Структура грамицидинового каналу, його фундаментальне і практичне значение

Структура грамицидинового каналу, його фундаментальне і практичне значение.

Хімічна природа грамицидина Проте й його загальні свойства.

1. Біологічна роль грамицидина, А 2. Структура грамицидина А.

4.1 Конформації грамицидина На органічних растворителях.

4.2 Структура грамицидина На ліпідних мембранах і мембраноподібних средах.

4.3 Вплив зв’язування катионів на конформацию грамицидина А.

4.4 Відносини між конформационными станами грамицидина Проте й які проводять формами.

4.5 Інженерія грамицидинового каналу 3. Фундаментальна і практичного значення грамицидина, А 4. Висновки 5. Список використаної літератури 1.

Введение

Грамицидин, А відоме понад 50, але досі залишається у центрі уваги. Будучи дуже простим зі своєї хімічної структурі (всього 15 амінокислот) він має здатність утворювати ионселективный трансмембранный канал, не який за характеристикам величезним по порівнянню з нею білковим каналам, представлені, наприклад, в нервової системі. Можливо, якого є попередником цих самих каналів і поза час еволюції «обріс» різноманітними сенсорами напруги, селективными фільтрами та інші регуляторними елементами. Якщо таке порівняння, то плані детальної тривимірної структури то доки знаємо жоден інший іонний канал, й застосування їх грамицидина Щодо побудови різноманітних моделей і теоретичних досліджень стала однією з шляхів до детальному розумінню різних молекулярних механізмів і структурнофункціональних взаємодій. І, мабуть, грамицидин, А є одним із кращих таких моделей.

2. Хімічна природа грамицидина Проте й загальні свойства.

. Грамицидин, А належить до групи лінійних полипептидов, продукованих бактеріями Bacillus Brevis, на стадії спорообразования. Вирізняють кілька особливостей цієї групи пептидних антибіотиків: 1) Усі 15 амінокислот що входять до склад послідовності грамицидинов є гидрофобными; 2) У тому послідовності спостерігається чергування Lі Dконфігурацій амінокислот; 3) З — і Nкінець грамицидинов блокированны з допомогою этаноламина і формила відповідно. Природня суміш (грамицидин D) складається з з трьох основних компонентів, відмінних однієї амінокислотою в партії 11 становищі,. Відповідно до цього відмінності грамицидины класифікують на: грамицидин, А — в партії 11 становищі Trp, грамицидин B — в одинадцятому становищі - Phe, і грамицидин З — в одннадцатом становищі - Tyr. Загальна послідовність грамицидинов: HCO-(L)Val-Gly-(L)Ala-(D)Leu-(L)Ala-(D)Val-(L)Val-(D)Val-(L)Trp-(D)Leu;

1 2 3 4 5 6.

7 8 9 10 X-(D)Leu-(L)Trp-(D)leu-(L)Trp-NH2CH2CH2OH 11 12 13 14 15 де Х= L-Trp для грамицидина А,.

L-Phe для грамицидина В,.

L-Tyr для грамицидина З. Грамицидин А, У і З представленны в соотнощении 85:5:15 відповідно. Ко всього є деяка гетерогенність по першої амінокислоті: в природної суміші 90% грамицидинов мають у своєму першому становищі Val, тоді як інші 10% мають Ile. Більшість початкових досліджень було проведенно в цій шести компонентної суміші. Грамицидин До — має ковалентно присоеденную жирну кислоту до С-концу так само було виділено у різних співвідношеннях, залежно від методу виділення. Грамицидин P. S (Радянський), як і продукується виглядом Bacillus Brevis, але є циклодекапептидом і рухається за механізму іонного переносчиика (транспортера), отже ця молекула непричетний до лінійним грамицидинам ні структурно, ні функціонально. Завдяки з того що в послідовності грамицидина Але ж ні жодної зарядженої амінокислоти і блокированны Nі С-конец (в такий спосіб виключається возвожность освіти цвиттер-иона за будь-яких значеннях рН), ця молекула практично нерастворима у питній воді (менше 10 мг в літрі), але за то має сильне спорідненість з гидрофобному регіону липидной мембрани. Грамицидин, А слабко розчинний в вуглеводнях, через те сильно у багатьох нижчих спиртах, органічних кислотах та інших органічних розчинниках, таких як: диметилсульфоксид, ацетон, диоксан і трифторэтанол. Він такий ж можна бути растворенн у питній воді у присутності лизолецитина, ганглиозидов, додецилсульфата натрію та інших детергентів. Початкові дослідження грамицидина були проделанны на природної суміші, але після з’ясування складу даної суміші подальші експерименти проводилися на грамицидине Але як основному компоненті природної смеси.

3. Біологічна роль грамицидина А.

Грамицидин відіграє у процесі спророобразования у Bacillus brevis, визначаючи формування нормальних суперечка. Показано, що штами, деффекные по синтезу грамицидина формують суперечки із підвищеною термочуствительностью. Грамицидин, А спецефически ингибирует експресію окремих (вегетативних) генів, визначаючи, в такий спосіб, перехід мікроорганізму в спочиваючу стадію. Механізм такий регуляції остаточно не ясний, але відомо, що грамицидин, А перешкоджає освіті комплексу РНКполимеразы з ДНК, який буде необхідний ініціації транскрипції. Предложенно дві мішені зв’язування грамицидина: 1) грамицидин, А специфічно пов’язують із певним ділянкою ДНК і препядствует транскрипції. Такий механізм схожий на дію іншого пептидного антибіотика — тироцидина, як і синтезируемоего Bacillus brevis, який, зв’язуються зі молекулою ДНК, перешкоджає освіті комплексу РНК-полимераза/ДНК, як наслідок ингибирует експресію певних генів; 2) грамицидин, А пов’язують із певним ділянкою РНК-полімерази, чо призводить до зміни її конформації і неможливістю зв’язування з ДНК. Можливо грамицидин, А учавствует у дивовижно складному каскаді біохімічних процесів разом з іншими антибіотиками (тироцидины (серия циклічних пептидів, так ж синтезованих виглядом Bacillus brevis на стадії спорообразования), результатом якого є перехід від вегетативного зростання до суперечці. Лінійні грамицидины мають антибиотическим і спермицидным ефектом спрямованим проти грамположительных бактерій. Антибиотический ефект грамицидина визначається її здатністю обрзовывать трансмембранный іонний канал, до чого цей ефект носить бактериостатический характер, що, очевидно пов’язані з виснаженням запасів АТФ, в організмі який діє грамицидин, який використовує Na-K-АТФаза для востановления іонного градієнта .

4. Структура грамицидина А.

Не дивлячись досить просту первинну последовтельность грамицидина, визначення природи його тривимірної структури, був стрімким і швидким. Через його невеликих ж розмірів та, як наслідок, сильної рухливості грамицидин, залежно від, може існувати як сімейства конформаций. Вирізняють дві основні типу структури грамицидина: 1) Сімейство подвійних спіралей, запропонованих Витчом (1974, [10]) і що у органічних розчинниках; 2) Сімейство одиночних спіралей, запропонованих Урри [11] і що у ліпідних мембранах. У зв’язку з незвичайністю хімічної структури грамицидина, связаной з чергуванням конфігурацій які входять у його послідовність амінокислот стандартна номенклатура може бути застосована для даної моделі, оскільки грамицидин не формує жодного типу структур, наявних у глобулярных белках.

