Матеріал і методика досліджень

Дослідження виконані в лабораторії клітинної інженерії Інституту птахівництва Української академії аграрних наук. При цьому використовували гусей великої сірої і рейнської порід, курей порід род-айленд, білий леггорн, юрлівська голосиста, австралорп, голошийна, єреванська, італійська куріпчаста, калiфорнійська смугаста. Годівлю і утримання дослідної птиці проводили за раціонами, розробленими відділом фізіології, біохімії і годівлі птиці Інституту птахівництва УААН згідно із загальноприйнятими нормами.

Сперму від гусаків одержували методом масажу. При її заморожуванні використовували, як контроль, відомий метод технології (Сахацький М.І., 1984). При вивченні можливості заморожування сперми гусаків в облицьованих гранулах в кожній серії досліду використовували по 10 облицьованих гранул, які заморожували зі швидкістю 50°С/хв. до -196°С. При досягненні в процесі охолодження температур -58, -78, -86, -90, -98, -101, -105, -113, -196°С проводили розморожування одного зразка, в якому враховували рухливість і абсолютний показник живучості сперматозоїдів. Одержані дані використовували для удосконалення режиму охолодження сперми гусаків. Для удосконалення режиму розморожування проводили серію лабораторних досліджень, а після цього застосували штучне осіменіння гусок спермою, розмороженою при різних температурах.

Сперму від півнів також одержували методом масажу. Враховували об'єм еякуляту (мл), концентрацію сперматозоїдів (млрд/мл), рухливість (в балах за десятибальною шкалою), кількість клітин з неушкодженими акросомами та мембранами голівок (у відсотках). Концентрацію сперматозоїдів визначали в камері Горяєва або фотоелектрокалориметричним методом. Рухливість сперматозоїдів оцінювали під мікроскопом (х450) в термостолику при 37 °C. Визначення кількості сперматозоїдів з цілими і ушкодженими мембранами голівок здійснювали по методу (Halangk W., Bohnensack R., 1982), з використанням розроблених нами флуорохромів етідіум бромід (2,7-дiамiно-10-етил-9-фенiлфенантрiдiум бромiд) та a-нафтіламіну.

Вивчили ефективність використання як флуорохромів таких сполук: акрiдiновий оранжевий, ауромiн 00, кальцеїн, конго червоний, корiфосфiн, метиленовий зелений, a-нафтiламiн, тетразолiєвий синій, тетрациклiн, тiазiновий червоний, примулiн, хiнiн, флуоресцеїн, еозiн. Кращі результати були одержані при використанні етiдiум бромiду і тiазiнового червоного в концентрації 10−6М і 5×10−4 — 5×10−5М відповідно або a-нафтiламiн в концентрації 5×10−4- 5×10−5М в фосфатно-соляному буфері.

Підготовку сперми до заморожування проводили в холодильній камері, а крiоконсервацію в парах азоту з використанням програмного охолоджувача. Температуру контролювали в одному із зразків хромкраплевою термопарою, яку приєднували до самописця Н-306. Враховували такі параметри: час плато кристалізації зразків (t пл.) і швидкість заморожування (°С/хв.). Розморожування сперми здійснювали у водяній бані при +40°С.

При проведенні досліджень по оптимізації складу захисного середовища застосовували, як контроль, відоме середовище (Курбатов О.Д. та інші, 1984) та метод оптимального планування експерименту з використанням плану Плакетта-Бауера (Адлер Ю.П. та ін., 1976). При вивченні дії осмотичного тиску захисних середовищ на результативність крiоконсервацiї їх осмолярність доводили до 50, 150, 300, 350, 380, 450 мОсм. Штучне осіменіння курей проводили за режимом: два дні підряд, надалі - один раз в 3−4 дні. При цьому кожній із них вводили по 0,12 мл заморожено-відтаяної сперми, що становило 70 — 90 млн. активних сперміїв. Зібрані по піддослідних групах курей яйця інкубували в інкубаторі «Унiверсал-55». Заплідненість яєць визначали на 7 добу їх інкубування овоскопуванням або при розтині.

Як джерело ембріональних клітин використовували ембріони, одержані з яєць курей. Виділення ембріонів з яєць здійснювали методом Lucas і Jamros (1961) за нашою модифікацією. Оцінювали якість ембріональних клітин по співвідношенню цілих і ушкоджених шляхом фарбування етiдiум бромiдом фірми «Gibco». Підраховували біля 200 — 300 клітин. При заморожуванні ембріональних клітин використовували такі хімічні сполуки: диметилсульфоксид (ДМСО), гліцерин (ГЛ), етиленгліколь (ЕГ), пропiленгліколь (1,2-пропандiол) (ПГ). Кінцева концентрація кожного з цих крiопротекторів становила 10%. Суспензію клітин розфасовували в поліетиленові трубки типу «СЖ» (ТУ 6−19−263−427−87) та охолоджували на програмному заморожувачі ЗСП-1. Розморожування зразків проводили у водяній бані при +40°С.

Статистичну обробку результатів досліджень проводили методом Фiшера-Стьюдента (Плохинский Н.А., 1969).