Комбинированное дію солей торію, свинцю й гамма-випромінювання на чоловічі статеві клітини лабораторних мышей

Міністерство загального характеру і професійної освіти Російської Федерации.

Сыктывкарский державний университет.

Хіміко-біологічний факультет.

Кафедра фізіології чоловіки й животных.

Допустити до захисту: зав. кафедрою д.б.н., проф.

_____________В. Г. Зайнулин.

Дипломна работа.

Комбіноване дію солей торію, свинцю й гамма-випромінювання на чоловічі статеві клітини лабораторних мышей Научный керівник: с.н.с., к.б.н. _____________ А. О. Ракин Исполнитель: студентка 153 групи ______________ М. С. Фисуп.

Сиктивкар 2000.

|Введение | | |Глава 1. Огляд літератури | | |1.1. Дія іонізуючого випромінювання на спадкові структури | | |1.1.1. Дія малих доз іонізуючого випромінювання на біологічні | | |об'єкти | | |1.1.2. Біологічна дію гамма-випромінення | | |1.2. Вплив важких металів на генетичні структури | | |1.3. Особливості біологічного дії інкорпорованих | | |радіонуклідів | | |1.4. Комбіноване дію чинників різної природи на клітинні | | |структури | | |1.5. Укладання | | |Глава 2. Матеріали й методи | | |Глава 3. Результати обговорення | | |Глава 4. Висновки | | |Література | |.

Стислі обозначения:

ІІ - іонізуюче излучение.

ДЛМ — домінантні летальні мутации.

ПЛМ — пізні летальні мутации.

РЛМ — ранні летальні мутации.

АГС — аномалії головок спермиев.

ТМ — важкі металлы.

Останнім часом гостра проблема біологічної небезпеки, і, в частковості, генетичної ефективності малих доз мутагенів. До цього часу не існує єдиної думки про наявність чи відсутність «порогової дози», хоча факт «порогової чутливості клітини» не заперечується практично ніким. У цьому найбільшу проблему у вирішенні даного завдання представляє взаємна «інтерференція» трьох відправних точок для формування генетичного ефекту: потужності дози, часу впливу мутагена і стану генотипу. Т.а. залежність «доза-время-эффект» (Бурлакова, 1994) ускладнюється навіть у попередньому етапі оцінки малих доз на біологічні об'єкти, якщо йдеться про природних популяціях. Не кому як відомо, що став саме малі дози, особливо ионизирующие випромінювання (ІІ), є джерелом накопичення генетичного вантажу, що призводить до якісних змін у генетичній структурі популяції й у результаті, для реалізації мікроеволюційних событий.

Слід звернути увага фахівців і на характер біологічного дії мутагена, тобто. на критерій оцінки його впливу організм — фізичний чи хімічний. Якщо ІІ, зокрема ?-випромінювання — суто фізичний чинник, а важкі метали (ТМ) — хімічний, то безумовно змішаним дією мають важкі природні радіонукліди (ТЕРЕН). Причому генетическиїв ефект внутрішнього опромінення, який демонструють ТЕРЕН значно перевищує такою від зовнішніх джерел ІІ за рівних спожитих дозах (Дубинін, 1978; Кузин, 1991 і др.).

Нарешті, оскільки ті чинники у природі практично невідомі і взаємодіють в «чистому» вигляді, необхідно оцінку їхнього впливу на живі об'єкти у поєднаннях друг з одним. До того ж інформацію про комплексному дії ТМ, ТЕРЕН і ІІ у «малих дозах вкрай скудны.

Генетична небезпека ТМ і ТЕРЕН, на відміну токсичного, вивчена на сьогодні недостатньо, і вивести результати таких досліджень досить суперечливі. Особливо мало даних із впливу цих речовин на генеративні клітини, і тканини, відповідальні за зростання ембріональної смертності і, особливо, за накопичення генетичного вантажу на популяціях. Тому безсумнівну важливість набувають дослідження генотоксического дії ТМ, ТЕРЕН і ІІ на гаметогенез, особливо на процес формування чоловічих статевих клітин як значно більше уразливих для мутагенних воздействий.