Анализируя спектри КБ грамицидина, а як і виходячи з теоретичних розрахунках конформационных енергій Урри і сотр. (1971 р. [11]) постулювали існування особливої вторинної структури, названої (4(L, D)-спиралью, що є гібридом 4,416 і 4,314 спіралей (4,4 — кількість залишків на виток, 16 — кількість атомів в витку). Рамачандран і Чандрасекаран [12], базуючись здебільшого конформационно-энергетических взаємодію незалежно виявили ті ж самі вторинну структуру. Пізніше Урри і сотр. [13] запропонували іншу модель конформації грамицидина — (6(L, D) спіраль, має 6,3 залишку на виток і центральну порожнину розміром 4 ?, яка більше адресований зв’язування і транспорту катионів, ніж порожнину в 1,4 ?, що є в (4(L, D) спіралі. Димер полипептидных ланцюгів, асоційованих кінець до кінця (N-конец до N-концу, С-конец до С-концу чи N-конец до С-концу) з конформацией (6(L, D) спіраль має розмір 25−30? отже, може пронизувати ліпідний бислой і утворювати трансмембранный канал (Рис1А). Кожна спіраль стабілізується 12-ту внутримолекулярныму водневими зв’язками, а димер (за будь-яких засобах асоціації) — з допомогою шести межмолекулярных водневих связей.

Альтернативной структурою, запропонованої Витчом і сотр 1974 року [10], є подвійна (- спіраль, у якій два мономера закрученны друг на друга. Асоціація між мономерами у такому спіралі може бути як паралельної (((), і антипараллельной (((). Розташування водневих зв’язків у подвійних спіралях грамицидна таку ж як й у (-шарі, який, як було предположенно, й утворюється спочатку між двома молекулами грамицидина, та був звертається в спіраль. Витч і сотр. Також запропонували, такі спіралі з 6−7 залишками на виток матимуть розміри, підходящі для протинання ліпідного бислоя і транспорту іонів. Подальші дослідження подібного типу моделей показали можливість існування антипараллельных подвійних спіралей з 5,6 і 7,2 залишку на виток (рис1Б).

Рисунок 1.

Схематическое зображення спіральних димеров (структура Урри) (А) і двухспиральных димеров (структура Витча) (У) грамицидина.

Название (-спіраль, запропоноване спочатку для описи конформаций грамицидина було зовсім коректне, оскільки цю назву зазвичай використовується для 4,416-спиралей, мають типову орієнтацію водневих зв’язків (все амидные групи пептидного остова у цій структурі звернені в оддну бік, у результаті дає сильний сумарний диполь), тоді як спіралі запропоновані для грамицидина немає таку геометрію (аминогруппы пептидного остова мають різне напрям, не створюючи, в такий спосіб, диполь). До того ж значення кутів (і (, расчитанные для даних структур, від таких у (-спіралях описаних Рамачандраном і Рамакришнаном [14]. Отже запропонували називати такі структури (-спіралями, що дуже добре визначає освіту водневих связей.

Не дивлячись на явні відмінності двох запропонованих структур, спіральні димеры ((-спіралі) і двухспиральные димеры (((спіралі) мають багато спільного і може утворювати структури майже ідентичних розмірів, і більше, спосіб освіти водневих зв’язків однаковий в обох випадках. Первинна послідовність грамицидина робить обмежень для напрями закручування спіралей, і є підстави як право-, і левозакрученными. Цей потенційний поліморфізм пов’язаний із тим, що чергування Lі D-аминокислот не накладає обмежень на напрям закрутки спіралі. Також, в обох типах запропонованих структур, бічні ланцюга аминокислон розташовуються з наружней боку спіралі та ні однієї бічний ланцюга немає у внутрішній порожнини. Через війну внутрішня порожнину (час) даних спіралей набагато більше такою для (-спіралей. Це пов’язане з дикою природою ?-шару: в послідовностях що мають тільки Lамінокислоти, при освіті (-шару бічні ланцюга звернені по черзі у різні боки від площині шару, а разі чергування Lі D-аминокислот все бічні радикали будуть звернені до однієї кращий бік від площині ?-шару і, в такий спосіб при згортання такий структури в спіраль вони всі виявляться зовні, а всередині утворюється час, вистелений карбонильными групами пептидних зв’язків, здатна пропускати води і ионы.

2.3.Конформация грамицидина На растворе Грамицидин приймає кілька типів конформаций в органічних розчинниках. Витч і сотр. [10, 15, 16] виявили, що диоксане грамицидин існує у вигляді 4-х різної форми, перехідних один одного і що у повільному рівновазі (час переходу однієї форми до іншої вимірюється годинами). Усі чотири форми було поділено методом тонкослойной хроматографії, до чого кожна окрема форма, виділена з тонкослойной платівки і нанесена наново, знову виявлялася як чотирьох плям. Різні форми не показали відмінностей у первинної структурі. Дані осмометрии і флуресценции [16], показали, що кожна з четурех форм є димером. Методом ИК-спектроскопии [10] було показанно, що це форми є подвійними спіралями, до чого форми 1,2 і 4 (пронумерованны відповідно до їхнього хроматографічної подвижноси) є паралельними подвійними спіралями, а форма 3 — антипараллельной подвійний спіраллю [10]. Кожен із видів має характерний КД-спектр, дає інформацію про повернення закручування спіралі. Оскільки спектри видів 1 і 2 мають однакову форму, Витч і сотр. запропонували, що вони теж мають однакове напрям закручування [10]. Форми 1,2 і трьох мають негативну эллиптичность у сфері 205−240 нм, напрям закручування спіралей є протилежної проти виглядом 4, форма спектра якого є дзеркальне відображення видів 1,2 і трьох. Спектр грамицидина, отриманий відразу після розчинення кристалів є спектр форми 3 [10]. Спектр рівноважної суміші форм є накладення спектрів окремих форм, але завдяки тому, що спектри 1,2 і 4 практично взаимовычитают одне одного, вона має форму виду 3, навіть якщо вона перебувати у незначній кількості стосовно іншим. КБ спектроскопія це не дає детальної інформації про конформації кожної структури, тому, що (і (кути в (-спіралях від таких у (-спіралях, (-шарах і (-поворотах, що робить порівняння даних спектрів зі спектрами інших білків не ефективним. Ці структури були подтвержденны методом двумерного ЯМР [18], й виявили що грамицидин в етанолі як і існує у вигляді 4-х взаимопревращаемых конформаций. Види 1 і 2 є левозакрученными паралельними подвійними спіралями з 5,6 аминокислотного залишку на виток. Вони відрізняються взаємним розташуванням ланцюгів і мають однакову крок спіралі та висоту. Вигляд 2 має менш впорядковані кінці спіралі зумовлені зрушенням втричі амінокислотних залишку [17]. Вигляд 4 представляє з себе правозакрученной паралельної подвійний спіраллю, з такою самою взаємним розташуванням ланцюгів і заввишки спіралі як і вид 1 (це зумовлює форму його спектра КБ, що є дзеркальним відображенням видів 1 і 2). Вигляд 3 (форма, що настає відразу після розчинення кристалів грамицидина) є левозакрученной антипараллельной подвійний спиральюс 5,6 залишку на виток і зрушенням втричі амінокислотних залишку. Ця форма є найбільш термодинамічно вигідною в кристалічному стані (мал.2) [19]. Малюнок 2. СРК Зображення левозакрученного антипараллельного двухспирального димера грамицидина з 5,6 залишку на виток (PDB Code: 1ALX). А — вид згори; Б — вид збоку. Дві молекули грамицидина в димере показанны різними квітами. Водороды скрыты.

