводять гени, які мають умовним цитотоксическим ефектом чи способствующие формуванню вираженого імунної системи. Мішенями для таких генів служать уражені тканини, імунні клітини, спеціфическим чином проникаючі у ці тканини, або предварительале трансформовані in vitro інші клітини. Отже, залежно від характеру захворювання і гаданого генотерапевтического підходу об'єктом генетичної трансфекції можуть бути найрізноманітніші соматичні клітини, як які мають дефектний ген, і нормальні клітини, які отримують терапевтические властивості після трансфекції. Залежно від способу запровадження екзогенних ДНК в геном пацієнта генна тірапия можна проводити або у культурі клітин (ex vivo), або у організмі (in vivo). Клітинна генна терапія чи терапія ex vivo передбачає виділення і куксивирование специфічних типів клітин пацієнта, введення у них чужорідних генів, відбір трансфецированных клітин та реинфузию їх до того ж пацієнтові (Рис. 9.1). Нині більшість допущених до клінічних випробувань програм генної терапії використовує саме такий підхід (Culver, 1994). Здійснення таких програм можливе лише великих спеціалізованих центрах, потребує великих матеріальных витрат і високих биотехнологий.

Генна терапія in vivo полягає в прямому запровадження клонированных й певним чином упакованих послідовникностей ДНК в специфічні тканини хворого. У цьому вводимые.

ДНК, зазвичай, інтегрують з молекулами, забезпечують їх адресну доставку в клетки-мишени (див. 9.3). Цей дуже перспективний підхід, расчитанный масову лікування дуже поширених захворювань, поки реально апробований тольдо на лікування муковісцидозу (Crystal et al., 1994). Особливийале перспективним на лікування генних хвороб in vivo предсталяется запровадження генів з допомогою аерозольних чи иньецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапія розробляється, зазвичай, на лікування пульмонологічних захворювань, як-от муковісцидоз, энфизема, рак легких, у яких об'єктами генетичної модифікації є специфічні типи легочных клітин (Hoffman, 1991). Иньецируемые вакцини можна використовувати для модифікації різних типів клітин та згодом, очевидно, стануть найпоширенішим і універсальним способом доставки чужорідного генетичного матеріалу і в будь-які ткани.

Ефективність курсу генної терапії значною степені залежить від правильного вибору типів соматичних клеструм, у яких повинна бать проведена генетична модификация. Приміром, під час лікування будь-якого спадкового захворювання, обумовленого дефектом секреторного білка, генетической корекції, у принципі, можуть бути піддані любые клітини, тоді як нерозчинних чи мембран-связанных білків вибір обмежений ті клітини, де экспрессируется відповідний ген (см. раздел 8.5). Розробці програми генної терапії передують ретельний аналіз тканеспецифической експресії відповідного гена, ідентифікація переклвичного біохімічного дефекту, дослідження структури, функції і внутрішньоклітинного розподілу його білкового продукта, і навіть біохімічний аналіз патологічного процесса. Всі ці дані беруться до складанні відповідающего медичного протоколу. З іншого боку, план генотерапевтических втручань визначається також доступністю клеток-мишеней, періодом їхнього життя і характером міграції в организме, ефективністю і специфічністю трансфекції клеструм, тривалістю експресії введеного гена.

Найперспективною надають можливість генітической модифікації не самих вже диференційованих клітин із спадковим дефектом, які попередників, тобто довго які живуть стовбурових ембріональних клітин. Зокрема, багатообіцяючої є трансформація тотипотентних ембріональних стовбурних клітин, які за створенні певних микроусловий можуть диференціюватися, практично, і в будь-які соматичні клітини організму (Hodgson, 1995). Варто згадати у зв’язку запропонований недавно ефективний метод отримання стовбурових ембріональних клітин гемопоэтического низки, перспективних для генотерапії спадкових захворювань крові (Berardi et al., 1995).

Зазвичай, визначення типу клітин, які підлягають генітической модифікації, завершується оцінкою результатів переноса гена у системі in vitro і проведення на тварин моделях у випадках, коли може бути. Апробацию процедури генокоррекции спадкового захворювання проводять на первинних культурах экспрессирующих клітин хворого або на перевиваемых культурах, отриманих після випередительной трансформації первинних культур. Цими клітинних моделях оцінюють ефективність обраної системи перенесення екзогенної ДНК, визначають експресію введеної генетичної конструкції, аналізують її взаємодію Космосу з геномом клеткі, відпрацьовують способи ідентифікації первинного дефекту та її корекції на біохімічному уровне.

Проте, багато проблем генної терапії неможливо знайти вирішені лише на рівні клітин. Важливе значення має тут аналіз влияния запроваджених ДНК-последовательностей на міжклітинні взаимодействия, що визначають роботу відповідних тканин та репетуванняганов. Такі дослідження можуть бути проведені лише in vivo. Приміром, у культурі клітин можна визначити количество синтезованого білка, необхідне нормалізації біохімічного дефекту, але цих даних замало відвета питанням, скільки клітин на організмі має бути модифіковано на відновлення порушеною функции.

Використовуючи культури клітин, можна розробити біохімічну систему адресної доставки рекомбінантних ДНК, проте, провєрка надійності роботи цією системою можна здійснити лише з рівні цілого організму. Показники тривалості й правничого характеру експресії введеного гена у культурі клітин можна використовувати лише як орієнтованих параметрів з метою оцінки необхідної періодичності повторення терапевтических процедур. З іншого боку, багато побічні ефекти й у першу чергу, можливі помилки у регуляції эспрессии чужерідного гена і небезпека вірусної контамінації у результаті застосування компетентного по реплікації вектора (см.ниже), можуть бути встановлені лише in vivo. Тому така увага у програмах із генної терапії приділяється експериментам in vivo на природничих чи штучно отриманих моделях соответствующих спадкових хвороб у тварин (см. Главу.

VIII). Успішна корекція генетичних дефектів таким животных і відсутність небажаних побічні ефекти генної терапії є передумовою до розв’язання клінических испытаний.

Розділ 9.3 Методи генетичної трансфекції у генній тірапии.

Вирішальним умовою успішної генотерапії є обеспечение ефективної доставки, тобто трансфекції (у сенсі) чи трансдукції (під час використання вірусних векторів) чужорідного гена в клетки-мишени, забезпечення длительіншої персистенції їх у цих клітках і створення умов повноцінної роботи, тобто експресії. Трансфекція можна проводити з допомогою (1) чистої («голою «-naked) ДНК, лигированной в відповідну плазміду, або (2) комплексированной ДНК — плазмидная ДНК комплексированная з солями, білками (трансферрином), органічними полімерами (DEAE — декстраном, полилизином, липосомами чи частинками золота), або (3) ДНК у складі вірусних частинок, попередньо чишенных спсобности до реплікації. Запорукою тривалої персистенции чужорідної ДНК в клетках-реципиентах є його убудовування в геном, тобто у ДНК клетки-хозяина. Пребывание екзогенної ДНК в ядрі у вільному стані (як, про, эписом) неминуче веде до її елімінації навіть у неделящихся клітках і, відповідно, до транзиторной экпрессии (зазвичай, протягом кількамісячної). Необходимій передумовою експресії чужорідної ДНК служить наявність відповідних промоторів, причому у в разі наявності тканеспецифических промоторів можна домогтися експресії введеного гена лише у певних тканинах і клітинах (см.ниже). Основные методи доставки чужорідних генів у клітини подразделяются на хімічні, фізичні й біологічні. Эффективность трансфекції і інтеграційна здатність трансдуцированній чужорідної ДНК що за різних засобах трансфекції в.