Бо у природою основному припадає саме мати справу з низьким і помірним змістом ТМ, ТЕРЕН і ІІ, то, при проведенні модельних експериментів дослідження їх генотоксического гонадотропного дії особливий інтерес викликає вплив концентрацій цих речовин на 1−2 порядку нижче полулетальной дози для ссавців (Левіна, 1972), а пролонгованої? -випромінювання — на 2−3 порядку (Кузин, 1991). Найбільш популярним об'єктом в що така дослідженнях є лабораторні ссавці чистих ліній, генетичний поліморфізм в лабораторних популяціях зведений до минимуму.

У даний роботі зроблено спробу досліджувати генотоксическое дію свинцю і торію (як водних розчинів нітрату) і пролонгованої ?-опромінення малої потужності для формування сперматогоний і ранніх сперматоцитов у самців мишей лінії СВА генетичним і цитогенетическим методами. Отже нами вивчалася чутливість статевих клітин, що є на ранніх стадіях сперматогенезу до переліченим мутагенам в «субвитальных» дозах і концентрациях.

1. Огляд литературы.

1.1 Дія іонізуючого випромінювання на спадкові структуры.

ІІ має сильний мутагенным ефектом. Для мутагенного дії спадковий матеріал є головним мішенню. Порушення структурної організації призводить до змін у прийдешнім даного організм, або для її загибелі. Існують гіпотези про виникнення генетичних перебудов. До прикладу, фізіологічна гіпотеза передбачає виникнення мутацій над фазі безпосереднього ушкодження генетичного апарату, але за нетождественной репарації. (Лобашов, 1947). Запропонована В.І. Корогодиным (1966) гіпотеза полягає в пропозиції, що результати зовнішнього впливу — потенційні ушкодження спадкових структур, що переходять у истинные.

Первинні ушкодження спадкового матеріалу, викликані ІІ, полягають у однеі двунитевых розривах глюкозидной через відкликання наступним видаленням підстав з полімерної ДНК; які утворюються деструктивні підстави, «апуриновые, амидопириповые ділянки можуть бути субстратом для специфічних эндонуклиаз. Азотні підстави пошкоджуються удвічі - три частіше, ніж однонитеевые розриви фосфодиэфирных зв’язків. Натомість однотиевые розриви формуються на 1−1,5 порядку частіше, ніж двунитевые (Жестяников, 1979). Найбільш радиоустойчивы — нуклиазидные зв’язку в нуклеїнових кислотах, вони у 7−9 раз стабільніше, ніж фосфодиэфирные (Кузин, 1973).

Відповідно до теорії Д. Кроузера (Лі, 1963) первинним актом є потрапляння кванта енергії у певну структуру, і іонізація, що викликає ушкодження, виникає саме у ній. Проте після відкриття репарационных ферментних систем стали очевидні можливість виникнення прихованих ушкоджень. які завжди завершуються проявом адекватного радиогенетического ефекту (Корогодин. 1966).

Структурно-метаболическая теорія передбачає можливість, як у слідство радіохімічних процесів в ядрі клітини формуються речовини, викликають ушкодження структур ДНК і ДНП (Кузин, 1973).

У остаточному підсумку, ушкодження формуються в несгабильной структурі, результат якого може або виникненням точковых мутацій і формування хромосомних аберацій, або первинні зміни може бути репарированы. До чого залежність виходу точковых і хромосомних мутацій обумовлена різними механізмами виникнення цих двох типів мутацій. Наприклад, різна потужність дози важить для виходу точковых мутацій у дрозофіли, тоді, і рівень аберрантных перебудов збільшувався паралельно зі збільшенням потужності дози гамма-облучения. Схожі результати при обробці лінійних мишей рентгенівськими променями отримали П. Буул і Дж. Гудзварт (Buul, Goudzwart 1986, цирк. по Ракину).