Все описані спіралі стабилизирются 28-ю межмолекулярными водневими зв’язками, немає внутримолекулярных водневих зв’язків і збігаються з модельними, запропонованими Витчом і сотр [10]. Грамицидин утворює ті ж самі суміш конформаций у різних спиртах, этилацетате [6], і було, час взаимоперехода у тих розчинниках меньше.

[20], множинність структур все-таки вдається зарегестрировать методом ЯМР [18]. Дослідження грамицидина в розчині DMSO показали, що він перебуває у вигляді мономера, і знаходять у вигляді одного плями на тонкослойной платівці [16]. Методом ЯМР засвідчили, що у DMSO грамицидин перебуває у швидкому рівновазі між неупорядкованою конформацией і різними спіралями, мають іншу форму, ніж згадані вище [21]. У трифторэтаноле грамицидин є мономер [22], а форма спектра КБ більше на спектр грамицидина в мембрані [23], і такою чином, представляє з себе одна частка тривимірної структури грамицидина.

Таким чином, грамицидин існує у різних конформациях, в залежність від розчинника, і навіть у формі набору кількох конформаций в одному розчиннику. Такий поліморфізм можна пояснити схожими енергіями стабілізації різних структур, обумовлених різної мережею водневих связей.

2.4.Структура грамицидина в ліпідних мембранах і мембрано-подобных средах Спектр КБ убудованого в ліпідний бислой грамицидина скидається на будь-який спектр, отриманий різних органічних розчинниках [24]. Понад те даний спектр годі уявити як сукупність який або комбінації спектрів розчинів грамицидина, і, отже, як комбінацію якихось конформаций виявлених у розчинах. Форма КБ спектра мембрансвязанного грамицидина залишається незмінною широтою діапазону температур. З іншого боку, виходячи з даних лише спектрів КБ не можна сказати, може бути грамицидин до якогось однієї формі, або ж є набір конформеров. Вивчені методом ЯМР 13С і 19 °F мічені грамицидины, вбудовані в липосомы [25−27], показали існування однієї домінуючою структури в мембранах. Спектр КБ мембрансвязанного грамицидина у сфері далекого ультрафіолету має форму схожу на экситонное розщеплення, що свідчить про стэкинг взаємодію триптофанов у цьому оточенні [28]. Экситонное розщеплення як і зокрема у області ближнього ультрафіолету [18]. що свідчить про внутримолекулярных взаємодію (Такого экситонного розщеплення немає в розчинах, що є одним підтвердженням різниці конформаций в мембрані й у розчині). Інші методи [29, 30] як і підтверджують наличе стэкинг вззаимодействий в мембрансвязанной формі. Дані результати свідчить про відмінності в конформації як полипептидного остова, і у орієнтації бічних ланцюгів між мембрансвязанной конформацией і формами, що у розчинах. Синхронні дослідження флуресценции і провідності у чорних ліпідних мембранах [31] й у липосомах [32] показують, що проводить форма грамицидина є димером. У дослідженнях з одиночними каналами (при співвідношенні грамицидин/липид близько 1:10 000), реєстрація відкривання і закривання каналу співвідноситься з рівновагою мономер-димер (Рис.3).

Грамицидин як і утворює комплекси з такиими детергентами як лизолецитин [33], і додецилсульфат натрію [34]. Дослідження таких комплексом методом електронної мікроскопії (метод замораживания-скалывания) свідчить про наявності мультиламелярной фази детергента, тоді і з іншими білками і пептидами ці детергенты формують типову мицелярную фазу, більше дані 15Р і 2Н ЯМР, а як і дифракції ренгеновских променів при малому вугіллі демонструють, що амфифильные групи молекул детергента мають бислойтаку організацію. Цей приклад — хороша демонстрація впливу грамицидина на організацію те, які молекул липида [35] Оскільки детергент комплексно з грамицидином оразует мембраноподобные структури, можна припустити, що тривимірна структура грамицидина в даної системи така сама, як й у бислойных мембранах, хоча інші невеликі пептиди мають різну структуру в мицеллах й у ліпідних бислоях. Мембрансвязанная форма грамицидина є спіральний димер, що було подтвержденно різними хімічними і фізичними методами. Дані ЯМР-спектроскопии з допомогою 13С і 19 °F мічених грамицидинов вмонтованих у липосомы показали наявність структури у якій N-конец молекули розташований посередині бислоя, а С-конец орієнтований назовні [25, 26, 27 ]. ЯМР в твердому тілі (орієнтовані мультиламелярные бислои) виявив ті ж самі структуру [36]. Вивчення провідності аналогів грамицидина в чорних ліпідних мембранах покзали що модифіковані по С-концу аналоги здатні утворювати активні канали лише за додаванні із двох сторін мембрани і утворюють їх при додаванні з одного боку мембрани. Оскільки заряджені молекули що неспроможні переходити з одного боку мембрани на іншу — це стало ще однією підтвердженням те, що мембрансвязанная форма є спіральним димером N-конец до N-концу У спіральному димере N-конец до N-концу кожен мономер стабілізовано 12-ту внутимолекулярными водневими зв’язками, а димер — 6-ту межмолекулярными водневими зв’язками, в образованиии яких беруть участь N-концевые формильные групи. Предложенно, що відкривання і заплющення каналу пов’язане з асоціацією і дисоціацією (тобто із освітою і формуватимуться розривом межмолекулярных водневих зв’язків) такого ддимера [37] (РИС).

Рисунок 3.

Схематическое зображення інактивації грамицидинового каналу шляхом дисоціації димера голова до голови (структура Урри — Арсеньева).

Вивчення аналогів грамицидина показали, що N-коцевая формильная група надає сильний вплив на стабільність димера [38]. За її заміщення на більш об'ємну ацетильную [39], сукцинильную [40] або за відсутності взагалі тривалість життя каналу зменшується. Дослідження методом КД-спектроскопии показали сильні конформаційні різницю між нативным грамицидином та її аналогами, що, можливо причина дестабілізації каналу [41]. Подальші дослідження з допомогою 13Сі 15N-меченных аналогів в орієнтованих мультиламелярных бислоях показали можливість існування праозакрученной конформації каналу [24].

Наиболее детальна структурна конформація грамицидина була певна методом двумерного ЯМР комплексно грамицидина з додецилсульфатом натрію (Арсеньєв і сотр. 1985 р.). Ця структура є спіральний димер, у якому кожна складова спіраль має 6,3 залишку на виток ((6,3-спиральный димер) (Рис. 4.).

А Б Рисунок 4.