ДНК-клетки мішені наведені у Табл.9.1.

Таблиця 9.1. До основних рис генетичної трансфекции in vitro (Culver, 1994).

——————————T——————T——————-T——————.

¦ Методи ¦ Трансдукция¦ Иинтеграция ¦Експресія ¦

+—————————-+——————+——————-+——————+.

¦ Хімічні: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ Са-фосфат ¦ ¦ ¦ ¦

¦ преципитация ¦ низька ¦ низька ¦трнзиторная ¦

+—————————-+——————+——————-+——————+.

¦ Фізичні: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ Электропорация ¦ низька ¦ низька ¦транзиторная¦

¦ Микроинъекция ¦ висока ¦ низька ¦транзиторная¦

¦ «Бомбардування «¦ ¦ ¦ ¦

¦ частинками золота ¦ висока ¦ низька ¦транзиторная¦

+—————————-+——————+——————-+——————+.

¦Злиття: ¦ ¦ ¦ ¦

¦Липосомы ¦ низька ¦ низька ¦транзиторная¦

¦Рецептор-опосредо- ¦ ¦ ¦ ¦

¦ванний эндоцитоз: ¦ ¦ ¦ ¦

¦ДНК-белковый ¦ ¦ ¦ ¦

¦комплекс ¦ висока ¦ низька ¦транзиторная¦

¦ДНК-комплекс- ¦ ¦ ¦ ¦

¦вірусна капсида ¦ висока ¦ низька ¦транзиторная¦

+—————————-+——————+——————-+——————+.

¦Рекомбинантные ¦ ¦ ¦ ¦

¦віруси: ¦ ¦ ¦ ¦

¦Аденовірус ¦ висока ¦ низька ¦транзиторная¦

¦Адено-ассоцииро- ¦ ¦ ¦ ¦

¦ванний вірус (AAV) ¦ висока ¦ низька ¦тривала ?¦

¦Вірус герпесу (HSV)¦ низька ¦ низька ¦слабка ¦

¦Вірус иммуно- ¦ ¦ ¦ ¦

¦дефіциту (HIV) ¦ висока ¦ висока ¦тривала ?¦

¦Вірус мишачої лейці¦ ¦ ¦ ¦

¦мии Молони (MoMLV) ¦ висока ¦ висока ¦тривала ?¦

¦Вірус вітряної ¦ ¦ ¦ ¦

¦віспи (Vaccinia) ¦ висока ¦ низька ¦слабка ¦

L—————————-+——————+——————-+——————;

Відповідно до представлених даних, запровадження чужеродных генів in vitro може бути ефективно як із помощі деяких фізичних способів доставки (электропоации, бомбардування частинками золота), і, практично, попри всі варіантах біологічної доставки, особливо, з допомогою рекомбінантних вірусів. Проте, реально інтеграція в геном клетки-реципиента можна досягти лише тоді ретровирусных чи адено-ассоциированных векторів, які мають необхідні вбудови у эукариотическую ДНК властивостіми. У цьому відсутність вбудови у геномную ДНК, як правило, корелює з транзиторной (тимчасової) експресією гена. Отже, лише вірусні вектори чи генетичні конструкції, які включають вірусні послідовності здатні до активної трансфекції, а деяких випадках і до тривалої експрессии чужорідних генів. Варто нагадати у зв’язку, що зі ста вже схвалених проектів генотерапії 95 предполагают використовувати вірусну трансдукцию і 86 їх засновані на застосуванні ретровірусних векторов.

Попри зусилля багатьох генно-інженерних лабораторий,.

центрів, а останнім часом і фармацевтичних фірм, відсутствие ідеальних векторів, які мають ефективної (100%) трансфекцией як ex vivo і in vivo, разом із высодідька лисого пакующей здатністю (включення генетичної конструкции від 1 до 1 000 тисяч п.о.), інтегруючих в геном абоінтегруючих, але забезпечують тривалу і що особливо важливо, регульовану експресію, за відсутності небезпеки вінкогенных модифікацій чи інших небажаних побічних эффектов, продовжує залишатися однією з серйозних перешкод шляху внедерения генотерапії (Hodgson, 1995).

Розділ 9.4. Конструювання векторних систем і совершенствование методів трансформації клітин человека.

9.4.1. Основні векторні системы.

У Табл.9.1 наведено основні типи векторних систем.

Зупинимося докладніше на засобах їх конструювання, претамуществах і недоліках, деякі з них вже упоминалисій у минулому розділі. Зазвичай, запроваджувана генетическая конструкція є полноразмерную кДНК-овую послідовність певного гена, инсертированную в экспрессионный вектор, тобто котра під дією сильного промотора. Вибір промотора залежить багатьох параметрів, головною з яких є необхідний рівень експресії гена в клетках-мишенях. Вектор часто зітримає одне із маркерних генів, як-от гени neo, бета-Gal, ген люциферазы та інших., що їх у трансдуцированных клітинах то, можливо легко виявлено наявністю або відповідного білкового продукту (гистохимически для генів бета-Gal і люциферазы), або маркерних послідовникностей ДНК. Якщо ролі маркера обраний селектируемый ген.

(neo), відбір клітин, трансфецированных in vitro, може пропереводитися автоматично на соответвтвующих селективних средах. Існує дві типу конструкцій; одного основі плазмидной ДНК, інший — з урахуванням вірусів. Плазмидные конструкції зручні для клонування, генно-інженерних маніпуляцій і злучения великої кількості рекомбінантною ДНК. Проте, бактериальные плазмідами, на відміну вірусних конструкцій, неспроможні самостійно проникати у эукариотические клетки.

Для запровадження инсертированной в плазміду екзогенної ДНК у клітини людини слід змістити їх у підходящий вірусный вектор чи застосувати спосіб, який полегшує її проходження крізь клітинні мембраны.

9.4.2 Методи фізичного перенесення чужорідної ДНК у клітини эукариот.

До речі, що чужорідна ДНК може спонтанно проникати у клітини эукариот, наявністю на зовнішніх клітинних мембранах білків, специфічно що пов’язують ДНК.

Шляхом эндоцитоза (впячивания всередину клітинної мембрани) бажеродная ДНК потрапляє у цитоплазму у складі эндосом, де зазвичай швидко руйнується лизосомальными ферментами. Зовсім невелика частина екзогенної ДНК виходить із эндосом, потрапляє у ядро і, а то й руйнується ендогенними нуклеазами, то может бути інтегрована в ДНК клітини. Таке, проте, випадкуся нечасто. Відому виняток становлять лише м’язи, у яких завдяки низьку активність ендогенних нуклеаз і низької пролиферативной активності введена ДНК довго (до 1 року) може зберігатися і навіть экспрессироваться в миофибриллах (Hansen et al., 1991).

Ефективна доставка чужорідної ДНК у ядро клетки-мишени можна досягти шляхом микроинъекции.

(метод застосовуваний сьогодні лише заради створення трансгенних тварин шляхом введення екзогенної ДНК в пронуклеус заплідненої яйцеклітини — cм. Главу VIII); з допомогою электропорации (короткочасного впливу сильним электрическим полем); шляхом перфорації клітинних мембран золотими чи вольфрамовыми микрочастицами коньюгироваными з чужеродными ДНК і разогнанными до високу швидкість (метод бомбардировки). Ці методи доставки застосовні, переважно, для клітин, культивованих in vitro. Виняток становить лише метод бомбардування, який за наявності спеціального генного «рушниці «успішно застосовується й in vivo (Yang et al., 1990).