Зокрема, наявність гена, порушує рекомбінацію, під впливом гама променів не викликала збільшення частоти РЛМ у дрозофіли, хоча вихід гиперплоидных самців у своїй був різний (Miyamoto, 1983, цит, по Ракину).

На виразність радиогенетического ефекту має значний вплив митотическая активність клітини. Чим більший часу проходить між поділами клітини, тим більше подій аберрантной природи (Gaulden, Weber, 1984, цирк. по Ракину).

Безумовно і те, що індукція хромосомних аберацій залежить від диференціювання клітин. Велика резистентність великих лімфоцитів по порівнянню із малими пояснюється лише тим, що в тих у процесі диференціації сильно зростає щільність спирализации ДНК, що веде до втрати здатність до эксцизионной репарації (George e.a.; 1987, цит. по Ракину).

Неоднакова радіочутливість клітин різних тканин однієї й тієї організму. Це чітко показав І. Буул при порівнянні реакцію опромінення сперматоцитов і клітин кісткового мозку мишей, на минулих утворюється в 4,5 рази більше аберацій, ніж у статевих клітинах. Аналогічна ситуація і при порівнянні сперматоцитов і клітин рогівки ока миші. Таке невідповідність можна пояснити різної активністю репаративных ензимів в тканинах що виконують різні функції. Частота виникнення аберрантных перебудов лише у про ту ж хромосомі і негомологичных парах хромосом одного геному то ж различна.

Вихід хромосомних аберацій може залежати від параметрів, як-от підлогу особини (Ватти, 1987), вік, фізіологічним станом клітини, і організму загалом. Проте хромосомні аберації можуть бути і прямого впливу ІІ з допомогою дестабілізації ланцюга ДНК, індукованої внаслідок втрати чи модифікації нуклеотидів, або освіту ДНК-межнитевых сшивок чіпа димеров тиміну (Liu, Heddle, 1981, цит. по Ракину).

З цих фактів можна припустити, що з дії ІІ на ДНК, первинні реакції розпочинаються з ушкодження азотних підстав. У наслідок нерепарируемые ушкодження фіксуються як точковых мутацій, іншу частина поломок внаслідок роботи репаративных систем перетворюється на хромосомні перестройки.

1. Дія малих доз іонізуючого випромінювання на біологічні объекты.

Хронічне дію малих доз ІІ на організм також небезпечно, як і однократне вплив мега-дозы випромінювання. Аналіз даних про виходах генетичних ушкоджень показує «немонотонную» залежність виходу мутацій від дози радіації (Зайнуллин, 1998). Наприклад, частота хромосомних аберацій в кореневої меристеме проростаючих насіння овсянницы луговий, зібраних з гама — поля, виявилася вищою проти контролем, а проте ця залежність який завжди була монотонної. Частота хлорофильных мутацій серед сходів облучившихся насіння, навпаки виявилася нижче контрольного рівня. Це пов’язана, і з високим полиморфизмом даного показника, типовим для дикорослих видів, і з явищем гомозиготации у «малих ізольованих популяціях (гама — полі) (Зайнуллин, 1993).

Досліджуючи лінії дрозофіл спонтанний рівень домінантних леталий може коливатися (Ватти, 19б5). За відносно низькому тлі радіації можна знайти підвищення рівнів домінантних леталий (Шевченка, Померанцева 1985).

Хронічне опромінення в червоних дозах призводить до помітному зміни величини генетичного вантажу. Водночас зі збільшенням частоти мутацій (летальних, полулетальных) знижують життєздатність, можливо збільшення частки супервитальных мутацій, що призводять до підвищенню жизнеспособности.

При випромінюванні реакції мишоподібних гризунів на хронічне опромінення в малих днях показано, що у вона найчастіше характер залежності «доза — ефект» має нелінійних характері і багато чому визначається генотипом тваринного. Це можна спостерігати на полевке-экономке (зі стабільним генотипом) виварского змісту, мишоподібних гризунів із зони сильно забрудненій (Зайнуллин, 1998).