СРК Зображення правозакрученного спірального димера грамицидина з 6,3 залишку на виток (PDB Code: 1GRM). A — вид згори; Б — вид збоку. Дві молекули грамицидина в димере показанны різними квітами. Водороды скрыты.

. Подальші засвідчили що одне пара залишків Trp (9Trp і 15Trp) можуть міститися у стэкинг взаємодію [41]. Понад те, теоретичні розрахунки показали, що енергетично вигідною структурою в мембрані є (6,3-спиральный димер, у якому залишки триптофану утворюють кластери за українсько-словацьким кордоном розділу фази липид-вода, і їх азоты индoльных груп здатні взаємодіяти з полярними головками ліпідів і з молекулами води. У двухспиральной конформації залишки триптофану расположенны рівномірно по внеешней поверхні спіралі й закручено лише дві з них (на відміну чотирьох на (6,3спиральном димере) можуть взаємодіяти з молекулами ліпідів чи водою. Отже, двухспиральная конформація енергетично дестабилизиированна в мембрані по відношення до спіральному димеру [41] (рис.5).

А Б.

В.

Малюнок 5 Становище бічних радикалів залишків триптофану у різних конформерах грамицидина. Вигляд сбоку.

Бічні радикали триптофанов выделенны синім кольором. А — ?6,3- спіральний димер (Структура Урри-Арсеньева, що спостерігається в мембранах); Б.

— ??5,6-двухспиральный димер (Структура Витча, що спостерігається в органічних розчинниках); З — ?7,2-двухспиральный димер (структура комплексу грамицидина з іоном цезію в органічних розчинниках і кристаллах).

Спектроскопічні дослідження грамицидина у різних мембранах показали, що співвідношення спіральних і двухспиральных димеров є функцією ступеня ненасиченості ліпідів, їхнім виокремленням мембрану. При збільшенні частки ненасичених ліпідів збільшується частка двухспиральной конформації. Ці результати свідчать, що бічні ланцюга триптофанов можуть взаємодіяти з С=С зв’язками [42]. Модельні дослідження, у кобинации з экспериметами з вивчення липид — пептидних взаємодій так ж підтверджують важливість цих амінокислот для стабілізації канальної структури та впливають на організацію оточуючих грамицидин ліпідів [ 17] Через війну (в 90% випадків) грамицидин образуе активний трансмембранный канал одним-єдиним структури, що є (6,3-спиральным димером. Ця структура аналогічна моделі запропонованої раніше Урри [12].

2.5.Влияние зв’язування іонів на конформацию грамицидина Грамицидин здатний транспортувати одновалентні катиони через фосфолипидные мембрани [43]. Его різна селективність стосовно різним представникам групи лужних металов окреслюється розміром конкретного іона, і значенням його енергії гідратації. Відносні константи афинности з натрієм, калієм, рубідієм, цезієм і талием були исследованны з допомогою методу реєстрації одиночних каналів [44], вивчення аналогів грамицидина [45], равновесного діалізу [46], ЯМР [47], провідності води [48] й виявили, що константа зв’язування талія менше ніж цезію і два порядки менший від ніж натрію. Подальші засвідчили, що з каналом одночасно можуть зв’язуватися два іона, причому константа зв’язування першого катиона більш ніж другого [49], що певне, пов’язані з електростатичним відштовхуванням. Двухвалентные катиони блокують проведення одновалентных [39] і нетранспортируются грамицидиновым каналом. Останні дослідження [49] показали, що частково дегидратированный двухвалентный катіон связыватся з грамицидином з більшою энтальпией ніж одновалентный. Таоке сильне взаємодія є наслідком низькою рухливості двовалентних катионів в грамицидиновом каналі. Зв’язування аніонів з грамицидиновым каналом був продемонстрированно, хоча є певні доведення їхніх провідності і сфери впливу на транспорт катионів [44]. Взаимодеиствие грамицидина з одновалентными катионами надає слабке вплив (чи взагалі важить) на форму його спектра КБ [50], і такою чином, на конформацию грамицидина. Комплекси грамицидина з лизолецитином як і пов’язують катиони, вони були использованны визначення констант зв’язування [51] і локалізації сайтів зв’язування. У цьому системі спостерігається зміна форми спектра КБ при зв’язуванні катионів (на відміну комплексу з додецилсульфатом натрію, де такий ефект відсутня), що свідчить про зміні конформації при такій взаємодії [52]. У органічних розчинниках спостерігається сильне на зміну структури грамицидина при зв’язуванні з катионом, що демонструється зміною як форми, і амплітуди спектра КБ. При дослідженні зв’язування цезію з грамицидином в розчині спостерігається поступове зміна форми спектра КБ, що свидетельствет про плавному перехід з форми вільного грамицидина в ион-связанною. Ці дані були использованны визначення констант зв’язування цезію, які склали К1=170 М-1 — на першому (міцнішого)сайту, і К2=20 М-1 — на другому (слабшого) сайту зв’язування. Константа зв’язування для літію, певна тим самим методом має величину значно меншу, ніж така для цезію [28]. Константа зв’язування для натрію була визначені методом 23Na ЯМР [53] і становить 4 М-1. Константи зв’язування інших іонів були визначені, у зв’язку з їхньої низької аффинностью, що робить такі изимерения досить складними. У розчині хлороформ-метанол у присутності тиоцианата цезію грамицидин (по даним двумерной ЯМР-спектроскопии) є правозакрученную антипараллельную подвійну спіраль з 7,2 залишку на виток ((7,2-спиральный димер) і зрушенням в 1,5 залишку, що свідчить про тому, що 1Val не бере участь у освіті водневих зв’язків [54] (див. мал.6). Кристалічні структури грамицидина дають додаткову інформацію про його тривимірної структурі та, більше, можливість формування кристалів за відсутності і у присутності іонів дозволяють вивчити вплив. Обидві ионсвязанная і ионсвободная кристалічні структури грамицидина є левозакрученными антипараллельными подвійними спіралями і вирізняються від форм в розчині значеннями кутів (і (, напрямом освіти водневих зв’язків і регулярністю укладання полипептидного остова. Ионсвободная кристалічна форма довші (31 ?) вже (внутрішня порожнину досить вузька й у певних місцях неспроможна пов’язувати іон) ніж кристалічна форма з тиоцианатом цезію (26? завдовжки, 4,9? — внутрішній діаметр пори, у якій поміщається іон цезію) [17].

А.

Б.

.Малюнок 6.

СРК Зображення правозакрученного антипараллельного двухспирального димера грамицидина з 7,2 залишку на виток (??7,2 -двухспиральный димер).

(PDB Code: 1AV2) в компелексе з цезієм. А — вид зверху і іон цезію; Б — вид збоку. Дві молекули грамицидина в димере показанны різними цветами.

(червоний і синий).

Конформация полипептидного остова в ион-связанной формі грамицидина більш упорядоченна, хоч і є певні варіації кутів (і (околицях що прилягають до сайтах зв’язування катионів, а водневі зв’язку направленны майже паралельно осі спрали [55]. Це засвідчує тому, що дана спіраль з більшої ймовірністю имее 6,4 залишку на виток, ніж 7,2. Порівняння ион-свободных і ион-связанных форм грамицидина показало, що з зв’язуванні відбувається переупакування і адаптація тривимірної структури під конкретний катіон. Така перебудова можлива при реорганізації водневих зв’язків. Також спостерігається локальне розширення спіралі у місцях зв’язування іона і реориентация карбонильных груп пептидного остова, що у зв’язуванні іонів [17].