На підвищення ефективності перенесення зазвичай використовують системи доставки — сполуки чи групи сполук, взаимочинна влада з ДНК із заснуванням компактних структур, облегчающих проникнення ДНК у клітини і захищають його від действия нуклеаз (Власова та інших., 1994). Найпростіший системою доставки є система кальций-фосфатной копреципитации, широко застосовуваний для трансфекції клітин in vitro. Складніший і багатообіцяючий варіант трансфекції є рецептор-опосредованный транспорт, що передбачає створення досить складною, зазвичай трехкомпонентной конструкции: ДНК-поликатион + ліганд + вірус (Рис. 9.2). У качестве лигандов використовуються специфічні білки, такі як трансферин, еритропоетин, асиалоглюкопротеин, коньюгированный з альбуміном інсулін та інших, взаємодіющие з клітинними рецепторами і забезпечуючі фіксацію геніншої конструкції на специфічних клітинах, тобто адресну доставку чужорідної ДНК у клітини певного типу (напризаходів асиалоглюкопротеин — у клітини печінки, трансферин і еритропоетин — у клітини крові тощо). Лиганды ковалентно приєднуються до що зв’язують і компактизующим чужорідну ДНК катионным носіям (полилизину, DEAE-Dextran і др.).

Важливим компонентом системи є аденовірус чи его.

N-концевой фрагмент, виступають на ролі ефективних виженітьзогенных агентів, які забезпечують вихід екзогенної ДНК з ендосом після введення їх у цитоплазму клеток-мишеней. Адресаная доставка і ефективний захист від лизосомальных ферментів забезпечують високу трансфекционную здатність таких конструкций, їх безсумнівну перспективність для генної терапії in vivo (Hodgson, 1995).

Ми згадували про можливість поєднання векторного і фізико-хімічного підходу при конструюванні систем для перенесення генів у клітини людини. Один із таких систем основану на використанні филаментного фага fd для трансфекції епітеліальних клітин. Гени fd, які кодують білки оболонки фага, экспрессируются з його поверхні. Одного їх инсертируют послідовність, кодирующую поли-L-лизин. Полилизиновые залишки у складі злитого білка пов’язуються з плазмидной ДНК й утримують в поверхні фага. У другій ген оболонки фага инсертируют последовательость ДНК, кодирующую будь-якої агент, специфічно связывающийся з апикальной поверхнею епітеліальних клітин та интернализирующий (обеспечивающий проникнення) фага всередину клітини. Для цього він апробовані гени білків патогенних бактерій, поражающих кишковий епітелій — интерналин і инвазин, і навіть післядовательности ДНК, які кодують пептидные фрагменти вариабельного району моноклональних антитіл Ab11. Було показано, що у всіх три випадки досягається адресна доставка і інтернализация фага в клетки-мишени, тобто система успішно функционирует.

Спрямований перенесення генів в численні типи клітин, зіякі тримають трансферриновые рецептори, може бути здійснений при комплексировании ДНК з трансферрином. Використання у тому комплексі аденовірусного вектора существено полегшує проходження ДНК через эндосомы і потрапляння їх у ядро. Идеальными білковими лигандами для специфічних клітинних рецепторов можуть бути моноклональні антитіла чи його фрагменти, спрямовані проти тих елементів рецепторів, які перебувають зовнішньої поверхні клітинної мембрани. Подобная система розроблена для рецептор-опосредованного генного перенесення в епітеліальні клітини. Вона полягає в использованді противо-секреторных SCFab-фрагментов антитіл для полимірного иммуноглобулинового рецептора pIgR. Цей рецептор транспортує IgA і IgM в респіраторні епітеліальні клеткі, пов’язуючи імуноглобуліни і интернализируя їх шляхом ендоцитоза. Показано, що у системі in vitro частота трансфекції епітеліальних клітин під час використання SCFab-поли-L-лизин-ДНК комплексу така сама, як і за запровадження экзогенной.

ДНК у вигляді трансферринового рецептора. Аналогічні підходи можна буде застосувати запровадження генів й інші типи клеток.

9.4.3 Липосомный метод трансфекции.

Ефективний внутрішньоклітинний транспорт і захист від деградации лизосомальными ферментами досягаються при использовании як векторів липосом-липидных пухирців, обладають вираженими фузогенными властивостями — здатністю зливатися з клітинними мембранами. Особливо перспективні цьому плані липосомы, отримані з урахуванням катіонних чипидов, які забезпечують 100% зв’язування ДНК в конденсированные нуклеолипидные частки. Позитивний заряд лежить на поверхні таких пухирців забезпечує їх активне злиття з отрицательно зарядженими клітинної мембранами і пряме потрапляння чужорідної ДНК в цитоплазму, минаючи эндосомы і, соответственале, не піддаючись дії лизосомных гидролаз. Дуже еффективный перенесення високоочищених ДНК чи РНК-последовательностей в соматичні, особливо, в м’язові тканини може бути здійснений з допомогою препаратів липофектина чи липофектаміна (Caplen et al., 1994). Набагато більше висока частота трансфекції проти липосом-опосредованным перенесенням отримана в експериментах на культурах клітин при использованді ДНК-липидного комплексу з циклічним амфипатическим пептидом грамицидином S.

Особливо перспективними останнім часом представляються комплекси, у яких липосомы коньюгируют з мембранными антитілами до визначених белкам-мишеням (иммунолипосомы) або з белками-лигандами (див. вище). Ці конструкції обеспечивают ефективну адресну доставку чужорідної ДНК в клетки-мишени. Така схема була успішно апробована для переноса гена сироваткового альбуміну людини у гепатоцити лінійних пацюків Nagase зі спадковою дисальбуминемией. Доказано присутність і експресія введеного в такий спосіб гена людини у клітинах печінки пацюків. Аналогічні результати отримано в дослідах на лінійних кроликах Watanabe, дефектних по рецепторам липопротеинов низької густини — LDL. Ці животные моделюють одне з найбільш частих моногенных заболеваний людини — сімейну гиперхолесеринемию. При внутривеніншої иньекции кроликам ліпідного асиалогликопротеинового комплексу з плазмидной ДНК, несучою нормальний LDL-ген, уровень холестерину у крові тварин стійко понижался.

Важлива перевага рецептор-опосредованных систем з урахуванням ліпосом був частиною їхнього низька иммунореактивность. Вони позбавлені і багатьох інших недоліків, властивих вірусним векторным системам. Разом про те, досі не вирішена проблема низькою частоти трансформації клітин при липосомном переносе. Ця обставина істотно обмежує применение ліпосом у генній терапії (Crystal, 1995). Тим ні менш, нині рецептор-опосредованный варіант передачі генетичної інформацією клітини эукариот з допомогою як лигандов специфічних антитіл, рецепторних білків, і навіть вірусних послідовностей і ліпосом дозволяє лише у системі поєднати переваги фізико-хімічних методов перенесення ДНК і вірусних векторів і тому представляє одне з найбільш перспективних і швидко та розвитку направлений в трансфекції эукариотических клеток.

9.4.4 Рекомбинантные вирусы.