Частота виходу мутацій то, можливо обумовлена різною радиочувствительностью клітин (соматичних і статевих), і навіть активністю репарационных систем, стабільністю геному, фізіологічним станом організму (Шевченка, 199б, Померанцева, 1969).

СФ — промені і органічні перекису викликають мутації нуклеїнових кислот (Ауербах, 1978).

Є низка хімічних агентів, які отримали назву «супермутагенов», до яких належать пестицды, этилметасульфонат, этиленамин та інші (Шварцман, 1973). У цьому поєднанні ІІ і супермутагены виявляють або аддитивный або синергический ефект, протилежним дією є радиопртекторы. Їх дія грунтується на перехоплення кванта енергії, електронів, або що утворюється внаслідок їхні діяння вільного радикала. До цих речовин ставляться тиолсодержащие сполуки, вітаміни тіамін і цианобеламин, иденовые сполуки. Радиопртекторы знижують ймовірність формування летальних ушкоджень кісткової та вже сформованих потенційно летальних ушкоджень у результаті стимуляції систем пострадиационного восстановления.

1.1.2. Біологічна дію гамма-излучения.

Гама — промені, творяться у результаті радіоактивного розпаду атомних ядер. Вони мають високої енергією і може проникати у тканини. Водночас зіштовхуються з атомами, викликають вивільнення електронів й освіту позитивно — заряджених вільних радикалів чи іонів. Ці заряджені частки зіштовхуються коїться з іншими молекулами, наслідком чого стане у себе вивільнення нових електронів. Тому вздовж треку високо — енергетичного променя формується стрижень іонів, який проходить живі тканини. Така трансформація електронної мережі викликає різних структур у клітині, зокрема мембранного комплексу, органел і ДНК.

Вирізняють найбільш радіочутливі органи клітини, і навіть внутрішньоклітинні системи та процеси (перекисне окислювання ліпідів, розпад ДНК, автолиз білків) (Кудряшов, 1987). Характер ушкоджень структур залежить від рівня складності - її просторової организации.

ДНК — це лабильная, складна, надмолекулярна четвертичная структура; визначального чинника в радиочувствительности ДНК є його просторова організація у складі хроматина, її упаковування й зв’язку з клітинними органеллами, з біологічними мембранами,.

Біологічним мембран виділяється з основних функцій якої для клітини життєво — необхідної (бар'єрна, транспортна, рецепторно — сигнальна, регуляторно — ферментативна). У міру збільшення дози гама — випромінювання спостерігається придушення механізмів активного і пасивного транспорту, порушується проникність іонів калію. (Chapmenn, Stuurrock, 1972, цит. по Кудряшеву), Важливим у дослідженні біологічних мембран є оцінка їхньої структурно — функціональних взаємодій з ДНК. Ця «пара» виступає якби як єдиної гігантської системи, кооперативно реагує на поглинання енергії ІІ, Порушуються ДЕ1Кмембранні взаємодії, відбувається денатурація і деструкція макромолекул, порушення їхніх функцій в опромінених клітинах (Владимиров, 1972).

Основним властивістю гама — променів був частиною їхнього здатність руйнувати злагодженість біологічних реакцій, їх взаємозв'язок, порядок, пошкоджувати регуляторні функції системы.

Жива система втративши «контролю» перестає існувати (Хансон, Комар, 1985).

Принаймні ускладнення біологічної організації гама — промені сприяють утворенню відкладень і дії активних радикалів води та ліпідів, радиотоксинов, посиленню автолитических процесів, порушення клітинної і нейрогуморальної систем регуляції. (Кудряшов, 1985).

Слід зазначити, що гама — випромінювання вражає органи, клітини, і структури тісно взаємозалежні з функціональної активністю, наприклад, радиорезистентных «некритичних систем» (нейрогормональной системи, печінки, опасистих клітин та ін.), збереження в облученном організмі початковий період поразки (Корогодин, 1966).