2.6.Локализация сайтів зв’язування катионів у різних конформациях грамицидина Катион котрі пов’язують сайти в двухцепочечных структурах може бути визначені безпосередньо з їхньої кристалічних структури комплексі з хлоридом цезію [56]. Усередині пори перебувають два іона цезію симетрично розташованих на растоянии ~7,2? від кінця спіралі. Сайти зв’язування сформированны карбонильными групами полипептидного остова, які, пов’язуючи іон орієнтуються до осі спіралі з точки ~40є. Углове перерозподіл карбонильных груп збільшує дистанції між групами, утворюючими водневі зв’язку, отже змінюються значення кутів (і ?. Карбонильные групи на протилежних сторони пори, пренадлежащие залишкам 11Trp і 14Leu, є найближчими до пов’язаного катиону. У цих кристалах окрім двох іонів цезію комплексно з грамицидином як і перебувають три іона хлору, дві з яких расположенны на протилежних кінцях спіралі, а третій — у її центральній частині. Іони хлору відділені від цезію молекулами розчинника на растояние ~10 ?. Наявність пов’язаних іонів хлору досить незвично, оскільки грамицидин не транспортує аніони, а теоретичні розрахунки [57] показують, що енергетичний бар'єр зв’язування аниона значно більш ніж катиона (що робить вхід в канал для аниона менш вигідним). Присутність аниона всередині пори може бути викликане високої концентрацією солі в кристалах і іони хлору взаємодіють із сайтами зв’язування аналогічно як це роблять молекули розчинника. У кристалах з тиоцианатом цезію позиція іона цезію відрізняється від він у кристалах з хлоридом цезію [55]. Дослідження показали, що у цих кристалах сайти зв’язування перебувають ближчі один до кінців спіралі. Спостереження різних сайтів зв’язування катионів в кристалах можуть моделювати окремі стадії транспорту катиона через грамицидиновый канал. Потенційні взаємодії катионів з грамицидиновым каналом були изученны з допомогою розрахунків теоретичних енергій і молекулярнодинамічних симуляцій [58], й виявили важливість С-концевой этаноламиновой групи для енергетичного профілю каналу, а точенее, для локалізації енергетичного і динаміки коливань карбонильных груп полипептидного остова і трансмембранного транспорту катионів [59]. Заміна С-концевой этаноламиновой групи важить на властивості провідності, вона можливо ж виконує функцію в стабілізації деяких конформаций грамицидиновой молекули. При вході у канал катіон поступово обмінює свою гідратну оболонку на карбонильные групи полипептидного остова грамицидина, этаноламин (а точніше його гидроксильная група) ж виконує функцію своєрідного посередника в такому переході забирає частина молекул води гидратированного іона він, полегшуючи в такий спосіб його вхід в канал. [60]. Енергетичні профілі спірального і двухспирального димеров відрізняються не дуже, крім величини енергетичного бар'єра біля входу до канал, і завдяки цього двухспиральные канали може мати меншу провідність ніж односпиральные [17].

2.7.Взаимоотношения між конформационными станами грамицидина і які проводять формами.

Грамицидин формує характерні канали при дослідженнях у чорних ліпідних мембранах. Провідність одиночних каналів та його тривалість життя залежить не тільки від природи липида, формує бислой, а й від присутніх в середовищі іонів. Провідність та середнє тривалість життя грамицидновых каналів перебувають у досить вузькому діапазоні. У мембранах сформованих з глицерол-моноолеата [43] або з дифитаноилфосфатидилхолина [61] в присутності 0,1 М NaCl середня провідність дорівнює ~5 пикосименс (p.S), а тривалість життя — ~0,5 секунд. За більш високих концентраціях солі провідність збільшується, а товстіших мембранах, отриманих при використанні різних розчинників, тривалість життя каналу зменшується при незмінною провідності [43]. Симетрія расчитанного енергетичного профілю свідчить, основна проводить форма каналу представляє собою структуру з центральною симетрією. Співвідносячи ці дані з іншими результатами можна сказати що його проводить структурою є спіральний димер N-конец до N-концу, хоч і не можна цілком заперечувати можливість існування активного каналу антипараллельной двухцепочечной спіральної структури, було подтвержденно експериментально [17]. У деяких експериментах що за різних пропорціях ліпідів, що використовуються формування бислоя були обнаруженны дуже довгоживучі канали (час життя >100 сек.), хто був представленны у відсотковому співвідношенні 5−10% по відношення до основний формі. Гібридні аналоги грамицидина, нездатні формувати димер N-конец до N-концу, проте спроможні утворювати подвійні спіралі як і виявляли таку ж довго живуть канали [32]. Понад те кросс-сшитые аналоги (С-конец до N-концу), як і нездатні утворювати димер N-конец до N-концу утворювали довгоживучі каналів навіть у співвідношенні 80% до основний формі [62].

Помимо основний рахунок і долгоживущей форм каналів були обнаруженны що й «міні» канали сменьшей середньої провідністю і часом життя, створювані в різних пропорціях стосовно основний формі залежно та умовами освіти бислоя [63,64]. Дані канали може бути мають ті ж самі структуру як і основна форма (спіральний димер N-конец до N-концу), але від неї інший орієнтацією карбонильных груп полипептидного остова в сайтах зв’язування катионів [65]. Вивчення синтетичних аналогів грамицидина допомагають визначити молекулярну основу властивостей природного грамицидинового каналу. Однією з важливих спостережень є кореляція властивостей специфічної структури з функцією. Гарним прикладом такий кореляції є можливість освіти гібридних каналів [66], що становлять димеры у яких один мономер представлений будь-яким аналогом, а другий — іншим аналогом або ж нативным грамицидином. Одна домінуюча проводить форма існує у бислоиных мембранах, що є спіральним димером N-конец до N-концу (голова до голови). З іншого боку існують інші проводять форми, характерні для різних пропорціях залежно та умовами експерименту. Деякі їх можливо мають конформацию подвійний спирали.

2.8.Встраивание в мембрану і стабильность.