Конструювання векторів з урахуванням вірусів є найцікавіше та перспективний розділ генотерапіі. Еволюційно що склалася система забезпечення ефективного проникнення клетки-мишени, а разі ретровірусів і системи інтеграції в клітинний геном, дозволяє рассматривать віруси як природні вектори чужорідної ДНК для клеструм ссавців. Справді, лише за допомогою вірусних векторів поки що вдається досягти цього рівня трансфекції клеструм людини in vitro і in vivo, яке необхідне проявища лікувального ефекту. Це доводять численні експерименти на тварин і звинувачують перші клінічних досліджень утвержденных програм генотерапії (див. 9.2). Разом про те, не можна недооцінювати і геть реальну загрозу патологических процесів, що з використанням вірусних годинутиц. Як векторів застосовують такі рекомбинантные віруси: ретровіруси, аденовіруси, аденоассоциированные вирусы, вірус герпесу, вірус сніда (HIV), вірус вітряної віспи та інших (Anderson, 1992; Culver, 1994; Lowenstein,.

1994; Hodgson, 1995; Kay, Woo, 1992). З огляду на велику практическую значимість цих векторів, розглянемо їх понад підробно.

_Ретровирусные вектори.. Генні конструкції з урахуванням ретровірусів (РНК-содержащих вірусів) особливо рясно используются для трансдукції ДНК ex vivo. Найпопулярніший ретровирусный вектор — вірус мишачого лейкозу Molony (MoMLV).

У порівняні з іншими типами векторів ретровіруси володіють унікальною здатністю ефективно переносити чужорідні гены і стабільно інтегрувати в геном делящихся соматических клітин. Для безпеки ретровирусные последовательности модифікують в такий спосіб, що у инфецированных ними клітинах вірусні білки не виробляються. Це досягається з допомогою видалення чи інактивації всіх які кодують послідовникностей вірусу. Реплікація вірусних векторів може происходить лише у спеціальних «пакующих «клітинах, в геном которых вмонтовані все гени, що виробляють вірусні білки. При введении ретровірусних векторів у ці клітини утворюються вирионы, які мають векторну РНК та найздібніші лише проникати у клетки-мишени, але з розмножуватися у яких. Недоліком цієї системи, як і інших векторних систем з урахуванням вірусів, є можливість контамінації що виконує клітинної чинді нормальним ретровирусом й отримання цій основі комупетентного по реплікації вектора. Щоб запобігти цього потрібні регулярне тестування «пакующей «лінії клеток.

Можлива контамінація ретровирусного вектора клеточными РНК, окремі можуть назад транскрибуватися і вбудовуватися в геном трансдуцированных клітин. Последстия такого події можуть бути встановлені в експериментах на живітных моделях. Іншими на серйозні недоліки ретровірусних векторів є: (1) спроможність переносити генетическиїв матеріал лише у пролифирирующие клітини; (2) спосібность індукувати мутації при випадкової інтеграції в геном;

(3) можливість спонтанної активації онкогена; (4) невеликі розміри стерпної ДНК-вставки — до 8 тисяч п.о.; (5) сравнительно низький титр -10!6−10!7/мл рекомбінантних вірусних частинок, одержуваних для трансдукції; (6) необхідність конструирования відповідних «пакующих «клонів клеток.

_Аденовірусні вектори.. На відміну від ретровірусів аденовіруси активно инфецируют неделящиеся клітини, мають більши потенційної пакующей здатністю (ДНК-вставка> 8 кб), мають високий титр — 10!11/ мл, проте, не забезпечують убудовування чужорідної ДНК в геном трансформованої клетки.

(Hodgson, 1955). Використання їх перспективне для генокоррекции клітин верхніх дихальних шляхів, легень і інших репетуванняганов — мозку, печінки, м’язів, шкіри ін. Вони ефективні при доставці аерозольним способом, було використано у переклвых клінічні випробування по генотерапії муковисцидоза.

(Crystal et al., 1994). У аденовірусні вектори також инсертируют маркерні гени — neo, CAT чи бета-галактозидазный ген (бета-Gal) у тому, щоб ідентифікувати трансдуцированні клітини. Для конструювання векторів використовують дефектные по реплікації аденовіруси, які отримують шляхом вирізання з вірусної ДНК генів, кодируюших білки (E1a,.

E1b) — звані аденовірусні вектори 2-го покоління. Нині створюються аденовірусні вектори 3-го поколения, у яких крім генів Е1а і Е1b видаляють і регуляторний ген Е4. Така конструкція може підтримуватися лише у присутствии клеток-хелперов (наприклад, у культурі клітин нирок людини). Видалення більшої кількості аденовирусных генів з векторів часто супроводжується їх дестабілізацією. Це з головних недоліків аденовирусных векторів, позаяк у ряде випадків залишаються гени, трансдуцированные в клетки-мишені, сприяють формуванню імунної системи. Саме выраженный імунна відповідь при повторних введениях аденовірусного вектора з инсерцией гена CFTR, виявився найсерйознішим на заваді успішної генотерапії муковісцидозу (Crystal et al., 1994). Деякі аденовірусні білки здатні оказывать цитотоксический ефект на високоспеціалізовані клітини людини. Схема підтримки аденовирусных векторів подібна до тієї, яку використовують виробництва ретровирусных векторів. Велика небезпека їх контамінації хелперным реплицирующимся вірусом. З іншого боку, аденовіруси рідко інтегрируются в геномную ДНК і тому експресія які ними генів, зазвичай, носить тимчасовий характер

(Табл. 9.1). Здатність инфецировать, практично, будь-які клітини як in vivo, і in vitro робить особливо актуальіншої адресну доставку таких конструкцій та введення у тому состав тканеспецифических промотров. Наприклад, промотор гена альфа-фетопротеина за необхідності експресії гена в клетках печінки, або промотори генів сурфактантных білків У і З для експресії чужорідних генів у клітинах легких.

_Аденоассоциированные віруси. мають значно меньши пакующей здатністю (майже п’ять кб). Проте, на відміну раніше розглянутих вірусів що немає онкогенной активностью, не патогенны, здатні інтегруватися у геном, де перебувають у латентному стані. Унікальною особливістю AAV був частиною їхнього спроможність до стабільної невипадковою інтеграції одного з районів хромосоми 19. Специфічність інтеграції вірусява визначається наявністю у його геномі гена rep. Близько родинні AAV, звані, парвовирусы (H1, MVM, Lu;

III), мають ще меншою пакующей здатністю — близько двох кб не мають специфічного вбудовування, проте, вони також розглядаються як потенційно перспективні векторы.

_Вірус простого герпесу (HSV).. Великий (152 кб) ДНК-сотримає вірус, при трансформації не интегируется в геном, формуючи в ядрах эписомные структури. Унікальна особенность.

HSV є його виражена тропність клітинам нервової сістеми. Звідси його перспективність як векторної системи на лікування пухлин мозку, хвороби Паркінсона й багатьох других.

Його відоме перевагу — досить велика пакующая здатність (>30кб). Важливим етапом у створенні вектора на основе HSV є видалення з його геному області ICP22, відветственной за синтез литических білків, і індукція мутации.

1814, викликає блок транскрипції вірусної ДНК. Останнім часом з урахуванням HSV почали отримувати штучні похідні вірусу, так назывемые ампликон-продукты, позбавлені, практически, всіх генів HSV, проте спроможні до реплікації .