Найбільш радиочувствительным процесом при гама — лікуванні є процес вільнорадикального перекисного окислення ненасичених ліпідів — липопероксидация (Владимиров, Арчаков, 1972). Гама — випромінювання інтенсифікує пероксидацию ліпідів, внаслідок утворюється надлишок ліпідних токсичних речовин, настає деструкція мембрани (Ясуо Кагава. 1935, цит. по Кудряшову).

Надійність живих систем щодо який уражує дію гама променів забезпечується активністю захисних ресурсів системи — біогенних амінів, тиолов, гормонів, ендогенних антиокислительных і антирадикальных систем (Гончаренко, Кудряшов, 1980).

1.2. Вплив важких металів на спадкові структури организма.

Важкі метали за останні десятиліття є з самих поширених чинників забруднення довкілля. У зв’язку з цим назріла нагальна потреба на цілий ряд питань про рівень генотоксической небезпеки багатьох речовин, які включають до своєї структури іони ТМ. Думки різних дослідників про генетичної активності ТМ неоднозначні, оскільки функціональна роль металів в організмі остаточно ще выяснена.

Відомо, що фізіологічна роль деяких ТМ забезпечується їх через участь у клітинних структурах. Так, поруч із загальновідомими мікроелементами, котрі представляють атоми Мn, Fе, Ni, Сu, Мо, Zn, і Сr, надають стабілізуюче дію на подвійну спіраль ДНК, і навіть граючих значної ролі у створенні третинної і четвертичной структур хромосом (Вільямс, 1975), можлива й визначено роль ТМ в регуляції внутрішньоклітинних процесів, зокрема, як було зазначено показано Мазиа (Маzia, 1954) (цит. по: Ракин, 1990) кобальт і нікель регулюють кроссинговер, перешкоджаючи виникненню структурних порушень ниток ДHК.

Метали здатні зв’язуватися і з білковими структурами. Так було в 1977 року в цитолизосомах кишкового епітелію личинок дрозофіли знайшли білкові освіти, містять іони міді (Тарр, Носkaday, 1977). Було висловлено пропозицію, що це протеїди, названі металлотионинами, є клітинними детоксикантами. Правильність цієї пропозиції була підтверджено 1987 року, коли було знайдено різке зниження концентрації низькомолекулярних комплексів срібла і ртуті, впроваджуються пацюкам як запалів, під впливом мідь — і кобальт містять металлотионинов (Sugawara, 1987) (цит. по: Ракин, 1990).

На думку Д. Вільямса (1975), метали як мікроелементів можуть перебувати у вигляді вільних іонів, виконуючи регуляторні функції у клітині. Проте Б. Халлиуэл (1987), вважає, у вигляді вільних радикалів ТМ з’являються у організмі дуже рідко, причому відбувається це на прикладі руйнації існуючих раніше комплексів і є у цьому виді найсильнішими клітинними ядами.

Справді, майже всі метали, які у клітину, відразу зв’язуються в органічні комплекси, навіть перебувають у вигляді нерозчинною солі. Такі ковалентные і координатні комплекси виявляють як стимулюючу, а й гнітючу активність, яка складалася переважно залежить від атомарної є і электроположительности катионів металів (Talukderg, 1987) (цит. по: Ракин, 1990). Резюмуючи дані про генотоксической активності різних ТМ можна дійти невтішного висновку, що ці речовини, приймаючи форму органокомплекса, починають виявляти мутагенних свойства.

Розглядаючи механізми ушкодження спадкових структур можна сказати, що під впливом ТМ відбувається ушкодження третинної структури хромосом, що веде до часткової денатурації ДНК. При зв’язуванні двох валентных ТМ з ДНК можливі мутації типу транверсий і транзиций (Лерина, 1972). ТМ можуть викликати хромосомні аберації, индуцировав точковые мутації, порушувати ферментні взаємодії, ингибируя окремі ензими. У цьому дотримується виборча блокування ферментних систем. Кожен із металів чи діє у суворо визначених структурних точках ензимів, унаслідок чого з’являється можливість підключити інші ферментні системи, щоб компенсувати такі взаємодії. ТМ взаємодіючи з ферментними системами, можуть заміщати активний центр. ТМ, перебувають у цитоплазмі, змінюють насиченість вільними радикалами у бік їхнього уменьшения.