У дослідженнях по провідності грамицидин то, можливо додано до сформованої мембрані як концентрованого спиртового розчину. При вбудовування в липосомы грамицидин то, можливо добавленн так само (тобто додавання концентрованого спиртового розчину до приготовленим липосомам) [33] або ж спільним розчиненням з липидом перед формуванням ліпосом [26]. Перехід грамицидина в активну котра проводить форму зазвичай сопроваждается нагріванням чи озвучиванием [67]. Легкість всраивания грамицидина залежить від типу використовуваного липида і південь від співвідношення липид/грамицидин [23]. Загалом ліпіди з більш выской температурою фазового переходу повинні нагріватися сильніші для кращого встраиваия грамицидина. Понад те, в зразках, де припадає понад 20 молекул липида на молекулу грамицидина нагрівання до 30 °C достатньо вбудовування грамицидина, а образци мають менш 10 молекул липида на молекулу грамицидина необхідно нагрівати до 65 °C протягом 48 годин для такої ж вбудовування [17]. Окремі дослідження показують, що з низьких співвідношеннях грамицидин/липид легкість вбудовування залежить від цього що не розчиннику доти перебував грамицидин (так звана історія розчинення) [68]. Якщо липид-грамицидиновый комплекс перед освітою ліпосом був розчинений в трифторэтаноле активний канал утворюється негайно разом із формуванням бислоя, Якщо ж використовувався розчин в суміші хлороформметанол, то тут для вбудовування необхідно сильне нагрівання. Така зависимомть зникає за більш високих співвідношеннях грамицидин-липид, і спостерігається ніякого ефекту як провідності. Це засвідчує тому, що взаємодії з липидом відіграють істотне значення в стабілізації активної проводить структури, а фазове стан важливо задля процесу вбудовування. Також природа комплексів грамициди-липид була изученна з допомогою методу ЯМР [69], які показали, що з низькому співвідношенні грамицидин — липид липид утворює гексагональную фазу, а чи не бислой. Цей то, можливо причиною труднощі вбудовування грамицидина у цих умовах. З допомогою спектрів КБ охарактеризували процес вбудовування грамицидина в липид: до початку вбудови у попередньо приготовлені липосомы, грамицидин є у вигляді подвійної спіралі у присутності іонів [67]. При нагріванні грамицидин перетворюється на одиночну спіраль і вбудовується в бислой. У проміжні часи цього процесу спектр є лінійну комбінацію спектрів цих двох структур. Такі самі процеси простежуються відсутності іона. Один із точок зору той процес у тому, що расплетание подвійної спіралі відбувається до того часу, поки Nкінець з іншим N-концом і такі структура буде майже еквівалентна спіральному димеру [17]. Такий процес вимагає розриву всіх 28 водневих зв’язків і є дуже енергоємним, та був знову етапі їх утворення. Різниця енергій між двохі односпиральной конформациями невідь що велика, оскільки вони теж мають майже однакову кількість водневих зв’язків. Загалом, можна сказати, що деталі цього процесу остаточно не зрозумілі. Можливо двухспиральная конформація має деяку стабільність в бислое, але грамицидин стає орієнтований в такий спосіб, що здатна сформувати одиночну спіраль, ця конформація стає кращою, отже можна припустити, що спіральна конформація явлвется результатом специфічної взаємодії і орієнтації грамицидина і липида. Теоретичні [70] і экспериметальные [71] дані досліджень з допомогою ліпідів, у яких кисень карбонильной групи заміщений на водень (імітуючи в такий спосіб просту ефірну зв’язок) показали, що одиночна спіраль грамицидина дестабилизированна у тих умовах. Отже взаємодії між карбонильными групами ліпідів й певними регіонами молекули грамицидина необхідні формування канальой структури (одиночній спирали).

2.9.Инженерия грамицидинового канала.

Грамицидин в 90% випадків утворює трансмембранный канал однієї структури, така функціональна та хімічна простота робить її унікальної моделлю вивчення мембраноактивных пептидів і перспективи використання розуміння принципів просторової організації та функціонування мембранних білків загалом і іонних каналів зокрема. Різні еденичные амінокислотні заміни може бути произведенны в грамиицидине без сильного ефекту на структуру і функцію каналу [72], що дає змогу провадити експерименти зі з’ясовування впливу конкретних амінокислотних залишків на властивості грамицидинового каналу. Також можноизучать вплив непротеиногенных (не кодованих генетично) амінокислот [73]. Более того певні зміни первинної послідовності грамицидина дають канали з якісно новими функціями чи конформациями [41]. Було показанно, що, змінюючи первинну послідовність грамицидина, можна зрушувати конформационное рівновагу в мембрані, одержуючи активні канали, освічені приемущественно двухспиральными димерами. Також, модифікація первинної послідовності тяжко впливає электрофизиологические характеристики грамицидинового каналу та дає можливість варіювати тривалість життя і провідність канала[41]. Подальші дослідження різних аналогів грамицидина зі зміненою амінокислотною послідовністю відкрили можливість отримувати потенциалзависимые грамицидиновые канали. Существет два можливих шляху отримання каналів з цими властивостями. Перше: освіту ассиметричных каналів (гетеродимеров), що впливає енергетичний профіль трансмембранного руху іона, роблячи його ассимметричным. Така ассимметрия збільшується за зміни первинної послідовності від центру каналу до його входу (тобто не від Nдо C-концу молекули грамицидина. Другим способом отримання потенциалзависимого поведінки грамицидинового каналу лежить введення у його послідовність сенсора напруги, лише у тому випадку ці сенсори мають трохи менші розміри (одна амінокислота) ніж у «великих» іонні канали, а принцип їхні діяння залишається незмінною. Вищеописані дослідження розмовляють із одного боку про важливість практично всіх амінокислот, які входять у послідовність грамицидина (Не тільки залишків триптофану), і, з іншого боку відкривають нові змогу моделювання структури та функції каналу [41].

2.11.Общее використання у ролі модельної системы Данные останніх досліджень методами дифракції ренгеновских променів, ЯМР-, КБі ІК — спектроскопії, а як і комп’ютерне моделювання і дослідження хімічно модифікованих аналогів дозволяють детально зрозуміти природу структури грамицидинового каналу та його конформационных переходів. Результатом використання такого широкого набору методів є можливість по-новому подивитись конформаційні взамиоотношения в молекулі грамицидина і порівняти його з існуючими моделями.

Озираючись тому, бачимо що це запропоновані спочатку конформаційні моделі коректними, відбивають загальні принципи упаковки полипептидного остова і суперечать експериментальним даним, що дуже важливо задля застосування у дослідженні інших молекул.

В ролі моделі грамицидин використали вивчення липид — білкових взаємодій [77], іонній провідності [78], впливу тривимірної структури на функцію [17]. Але вживати цю модель слід дуже обережно, через маленьих розмірів, молекула грамицидина дуже рухається і принмает безліч конформаций залежно від зовнішніх умов, тоді як «великі» іонні канали, які з довгих полипептидных ланцюгів, котрий іноді кількох субъедениц, мають досить стабільну просторову структуру за умов, близьких до фізіологічним (або мають невеликі варіації прис охороні загального способу укладання полипептидной ланцюга). Отже, визначаючи еденичную тривимірну структуру «великого» каналу ми з великою ймовірністю можемо сказати що ця конформація і становить з себе активний канал. Спочатку було предположенно, що структурно функціональні відносини у грамицидине простішими розуміння, у зв’язку з тим, що ионсвязывающие сайти освічені лише карбонильными групами полипептидного остова, а чи не бічними радикалами амінокислот, і це предположенно, що у зв’язування ионя впливає лише конформація полипептидного остова. За більш детальному исследованиии аналогів зі зміненою первинної послідовністю з’ясувалося, що навіть перебуваючи зовнішньому боці каналу та далеке від сайтів зв’язування бічні радикали амінокислот надають сильний вплив на властивості провідності і конформационной стабільності, що також має бути враховано в модельних исследованиях.

2.12.Практическое застосування грамицидина.