Конструкції векторів, що використовуються перенесення экзогенних ДНК у клітини людини, постійно вдосконалюються залежно від типу клеток-мишеней. Так, новим типом векторів, сконструйованих з урахуванням псевдо-аденовирусов, поєднує у собі всі переваги аденовирусных векторів, та заодно власні вірусні гени, мало надають никакого повреждающего ефекту на трансфецированные клетки-мишені, оскільки містять обмаль регуляторних елементів і послідовностей, відповідальних за упаковку і репликацию аденовируса. З іншого боку, псевдо-аденовирусные вектори з вуспехом переносять чужорідні послідовності ДНК як і делящиеся, і у спочиваючі клітини. Вивчаються також перспективы спрямування генної терапії інших вірусних сістим, як-от SV40, вірусу імунодефіциту (HIV), вірус ветряной віспи і ще. Зокрема, заслуговують внимания эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципієнта) векторы, отримані з урахуванням дуже великого вірусу Эпштейн-Барра, здатного нести вставку розміром від 60 до 330 кб (Sun et al., 1994).

9.4.5 Перспективи створення «ідеальних «векторних систем.

Огляд існуючих даних дозволяє прийти до заключению, що, попри зусилля багатьох лабораторій світу, вже всі відомі й випробувані in vivo і in vitro векторні сістеми далекі від ідеалу (Hodgson, 1995). Якщо проблему доставки чуужеродной ДНК in vitro практично вирішена, та її доставка в клетки-мишени різних тканин in vivo успішно решается (переважно, з допомогою комбінованих рецептор-опосредованных конструкцій), то інші характеристики існуючих векторної системи — стабільність інтеграції, регульована експресія, безпеку — досі потребують серйозних доробок. Насамперед, це теж стосується стабильности експресії. Остання можна досягти або за інтеграции чужорідної ДНК у геном реципієнта, або шляхом забезпечення тривалої персистенції экзогенной.

ДНК в ядрі. До нашого часу інтеграція в геном достигалась лише за використанні ретровірусних або адено-ассоциированных векторів (Табл. 9.1). Випадкова інтеграція трансфектной ДНК в геном відбувається нечасто, причому у разі ретровірусних векторів це відбувається в делящихся клітинах. Підвищити ефективність стабільної интеграции можна шляхом удосконалювання генних конструкцій типу рецептор-опосредованных систем (Рис. 9.2). Проте, ці століттяуторовані конструкції мають включати тільки п’яту частину вірусних геновий, наприклад, гени оборотної транскриптази, ретровирусной интегразы, деякі транспазоновые гени, парвовирусные rep-гены (див. 9.4.4). З огляду на можливий мутагенний ефект випадкової інтеграції, дуже перспективною є створення досить стабільних эписомных векторів. У частийности, останнім часом особливу увагу приділяють створенню векторів з урахуванням штучних хромосом ссавців (Mammalian Artificial Chromosomes), які б достататочале автономно перебувати у ядрі, зберігаючи спроможність до ріпликации і джазової експресії. Зручними моделями при цьому поставшиляются автономно реплицирующиеся циркулярні микрохромосомы ракових клітин (Hodgson, 1995).

Особливо привабливою у плані генної корекції надають можливість заміни всього мутантного гена або його мутировавшей частини (наприклад, одного экзона) на нормальный аналог, може бути досягнуто шляхом гомологичной рекомбінації. Причому у ідеалі очікується як длительную персистенцию введеного гена, а й збереження нірмальной експресії. Для цього він в конструкції, використовувані для перенесення ДНК, включають агенти, що б частоту гомологічного спарювання, наприклад, бактеріальну рекомбиназу. Показано, що у умовах частота гомологичной рекомбінації може перевищувати 2.5*10−4. Це достатньо того, щоб за допомогою ПЛР відібрати потрібні клони клітин. Для спрямованого запровадження фрагментів гена у суворо певні локусы геному недавно розроблено систему подвійний заміни, джерело якої в використанні HPRT-зависимых ембріональних стовбурних клітин та векторної конструкції що містить ген HPRT.

(гипоксантин-фосфорибзилтрансферазы) і ген тимидин-киназы вірусу герпесу (HSV). Подвійна селекція трансформантов позволяет відібрати клітини, у яких відбулася гомологичная рекомбінація. Такий їхній підхід знайшов широке застосування при созданді штучних моделей спадкових хвороб у человека.

(див. детальніше Главу VIII). Проте, у клінічній практиці вона используется.

Розділ 9.5 Генотерапія моногенных спадкових заболеваний.

Питання генотерапії спадкових захворювань докладно розглянуті у численних оглядах (Ledley, 1987; Anderson, 1992; Pyeritz, 1993; Breakefield, 1993; Lowenstein,.

1994; Kay, Woo, 1994; Brown et al., 1994; Дризе, 1994; Crystal, 1995) і повно підсумовані в недавно опубликованою монографії (Culver, 1994).

Вже за року, після першого запровадження маркерного гена у організм людини була спрямована проведена успішна клітинна соматическая генотерапія спадкового захворювання, обумовленийного дефіцитом аденозиндезаминазы (ADA) (див. 9.1). У цьому захворюванні у крові пацієнтів накопичується у надто високій кінцентрации 2 «-дезоксиаденозин, який надає токсичне действие на Tі Bлімфоцити, у результаті в хворих развивается серйозний комбінований імунодефіцит. Для підутримання життя пацієнтів проводять переодические гетерологичные трансплантації клітин кісткового мозку, проте, тільки до третини хворих може бути підібрані сумісні донори. Ензим-замещающая терапія також призводить до помітному поліпшенню стану пацієнтів, але, зазвичай, успіх цей носить временный характер. План генної терапії, розроблений сотрудниками Національного Інституту Здоров’я США (NIH) і схваленийный RAC, був у призначенні хворим аутологичных лимфоцитов, трансдуцированных нормальним ADA-геном. Здійснення цього плану зажадало виконання таких процедур: зляции клітин з крові пацієнта; активації і иммуностимуляции зростання T-лимфоцитов у культурі; трансдукції їх ретровирусным вектором, несучим нормальний ADA-ген і маркерный ген neo; відбору трансдуцированных клітин на селективною середовищі; внутривенной реинфузии модифікованих T-лимфоцитов пациенту.

Першої пацієнткою, котру піддали цієї терапії, була 4-х роківняя дівчинка (см. раздел 9.1). Протягом 10.5 місяців їй зроблено 8 аутологичных вливань трансдуцированных.

T-лимфоцитов і після піврічного перерви програму реинфузий повторювали кожні 3−5 місяців. Вже після першого циклу число T-лимфоцитов внормувалось, концентрація ADA в циркулирующих клітинах крові зросла з 1% до 20 — 25% нірмального рівня життя та різко поліпшилися основні імунні характеристики. Всупереч багатьом прогнозам, протягом більш, ніж 6 місяців після припинення масованих надходжень у кроветоке пацієнтки стійко зберігалося високий показник корівректированных T-клеток, що дозволило подальшому знизити кількість впроваджуються клітин та приймати значно більшу промежуткі між тими процедурами. Через місяці після перших клінічних випробувань започаткував програму генної терапии.

ADA-дефицита в іншої 9-річної пацієнтки. Після 11 инфузий трансдуцированных аутологичных T-клеток стан цієї девочки також помітна кращий і відзначалася повна нормальнийзация відповідних біохімічних і імунологічних покизателей. Отже, потрібен ще раз відзначити, що з лікуванні обох пацієнток було досягнуто очевидний клінічний ефект (Anderson, 1992; Culver, 1994).

Проте, в обох випадках в повному обсязі імунні функції восстанавливались повністю. Очевидно, це було пов’язано про те, що корекція генетичного дефекту проводилася в зрелых.