Яскравим прикладом клітинних змін є свинець, який має гонадотоксическим дією (Харченко, Андрєєва, 1987). Відзначено здатність свинцю, який володіє великим спорідненістю до електрону, блокувати вступ у клітину кальцію межі зовнішньої клітинної мембрани. Ингибирующее дію свинцю на процесі синтезу ДНК і РНК пояснюється придушенням їм активності, полимераз. Ацетат свинцю може індукувати рецессивные зчеплені зі статтю летальні мутації (Jacobson — Kram, Montalbano, 1985). Нітрат свинцю у «малих концентраціях викликає підвищене рівня домінантних і рецесивних летальних мутацій у дрозофіли (Ракин, 1990).

1. Особливості біологічного дії інкорпорованих радионуклидов.

Природні радіонукліди є хімічними токсикантами. Мають здатністю випромінювати ІІ. Радиотоксический ефект інкорпорованих радіоактивні речовини перевищують ефект від участі зовнішнього опромінення (Рамад, 1981). Влучаючи радіонуклідів у організм, опромінення може тривати досить в перебігу усього життя. Потужність дози опромінення зменшується зі временем.

Широкі дослідження на тварин показали, що прояв биоэффектов при інкорпорації радіонуклідів, залежить від фізичних властивостей (тип і енергія випромінювання), дози, форми який вводимо сполуки, шляху й ритму надходження, особливостей розподілу, ефективного періоду піврозпаду, визначального тривалість променевого впливу, фізіологічних і генетичних особливостей організму. Наприклад: торій. Період піврозпаду торію Т=1,39*1010. Тож у більшою мірою можна говорити про його токсичності, ніж про радіаційному чинник. Тривалий контакт гризунів з природним торієм призводить до посиленню репаративных процесів в організмі, що цілком не компенсує порушення фізіологічного гомеастаза (Верховская та інших., 1965). Безумовна значення має тут вид, у якому торій вступає у організм, саме супроводжуючий його аніон. Велику біологічну небезпеку становлять неорганічні сполуки торію, ніж комплексы.

Биоэффекты зазвичай спостерігаються при накопиченні в тканинах радіонуклідів в дозах, що перевищують гранично припустимі у тілі чоловіки й тварин. Зі збільшенням дози радіонуклідів сповільнюється регенерація сперматозоїдів, зменшується маса сім'яників. Такі ефекти виявлялися при запровадження у організм Се, спостерігалося зменшення маси сім'яників пацюків на б0% проти контролем. Також атрофія сім'яників у пацюків якщо радионуклидом Сs (Москалев, 1985).

По прибутті у організм НТО з питною водою, виявлено атрофічні зміни у насіннєвих канальцах, їх нащадки мали менші розміри тіла, і були піддаються інфекції, вони часто розвивалися инвазионные пухлини кишечника, основу яких лежали спадкові зміни статевих клітин (Mewissen, 1983, по Москалеву, 1991). НТО може індукувати Д М на постмейотических стадіях сперматогенезу і реципрокные транслокации в сперматогониях.

Гистологически в сім'яниках пацюків після введення плутонію виявлено канальцы з порушеним сперматогенезом і зміненим співвідношенням різних форм клітин. Зміни сперматогенезу насамперед належать до системі сперматогония-сперматиды. Початкова стадія сперматогенезу редукована, ще більш зменшено генерація сперматоцитов першого порядку. У цих клітинах порушений мейоз, про що свідчить наявність двуядерных сперматоцитов і клітин із великим ядром. Кількість клітин Лейдіга збільшена, що морфологічним вираженням дисгормональной перебудови ендокринної частини яєчок. Мелкоклеточная лимфоцитарная інфільтрація строми свідчить про аутоімунних процесів у цьому органі, завершающихся деструкцією статевих клітин, у результаті порушаться запліднення (Райцина 1985 по Москалеву, 1991).