Крім великого фундаментального значення молекули грамицидина для розуміння структурно-функціональних взаємин у мембраноактивных білках, так само знайшов і практичне приминение, знов-таки основанно на каналобразующем властивості цієї молекули. Наведемо лише дві найяскравіших прикладу такого використання. Превое: розробили метод пэтч калмп реєстрації з допомогою грамицидин перфорованих мембран, що дозволяє можливість вивчати аніон проводять канали (такі як GABAі глициновые рецептори) за умов, не затрагивющих їх функції [81]. Друге використання, заснований на сучасних досягненнях органічного синтезу належить до розряду молекулярних нанотехноогий і є створення на основі грамицидинового каналу мембрансопряженного биосенсора [82]. Принцип действя такий наномашины грунтується на переважної структурі грамицидина в мембрані ((6,3-спиральный димер). Основним елементом такого биосенсора є прикріплена до электроду мембрана, у якому вмонтований грамицидин. Одне з мономерів грамицидина закрепленн в нижньому шарі мембрани і такою чином є нерухомим. Друга частина грамицидинового каналу модифікована «що зв’язують агентом» (антиген, антитіло, ліганд) і вільно дифундує у верхній шарі мембрани. При додаванні аналізованого розчину, і про наявність у ньому речовин мають спорідненість до «єднальному агенту», відбувається спецефическое взаємодія, який підвів до інактивації грамицидинового каналу. Таїмо чином, детекция наявності якихабо речовин, у анализируемогом розчині відбувається шляхом виміру провідності грамицидинового каналу. Крім великого практичного застосування дана система може мати велике фундаментальне значення при розумінні принципів передачі через мембрану (як наприклад, у рецепторах пов’язаних із G-белками).

[pic] Малюнок 7. Схема мембрансвязанного биосенсора з урахуванням грамицидинового каналу. А — грамицидиновый канал відкритий, спецефическое зв’язування відсутня. У — сталося спецефическое зв’язування сталося, грамицидиновый канал закрився. Мономери грамицидинового каналу показані червоним кольором; зеленим кольором показано спейсерная група; коричневим кольором показаний «зв'язуючий агент»; синім кольором показаний аналит, спецефически взаємодіє зі «що зв’язують агентом».

1. Hotchkiss R.D., Dubos R.J. 1940, Journal of Biological Chemistry: v.132 p.791 2. Sarges R., Witkop B., 1964 Journal of American Chemical Society, vol.86, p.1862 3. Sarges R., Witkop B., 1965 Journal of American Chemical Society, vol 87, p.2011 4. Sarges R., Witkop B., 1965 Journal of American Chemical Society, vol 87, p.2027 5. Sarges R., Witkop B, 1965 Biochemistry, vol. 4, p.2491 6. Weinshtein P. S., Wallace B., et.al., 1980 Journal of Molecular Biology, vol 143, p1 7. Gross E., Witkop B., 1965 Biochemistry, vol. 4, p:2495 8. Koeppe R.E. II, Paczkovski J.A., Whaley W.L., 1985 Biochemistry, vol.

24, p.:2822 9. Gause G.F., Brazhnikova M.G., 1944 Lancet, vol. 247, p.:715 10. Veatch W.R., Fossel E.T., Boult E.R., 1974 Biochemistry, vol. 13, p.5249 11. Urry D.W., 1971 Proc Natl Acad Sci U P. S A, vol.68, p672 12. Ramachandran G.N., Chandrasekaran R, 1972 Ind. J. Biochem. Biophys., vol.9, p.1 13. Urry D.W., 1971 Proc. Natl. Acad. Sci. U P. S A, vol 68, p.1907 14. Ramakrishnan G.N., Ramachandran G.N., 1965 Biophys. J., v.5, p909 15. Fossel E. T, Veatch W. R, Ovchinnikov Y.A., Buolt E.R., 1974.

Biochemistry, vol.13, p5264 16. Veatch W. R, Boult E.R., 1974 Biochemistry, vol.13, p5257 17. Wallace B.A., 1990 Annu. Rev.Biophys. Biophys Chem., vol.19, p.127 18. Bystrov V.F., Arseniev A.S., 1988. Tetrahedron, vol.44, p.925 19. Langs D.A., 1988 Science, vol.241, p.188 20. Сичов С. В., Невська Н. А., Иорданов З., Мірошников А.І., Іванов В.Т.

1980, Биоорганическая хімія, тому 9, стр. 121 21. Hawkes G.E., Lian L.-Y., Randall E.W. 1987, Eur. J. Biochem., vol.166, p. 437 22. Isbell B.E., Rice-Evans З, et.al. 1972 FEBS Lett., vol 25, p. 192 23. Killian J.A., Prasad K.U., et.al. 1988 Biochemistry, vol.27, p.4848 24. Wallace B.A., Veatch W.R., Boult E.R. 1981 Biochemistry, vol. 20., p.

5754 25. Weinstein P. S., Durkin J.T., et.al. 1985 Biochemistry, vol.24, p. 4374 26. Weinstein P. S., Wallace B.A., Boult E. R, et. al 1979 Proc. Natl. Acad.

Sci. U P. S A, vol. 76, p.4230 27. Weinstein P. S., Wallace B. A, et. al 1980 J. Mol.Biol., vol.143, p.1 28. Wallace B.A. 1986 Biophys. J., vol. 49, p.295 29. Kleinfeld A.M., 1987 Curr. Top. Membr. Tansp., vol.29, p.1 30. Scarlata S.F., 1988 Biophys.J., vol.54, p.1149 31. Veatch W. R, Mathies R., et.al. 1975 J.Mol.Biol., vol.99, p.75 32. Veatch W. R, Styer L. 1977 J.Mol.Biol, vol.113, p.89 33. Masotti L., Spisni A., et.al. 1980 Cell Biopys., vol.2, p.241 34. Bamberg E., Lauger P., 1977 J.Membr. Biol., vol.35, p.351 35. Killian J.A., de Kruijff B., et.al. 1983 Biochim. Biophys. Acta., vol.78, p. 141 36. Cornell B., Separovic F., et.al. 1988 Biophys.J., vol. 53, p. 67 37. Arseniev A. P. S Ovchinnikov Yu, A., Barsukov, I. L. Bystrov, V.