T-лимфоцитах. У зв’язку з цим запропоновані програми генної тірапии з допомогою реинфузии змішаної популяції трансдуцированних T-лимфоцитов і перефирических стовбурових ембріональних клітин крови.

Можливість ізоляції і трансдукції таких тотипатентных стволовых клітин показано експериментах на приматах.

Успіх перших клінічних випробувань з’явився потужним стимубрухт з метою прискорення розвитку нових генотерапевтических методів стосовно іншим спадкових захворювань. В.

Табл. 92 представлений список хвороб, котрим принципиально може бути генотерапевтический підхід і генокоррекция спадкового дефекту запросто буде осуществлена вже у найближчому майбутньому, або ті захворювання, котрим вже є официальныо затверджені протоколи і які знаходяться різних стадіях клінічних испытаний.

Таблиця 9.2. Спадкові захворювання, генокоррекция которых перебуває в стадії клінічних випробувань (КП), экспериментальних розробок (ЕР) і можлива (ПВ).

(Сulver, 1994; Lowenstein, 1994).

—-T————————T———————————-T————————T——.

¦ ¦Хвороба ¦ Дефектний ген ¦ Клетки-мишени ¦Ста- ¦

¦ ¦ ¦ ¦ ¦дія ¦

+—+————————+———————————-+————————+—— +.

¦1 ¦Імунодефіцит ¦аденозиндезаминаза ¦лімфоцити ¦ КП ¦

¦2 ¦Імунодефіцит ¦пуриннуклеозид- ¦лімфоцити ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦фосфорилаза ¦ ¦ ¦

¦3 ¦Сімейна гіпер- ¦рецептор липопротеинов ¦гепатоцити ¦ КП ¦

¦ ¦холистеринемия ¦низької густини ¦ ¦ ¦

¦4 ¦Гемофілія У ¦чинник 1Х ¦фибробласты ¦ КП ¦

¦5 ¦Гемофілія, А ¦чинник Y111 ¦миобласты, ¦ ЕР ¦

¦ ¦ ¦ ¦фибробласты ¦ ¦

¦6 ¦Хвороба Гоше ¦в-глюкоцереброзидаза ¦макрофаги, ¦ КП ¦

¦ ¦(сфинголипидоз) ¦ ¦власні стовбурні клітини¦ ¦

¦7 ¦Хвороба Хантера ¦идуронат-сульфатаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦ ¦власні стовбурні клітини¦ ¦

¦8 ¦Синдром Гурлера ¦L-идуронидаза ¦макрофаги, ¦ ПВ ¦

¦ ¦ ¦ ¦власні стовбурні клітини¦ ¦

¦9 ¦Емфізема легких ¦альфа-1-антитрипсин ¦лімфоцити ¦ ЕР ¦

¦10¦Муковисцидоз ¦CF-трансмембранный ¦епітелій бронхів¦ КП ¦

¦ ¦ ¦регулятор ¦ ¦ ¦

¦11¦Фенилкетонурия ¦фенилаланингидроксилаза¦гепатоциты ¦ ЕР ¦

¦12¦Гипераммонемия ¦орнитинтранскарбамилаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦

¦13¦Цитрулинемия ¦аргиносукцинатсинтетаза¦гепатоциты ¦ ПВ ¦

¦14¦Мышечная дист- ¦дистрофин ¦миобласты, ¦ ЕР ¦

¦ ¦рофия Дюшенна ¦ ¦миофибриллы ¦ ¦

¦15¦Талассемия ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЕР ¦

¦16¦Серповиднокле- ¦бета-глобин ¦эритробласты ¦ ЕР ¦

¦ ¦точна анемія ¦ ¦ ¦ ¦

¦17¦Респираторный ¦сурфактант ¦епітелій бронхів¦ ЕР ¦

¦ ¦дистресс-синдром¦белок У ¦ ¦ ¦

¦18¦Хронический ¦NADPH-оксидаза ¦гранулоциты ¦ ЕР ¦

¦ ¦грануломатоз ¦ ¦ ¦ ¦

¦19¦Болезнь ¦белок-предшественник ¦нервові клітини ¦ ЕР ¦

¦ ¦Альцгеймера ¦в-амилоида (ААР) ¦ ¦ ¦

¦20¦Болезнь ¦тирозин-гидроксилаза ¦миобласты, ¦ ЕР ¦

¦ ¦Паркінсона ¦ ¦фибробласты ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦нервові клітини ¦ ¦

¦21¦Метахромати- ¦арилсульфатаза, А ¦власні стовбурні клітини¦ ПВ ¦

¦ ¦ческая лейко- ¦ ¦крові, ¦ ¦

¦ ¦дистрофія ¦ ¦нервові клітини ¦ ¦

¦22¦Синдром Леш- ¦гипоксантин-фосфо- ¦нервові клітини ¦ ПВ ¦

¦ ¦Нихана ¦рибозил трансфераза ¦ ¦ ¦

L—+————————+———————————-+————————+—— ;

Як випливає даних Таблиці 9.2, на стадії клінічних випробувань 1994 р. вже перебували 5 моногенных заболеваний.

Для 10 генних хвороб проводилися експериментальні исследования й опрацьовувалися вимоги, необхідних получения офіційного дозволу клінічних випробувань (см. 9.1).

Дослідження з іншим захворювань перебувають у начальных етапах. Список таких захворювань нас дуже швидко увеличивается. Привертає увагу, перші програми з генної терапії пов’язані з модифікацією гемопоетичних клеток.

(Wivel, Walters, 1993). Клітини крові найбільш доступні для генетичних маніпуляцій. Після ізоляції різні типи клеструм крові може бути легко размножены, піддані трансфекции in vitro, та був повернуті пацієнтові. Генетичною модификации можуть бути піддані як зрілі клетки.

(лімфоцити, макрофаги), а й їхні попередники — власні стовбурні клітини. Важливим обставиною, у зв’язку, і те, що процедуру трансплантації клітин кісткового мозку вже широдо використовують у клініці. Розроблені та досить эффективные методи виділення стовбурних гемопоетичних клітин чоголовека (Berardi etal., 1995). У експериментах на тварин показано, що модифіковані клітини як миелоидного, і лимфоидного рядів можуть зберігатися в кровотоці на протяженді на два роки після аутологічної пересадки клітин костного мозку, трансдуцированных in vitro. Шляхом трансфекції клітин крові відповідними генами можна лікувати як власне захворювання крові, а й використовувати їх задля лечения багатьох інших захворювань як моногенной природы.

(Табл. 9.2), і різних пухлин і інфекцій (см.ниже).

Іншими досить універсальними реципієнтами чужеродных генів може бути фибробласты і м’язові клітини (миобласти, миофибриллы). Вони можна використовувати тим заболеваний, де необхідна корекція генів, білкові продукти яких мають вступати у сироватку крові чи дифундировать в сусідні клітини. Особливо зручні з метою генної терапії кісткові м’язи, у яких завдяки відсутності эндонуклеазіншої активності (см. раздел 9.4.2) принципово може бути перенос генів in vivo шляхом прямий иньекции екзогенної ДНК.