Особливістю біологічного дії інкорпорованих радіонуклідів визначається активної роллю організму у формуванні тканинних доз через наявності транспортних иметаболических процесів, які обумовлюють накопичення, прояв ефектів, виведення радіонуклідів з певних органів прокуратури та тканей.

2. Комбіноване дію чинників різної природи на клітинні структуры.

Розглядаючи багатоклітинні організми як сукупність взаємозалежних між собою клітин, що є різних стадіях розвитку, можна було зрозуміти важливість пізнання проблеми сукупної дії чинників різної природи на клітинні структури. Проблема комбінованої дії чинників фізичним і хімічної природи на клітинні структури нині актуально з погляду радіобіології та медичної екології. Дослідження ефектів клітини нам дійти висновків його стан, отже й про организме.

Поєднане дію фізичних і хімічних факторов.

У представлених науковим комітетом ООН по ефектів атомної радіації в звітах (UNSCEAR, 1982, цит. по Ракину), виділено два класу кількісної оцінки ефектів сукупної дії різних чинників: 1. Спостережуваний ефект зумовлений дією обох агентів (ІІ і кофактором). Тут відзначаються три приватних випадку сукупної дії чинників: а. інтегральний ефект дорівнює за значенням сумі ефектів роздільнодіючих софакторов (аддитивность); б. інтегральний ефект виражений менш, чому це б можна говорити про при додаванні результатів дії чинників порізно (антагонізм); в. інтегральний ефект перевищує за значенням суму ефектів, діючих незалежно софакторов (синергизм).

2. Цей клас включає спостережуваний ефект — результат модифікування дії однієї з агентів іншим, неактивним самим собою. Сюди відносяться два варіанта з протилежним дією: а. різке зниження ИЭ неактивним агентом (протекція); б. різке зростання ефекту неактивним агентом (сенсибилизация).

Комбіноване дію ІІ і фізичних факторов.

Поєднання факторів, і їхні діяння на живої об'єкт може мати різний характер. Наприклад, при дії лазерного випромінювання та гама — променів З на дріжджі P. S. Сеrеvisae кількох штамів відзначений аддитивный характер взаємодії чинників по виживання (Петін, 1987).

У експериментах, виконаних на Zea mays, при дії цей об'єкт ультразвуку і рентгенівських променів також вказано аддитивный ефект. Інші дослідники виявили синергізм дії ультразвуку і ІІ на клітини кишкової палички і ссавців (Martins е.а., 1977, Graid, 1977). Виявивши синергізм, автори відзначили, що й ультразвук викликає мембранні ушкодження, то ІІ - ядерні, тобто синергізм то, можливо результатом цих двох типів повреждений.

Гіпертермія є сенсибілізуючу агентом. Проте клітини ссавців чутливіші до впливу температури і ІІ по порівнянню з дрожжевыми. Проведені В. Г. Петиным дослідження на диплоидных і гаплоидных штами дріжджів E. magnusii, Z. Bceilli, підтверджують висновок про синергичном характері взаємодії гіпертермії і ИИ.

Слід очікувати, міцно ионизирующие випромінювання викликають велику частку необоротних ушкоджень, ніж рідко ионизирующие.

Спільне дію ІІ і хімічних агентов.

Таке дію викликає різні ушкодження у клітині зокрема, така комбінація іприт і рентгенівські промені дає подібності генетичних ефектів оскільки діють безпосередньо на мішень, тобто «розривають>> хромосоми. При взаємодії ІІ з азотної кислотою відбувається у РНК — генах заміна підстав. У ДНК спарювання уроцила з аденином призводить до транзиции гуанін — цитазин на аденін — тимин (Ауербах, 1978), як і азотна кислота може індукувати делеции, оскільки він сприяє поперечному сшиванию двох ланцюгів ДНК (Schuster, 1960, цит. по Ауэрбаху).

СФ — промені і органічні перекису викликають мутації нуклеїнових кислот (Ауербах, 1978).