F,.Lomize, A. L. 1985 FEBS Lett., vol.186, p.168 38. Durkin J.T., Andersen O.S., et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.118 39. Szabo G., Urry D. W. 1979 Proc. Natl. Acad. Sci. U P. S A, vol.68., p.672 40. Bradley R.J., Urry D.W., et.al. 1978 Science, vol.200, p.435 41. Koeppe R.E. & Andersen O.S. 1996 Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct., vol. 25, p.231−258 42. Sychev, P. S. V. Barsukov, L. I. Ivanov, V. T. 1993 Eur Biophys J, vol.22, p. 279−88.The double pi pi 5.6 helix of gramicidin A predominates in unsaturated lipid membranes 43. Hladky S.B., Haydon D.A., 1972 Biochim. Biophys. Acta., vol.274, p.294 44. Eisenman G., Sandblom J.P., Neher E. 1978 Biophys.J., vol.22, p.307 45. Mazet J.-L., Andersen O.S., Koeppe R.E. 1984 Biophys.J., vol.45, p. 263 46. Veatch W. R., Durkin J.T. 1980 J.Mol.Biol., vol.14, p.411 47. Hinton J.F., Whaley W.L., et.al. 1986 Biophys.J., vol.50, p. 539 48. Dani. J.A., Levitt D.G. 1981 Biophys.J., vol.35, p.501 49. Hinton J.F., Fernandez J.Q., et.al. 1989 Biophys.J., vol.55, p.327 50. Wallace B.A. 1983 Biopolymers, vol.22, p. 397 51. Hinton J.F., Koeppe R.E. II, et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.571 52. Urry D.W., Trapane T.L., et.al. 1983 Science, vol.221, p.1064 53. Cornelis A., Laszlo P., 1989 Biochemistry, vol.18, p.2004 54. Arseniev A.S., Barsukov I.L., Bystrov V.F. 1985 FEBS Lett., vol.180, p.33 55. Koeppe R.E.II, Berg J.M., et.al. 1979 Nature, vol.279, p.723 56. Wallace B.A., Ravikumar K. 1988 Science, vol.241, p.182 57. Sung P. S. -P.S., Jordan P. З. 198 Biophys.J., vol.54, p. 519 58. Lee W.K., Jordan P. C.1984 Biophys.J., vol.46, p.805 59. Urry D.W., Alonso-Romanovsky P. S., et.al. 1984 J.Membr.Biol., vol. 71, p.205 60. Trudelle Y., Daumas P., et.al. 1987 FEBS Lett., vol.216, p.11 61. Barret Russel E.W., Weiss L.B., et.al. 1986 Biophys.J., vol.49, p.673 62. Ovchinnikov Y.A., Ivanov V.T. 1983 In Conformation in Biology, ed. R.

Srinivasan, R.H. Sarma, p.155, New York: Academic 63. Busath D.D., Andersen O.S., Koeppe R.E.II., 1987 Biophys.J., vol.51, p.79 64. Busath D.D., Szabo G. 1981 Nature vol.294, p.371 65. Busath D.D., Szabo G. 1988 Biophys.J., vol.53, p.689 66. Andersen O.S., Koeppe R.E., et.al. 1987 In Transport through membranes, ed. K. Ygi, B. Pullman, p.295. Tokyo: Academic 67. Wallace B.A. 1985 Biophys.J., vol.45, p.114 68. LoGrasso P.V., Moll F. III, Cross T.A., 1988 Biophys.J., vol.54, p.259 69. Killian J.A., de Kruijff B., 1985 Biochemistry vol.24, p.7881 70. Meulendijks G. Sonderkamp T., et.al., 1989 Biochim. Biopphys. Acta vol.979, p.321 71. Waalace B.A., Veatch W.R., Boult E.R. 1981 Biochemistry vol.20, p.5754 72. Durkin J.T., Koeppe RE II, Andersen O.S. 1990 J.Mol.Biol. vol.211, p.221 73. Fonseca V., Daumas P., et.al. 1992 Biochemistry vol.31, p.5340 74. Mukherjee P.K. & Paulus H. 1974 Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.2.

75. .Sarcar. N et al., 1974 Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.4, pp.1478−1482, 76. Langs D.A. 1989 Biopolymers vol.28(1), p.259 77. Killian J.A., Taylor MJ, Koeppe DE II. 1992 Biochemistry vol.31, p.11 283 78. Finkelstein A, Andersen OS. 1981. J.Membr. Biol. vol.59, p.155 79. Hodges RS, Merrifield RB, 1975 Anal. Biochem. vol.65, p.241 80. Paul BW, Ten Kortenaar, et.al. 1986 Int. J.Pep. Pro. Res., vol.27, p.398.

1. Овчинников Ю. О., Іванов В. Т, Шкроб А. М.; «» Мембрано-активные комплексоны ", Москва, «Наука », 1974, стр.40−47, 174. 2. N. Sarcar et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.4, pp.1478−1482, 1974 3. P.K. Mukherjee & H. Paulus Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.74, no.2, 1974 4. Hladky & Haydon, Nature, vol.255, pp. 451−453, 1970 5. W. R Veatch & E.R. Boult, Biochemistry vol.13 no. 26, 1974, pp.5257−5261 6. D.W. Urry, Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.68 pp.672−676 7. Ramachandran & Chandrasekaran, Ind. J. Biochem. Biophys., vol.9, pp1−11, 1972 8. E. Fossel, W. R. Veatch, Y. A. Ovchinnikov, E. Boult, Biochemistry vol.13 no. 26,.

1974, pp 5264−5275 9. Шепель О. Н. та інших., Биоорг. хімія, 2, 581−593 (1976) 10. Cычев С.В., Фонина Л. А., Іванов В.Т., Биоорг. хімія, 8, 1080−1088 (1984) 11. Ivanov V.T., «From structure towards the molecular mechanism of action », in.

Peptides 1982 12. D.W. Urry, in «Spectroscopy of Biological Molecules », 487−510 13. Wallace B.A. & Boult E.R. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci USA, vol.75, 1775−1779 14. Wallace B.A., W.R. Veatch & E.R.Boult (1981), Biochemistry, 20: 5754- 5760. 15. Сичов С. В., Невська, Иорданов С. Т. та інших. (1980), Биоорг. хімія, 9: 121- 151 16. Arseniev A.S., Bystrov V.F., V.T.Ivanov & Yu.A. Ovchinnikov (1984), FEBS.

(Fed. Eur. Biochem. Soc.) Lett. 165:51−56. 17. Arseniev A.S., Barsukov I.L., Bystrov V.F., A.L.Lomize & Yu.A. Ovchinnikov.

(1985), FEBS (Fed. Eur. Biochem. Soc.) Lett.186: 168−174. 18. Urry D.W., J.T. Walker, & T.L. Trapane (1980), J. Membr. Biol. 69: 225- 231. 19. Arseniev A.S., Barsukov I.L. & Bystrov V. F (1985) FEBS (Fed. Eur. Biochem.

. Soc.) Lett. 180: 33−39. 20. S.V.Sychev, S.V. Sukhanov, L.I. Barsukov & V.T. Ivanov (1996), J. Pep. Sci.

2:141−156. 21. N. Mobashery, З. Nielsen, O.S. Andersen (1997), FEBS (Fed. Eur. Biochem.

Soc.) Lett. 412: 15−20. 22. Cornell B.A.,& M.A. Keniry (1983), Biochim. Biophys. Acta. 732: 705- 710. 23. P. Daumas, D. Benamar & other., (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 38: 218−228. 24. Wallace B. A, (1986), Biophys. J. 49: 295−306. 25. V. Krchnak, J. Vagner, P. Safar & M. Lebl (1988), Collection Czechoslovak.

Chem. Commun. 53: 142−148. 26. K. U. Prasad, P. S. Alonso-Romanovski & other, (1986) Biochemstry, 25: 456−463 27. K. Bauer, R. Roskoski, H. Kleinkauf & F. Lipmann (1972) Biochemistry, 11: 3266−3270. 28. C. G Fields, G.B. Fields & other, (1989) Int. J. Peptide Protein Res., 33: 298−303.