Инъецированная в м’язи ДНК здатна экспрессироваться в міофибриллах перебувають у неинтегрированном, эксрахромосомном стані. Білкові продукти експресії протягом довгого часу після трансдукції надходитимуть кров. Продолжительность експресії значно збільшується, якщо генетичну модифікацію роблять у аутологичных миобластах, що цього инъецируют в зрілу м’яз. Ці особенности вже дозволили розпочати експерименти із генної терапії таких захворювань як гемофілії Проте й У, дефіцит антитрипсина, діабет, вроджений дефіцит гормону зростання й навіть хвороба Паракинсона (Culver, 1994; Lowenstein, 1994). Досить зручніми для генетичних модифікацій виявилися і фибробласты дожи, насамперед, завдяки легкості генноинженерных малонипуляций ex vivo.

Розділ 9.6. Генотерапія ненаследственных захворювань: пухлини, инфекции.

Паралельно зі розвитком досліджень у сфері генокоррекции спадкових дефектів успішними також попозови методів терапевтичного використання значеннєвих післядовательностей ДНК на лікування ненаследственных захворювань, і, главвным чином, злоякісних пухлин і вірусних інфекций. Істотно, що у цих розділах патології пошуки шляхів генокоррекции проводяться з особливою інтенсивністю, а число вже схвалених протоколів клінічних випробувань в багато разів перевищує таких на лікування моногенных болезней (см. Рис. 9.1). Такий стан справ, очевидно, насамперед пояснюються широкої поширеністю онкологических захворювань, і відсутністю досить ефективним терапії. У Табл. 9.3 перераховані основні методологічні підходи до генотерапії різних пухлин, розроблені і дуже використовувані вже в етапі. Чимало з цих підходів цілком застосовні й у боротьби з найсерйознішими на інфекційні захворювання, наприклад, зі спидом.

Таблиця 9.3. Основні методологічні підходи до генокоррекции онкологічних заболеваний.

————————————————-T——————————————;

¦ П Р І М Ц І П ¦ ЗАПРОВАДЖУВАНІ ГЕНИ ¦

+————————————————+——————————————-+.

¦1. Підвищення иммунореактивности ¦ гени чужорідних ¦

¦ пухлини ¦ антигенів, цитокінів ¦

¦2. Генетична модифікація ¦ гени цитокінів, ¦

¦ імунних клітин ¦ ко-стимуляторов ¦

¦3. Инсерция генів «чувствитель- ¦ гени тимидин-киназы HSV, ¦

¦ ности «або генів «самогубців «¦ цитозин дезаминазы ¦

¦4. Блок експресії онкогенів ¦ антисмысловые Ki-ras мРНК, ¦

¦ ¦ гени внутрішньоклітинних антител¦

¦5. Инсерция генов-супрессоров ¦ р53 ¦

¦ пухлин ¦ ¦

¦6. Захист нормальних клітин від ¦ гени лікарської ¦

¦ химеотерапии. ¦ стійкості тип 1. ¦

¦7. Індукція синтезу противоопухо¦ гени интерлейкина-2, ¦

¦ лівих в-в нормальними клітинам¦ інтерферону ¦

¦8. Продукція противопухолевых ¦ вакцини типу БЦЖ, экспресси-¦

¦ рекомбінантних вакцин. ¦ рующей пухлинної антиген ¦

¦9. Локальна радиопротекция нір-¦ гени трансферазы, ¦

¦ мальных тканин з допомогою ¦ глутатион синтетазы ¦

¦ антиоксидантів. ¦ ¦

L————————————————+——————————————-;

Докладний аналіз використовуваних у своїй підходів і результаты перших клінічних випробувань за межі нашего викладу. Проте, матеріал цей настільки цікавий і багатообіцяючий, що дозволимо собі на прикладах охарактеризувати основні засади побудови таких генотерапевтических программ.

Як згадувалося раніше (див. 9.1), перенесення гена в организм людини здійснено 1989 року у більшою мірою у дослідницьких, а чи не в терапевтичних цілях. То справді був маркерный прокариотический ген neo, який повідомляє клітинам вустойчивость до неомицину. Він запроваджено пацієнтові, страждаючому злоякісної меланомою, у складі трансдуцированных.

TIL-клеток (Тлімфоцитів, отриманих з пухлинних тканин хворого). У 1986 р. невдовзі після ідентифікації цієї нової класу імунних клітин, була спроба лікування меланомы шляхом аутологічної внутривенной инфузии TIL-клеток, попередньо виділених з пухлин пацієнтів і інтенсивно наращиваемых in vitro у присутності ростового чинника IL-2.

Приблизно в третини пацієнтів лікування виявилося ефективним, хоча у наступному спостерігали дуже багато рецидивів захворювання. Для аналізу причин терапевтичного ефекту TIL.

— клітин та вдосконалення методики лікування меланоми необходимо було досліджувати стійкість впроваджуються T-лимфоцитов та його міграцію в організмі хворого. Для цього він була произведена маркірування що використовуються лікування TIL-клеток шляхом їх трансдукції у культурі ретровирусным вектором, несучим ген neo, з наступним відбором неомицин-устойчивых клонів і церащиванием їх у середовищі G418. Результати досліджень показучи, що реинфузированные G418-устойчивые TIL-клетки действительно пробираються у пухлина і може виявлені там невелику кількість навіть 9 тижнів після введення. Найдены відмінності субпопуляции T-лимфоцитов в пухлини загальної популяції инфузированных TIL-клеток.

Після успішного випробування перенесення маркерного гена neo в пухлинні тканини шляхом аутологічної реинфузии трансфецированних T-лимфоцитов лікування меланоми було доповнена введениїм в вектор мишачого гена, контролюючого продукцію, з так званого чинника некрозу пухлини — TNF. Предолагалось, що локальна секреція цього токсичного для клітин білка в пухлинних тканинах сприятиме формуванню иммунного відповіді. Небезпека даної терапевтичної процедури обусловлена можливістю руйнації TIL-клеток у печінці, мозку легких. Тому експресія TNF-гена під гетерологичным промотором може надати сильний токсичний ефект у тих репетуванняганах. Перші клінічних досліджень описану схему лікування розпочато у грудні 1991 року у Національному Інституті Здоровья.

(NIH) США.

Інша програма генної терапії, запропонована для лечения меланом, полягає в стимуляції протипухлинного иммунитета, опосередкованого T-лимфоцитами. І тому в изолированні пухлинні клітини пацієнта вводять TNFчи IL2-ген або інші гени, секретирующие цитокины, і далі проводять імунізацію пацієнта шляхом підшкірного запровадження трансдуцированных клітин. Цю процедуру як така можуть призвести до рассасыванию первинної пухлини чи то, можливо івпользована для ізоляції ефективніших TIL-клеток з лимфоузлов, поблизу місця ін'єкції. Така імунізація может бути рекомендована запобігання рецедивов у пациентов, піддавалися іншим курсів протипухлинний терапіі. Перша спроба прямого перенесення гена в пухлинні клеткі пацієнта і їх попередньої ізоляції також було здійснено з формування імунної системи проти злоякісної меланоми. Процедура включала пряму иньекцию в пухлина липосом-плазмидного комплексу з геном, контролирующим відсутній у пацієнта антиген гистосовместимости.

HLA-B7. Інший тип модифікації пухлинних клітин грунтується на запровадження у них гена тимидинкиназы Герпесу. Використаний у роботі ретровирусный вектор забезпечував включення генної конструкції лише у активно пролифирирующие клітини, якіми і є клітини пухлини. Вперше цю схему була апробирована під час лікування карциноми яєчника. Після интраперитонеальной аутологічної иньекции трансдуцированных клітин злокачественной карциноми пацієнтам призначали противогерпесный препарат — ганцикловир, вибірково вбиває клітини, експрессирующие ген вірусної тимидин-киназы. Протипухлинний ефекту обумовлений летальним дією токсину, утворющегося в модифікованих клітках і наступної імунної реакцією організму на пухлинні клетки.

Підходи, використовувані на лікування вірусних інфекцій путим запровадження організм людини специфічних нуклеїнових кислот, дуже різноманітні і засновані на детальному исследовании молекулярних механізмів взаємодії инфецирующих агентів з клетками-хозяина. Ми лише коротко перелічимо основные принципи, використовувані розробки відповідних медичних протоколів. Найбільше противовирусных програм генної терапії запропоновано у межах боротьби з снідом, хоча аналогічні методи розробляються на лікування гепатиту, цитомегаловирусных, герпесных та інших вірусних інфекций. Один із перших таких програм була на руйнація регуляторних механізмів реплікації вірусу иммунодефіциту — HIV, шляхом введення в T-лимфоциты від 20 до 50 допий TAR-гена, що кодує активуючий елемент, критичний для перемикання генетичної програми клітини на вірусну репликацию. Інша програма включала введення у T-лимфоциты гена CD4 вірусного антигену для специфічного связывания.

HIV і виведення їх у русло крові. Ряд програм засновані на запровадження у T-клетки умовно летальних генів, як-от ген вірусної тимидинкиназы, про те, щоб уникнути нежелатільні побічні ефекти у разі неконтрольованого размножения цих клітин або занадто сильного їхні діяння на.

HIV-инфецированные клітини. Однією з напрямів підвищення ефективності терапевтичного використання T-лимфоцитов на лікування сніда є спрямована модифікація ex vivo генів головного комплексу гістосумісності і конструирование цій основі «універсальних донорських «клітин. Так, позбавлені HLA-маркеров гетерологичные модифицированные.

T-клетки може бути трансплантированы пацієнтам без побоювання імунологічної несумісності. Такий підхід може оказаться ефективним за необхідності гетерологичной трансплантації в терапевтичних цілях будь-яких типів клітин. Принципиально іншим чином боротьби з на вірусні інфекції является введення у уражені тканини антисмысловых последовательностей, здатних гибридизоваться з вірусами отже, їх нейтрализовывать (Cohen, Hogan, 1994; Wagner,.

1994). Адресність доставки таких послідовностей можна досягти шляхом їх комплексування з відповідними білковими лигандами (див. 9.4.2).

Розділ 9.7. Деякі етичні і соціальні проблеми генної терапии.

Поява принципово нових технологій, дозволяють активно маніпулювати з генами та його фрагментами, обеспечивающими адресну доставку нових блоків генетичної информации в задані ділянки геному, зробило революцію у биології та медицині. Відповідно до вищевикладеного, сам ген дедалі більше починає в ролі ліки, застосовуваного на лікування як моногенных, а й багатьох інших у тому однині і значно більше поширених недуг (пухлини, інфекції). Не забариться застосування генотерапії й для боротьби з мультифакториальными захворюваннями (серцево-судинні, психічні, ендокринологічні і ще). Вже цейгодину, на рівні наших знання геномі людини теоретично цілком возмножны такі його модифікації шляхом генної трансфекції, які можна розпочато метою поліпшення низки фізичних (наприклад, зростання), психічних і интеллекуальных параметрів. Отже, сучасна наука про особи на одне своєму вищому рівні розвитку повернулася до идее.

" поліпшення людської породи ", колись постульованої видатним англійським генетиком Френсісом Гальтоном і развийого учнями і послідовниками (Карл Пірсон, Лионель.

Пенроуз, Дж. Халдэйн тощо.). Подальший хід історії, як відомо, повністю дискредитував самої ідеї «поліпшення «людської породи. Проте, майбутнє «всевладдя «людини над власним геномом змушує знову і знову повертатися до означеній темі, роблять її предметом постійних пожвавлених дискусій у широкій і з наукового друку (Ledley, 1987; Anderson, 1992; Wivel, Walters, 1993; Culver, 1994). Развернувшаяся у зв’язку дискусія дозволяє підбити підсумки і зробити певні прогнозы.

Вже сьогодні поза сумнівом, що початкові побоювання, пов’язані з генної інженерією загалом і генної інженерией людини, зокрема були невиправдані. Після многолетней дискусії всебічного розгляду різних рівнях було визнаним доцільним застосування генної тірапии на лікування багатьох захворювань. Єдиним і непременным обмеженням, яке зберігає чинність й у сучасних умовах, і те, що це генотерапевтические мероприятия мають бути спрямовані лише з конкретного хворого й стосуватися виключно його соматичних клеток.

По глибоке переконання основних авторитетів генної тірапии (Фр.Андерсон, Т. Каски, Фр. Коллинс, Дж. Вильсон тощо.), і навіть відповідно до існуючих регламентациям соответствующих «дозвільних «комітетів по генно-інженерним дослідженням (див. 9.1) сучасний рівень наших знань Демшевського не дозволяє проводити корекцію генних дефектів лише на рівні половых клітин та клітин ранніх доимплантационных зародків чоголовека. Причина цього — реальна загроза засмічення генофонду небажаними штучними генними конструкціями або внесення мутацій із наслідками майбутньої человечества.

Разом про те, паралельно з удосконаленням методів генної терапії, появи нових технологій, пов’язані зі створенням ефективніших і безпечних векторних систем і більше зівершенных генетичних конструкцій, бурхливим зростанням объема інформації про структуру геному, картировании нових генів у наукову літературу дедалі дедалі більше лунають призывы до поновленню дискусії щодо доцільності генокоррекции зародкових і статевих клітин людини (Wivel, Walters,.

1993; Latchman, 1994).

Основним аргументом на користь таких втручань являєся той цілком очевидний факт, що в міру того й усе більшиї число спадкових захворювань буде доступно эффективной генної терапії, дедалі більше особин, гомозиготных по летальним мутантным генам, накопичуватиметься в популяции. Відповідно, тим реальней будуть ситуації, коли обоє виявляться гомозиготными носіями мутантного гена. І тут отримання здорового потомства зажадає генетичного втручання вже в ранніх стадіях і, возможале, буде цілком безпечної експлуатації і реальної трансфекція гамет чи ранніх зародышей.

Експерименти на тварин зі створення штучних біологічних моделей спадкових хвороб (см. Главу VIII), і навіть перші клінічних досліджень по доімплантаційної діагностиці генних хвороб (Verlinsky, Kuliev, 1993; см.

Главу VI) переконують, що така генно-терапевтический підхід то, можливо реальним вже у недалекому майбутньому. Цілком природно, що доцільність його застосування повинна впределяться як генно-інженерними можливостями, але його соціальної значимістю і необхідністю. Ось тільки неякі питання, що їх вирішено у рамках предлагаемой генетиками широкої дискуссии:

Чи зможе майбутньому генна терапія забезпечити настільки повноцінну генокоррекцию, яка представить небезпеки потомства?

Наскільки корисність й необхідність генотерапевтической процедури одній подружжя переважать ризик втручання для человечества?

Як виправдані будуть ті процедури і натомість прийдешнього перенаселення планети ?

Як співвідноситися генно-інженерні заходи людині з вадами гомеостазу нашого суспільства та биосферы?

Отже, генетична революція апофиозом якої стала генотерапія як пропонує реальні шляху лечения тяжких спадкових і ненаследственных недуг, а й у своєму стрімкий розвиток ставить перед суспільством нові проблеми, вирішення яких потрібно вже у найближчому огляньмом будущем.