Є низка хімічних агентів, які отримали назву «супермутагенов», до яких належать пестициди, этилметасульфонат, этиленамин та інші (Шварцман, 1973). У такому поєднанні ІІ і супермутагены виявляють або аддитивный або синергический ефект, протилежним дією є радиопртекторы. Їх дія грунтується на перехоплення кванта енергії, електронів, або що утворюється внаслідок їхні діяння вільного радикала. До цих речовин ставляться тиолсодержащие сполуки, вітаміни тіамін і цианобеламин, иденовые сполуки. Радиопртекторы знижують ймовірність формування летальних ушкоджень кісткової та вже сформованих потенційно летальних ушкоджень у результаті стимуляції систем пострадиационного восстановления.

1.5.

Заключение

.

Мутагенчувствительность сперматогенных клеток.

Дослідження генетичних ефектів у процесі гаметогенеза, індукованого радіацією, дозволили визначити радіочутливість різних стадій цього процесса.

Під час вивчення різних видів генетичних ушкоджень (ДЛМ, РЛМ, ПЛМ) було виявлено, що з самців мишей статеві клітини що є різних стадіях сперматогенезу, розташовуються принаймні зростання генетичної радиочувствительности у порядку: сперматогонии, сперматоциты, сперматозоїди, сперматиди (Померанцева, Рамайя, 1969).

Причини різної генетичної радиочувствительности статевих клітин, що є різних стадіях гаметогенеза, ще остаточно не зрозумілі. Результати досліджень дозволили припустити, що це причини обумовлені комплексом чинників: особливостями метаболізму клітин, ступенем конденсації хромосом, рівнем насичення клітин киснем, відносної тривалістю стадій ядерного циклу, чутливістю до летальному ефекту радіації, кількістю радиозащитных речовин, у цитоплазмі, інтенсивністю роботи системи репарації (Шапіро, 1964).

Сперматозоїди чутливіші, ніж оогонии, т.к. несуть генетичну інформації і накопичують генетичний вантаж. У оогониях менше порушень, т.к. вони відразу закладаються в організмі певному кількості та більш захищені природою. Сперматозоїди є основним вкладником мінливості. Вони часто виникають мутації нейтральні, але бувають несприятливі. Тому менш конкурентоспроможні при проникненні в яйцеклітину (Ватти, Тихомирова, 1976).

На радіочутливість статевих клітин великий вплив можуть надавати біохімічні перетворення, які у процесі гаметогенеза. Так було в сперматидах відбувається заміщення муцинбогатого гистона соматичного типу новим типам гистона, характеризующимся містило велику кількість аргініну (Кузин, 1973).

У статевих клітинах самців мишей, які піддалися впливу мутагенів чи рентгенівських променів, рівень дисоціації ДНП і денатурації ДНК знижується по мері трансформації сперматогониев в спермоциты й спермії. Ці зміни супроводжуються зміцненням нуклеопротеидного комплексу. (Склянок, 1977).

При вплив хемотерапевтических препаратів мутації виявляється у сперматогониях, т.к. вони більше чутливі. Клітини більш пізніх стадіях розвитку, коли перебувають у процесі мейотического розподілу більш резестентны. Слабко пролеферирующие стовбурні сперматогонии виявляють середню чутливість (Messtrich, 1984).

Стовбурові сперматогонии при вплив малих доз гамма-проміння від 0 — 8 Грн були в 6 раз більш резистентними, ніж клітини кісткового мозку в хомячка.

Отже механізми мутагенного дії ІІ і ТМ на генетичні структури біологічних об'єктів носять різний характер. Порушення спадкового апарату при дії цих речовин порізно, зазвичай, мають різну природу, проте, механізми репарації таких ушкоджень єдині, і вихід мутацій обумовлений саме здатністю клітини компенсувати шкода, завданий мутагенами. При сукупний дії ТМ і ІІ часто вступають з ефекти протекції і сенсибілізацію. У цьому велике значення мають дози і концентрації (їх співвідношення) діючих спільно чинників (Витвицкий та інших., 1996). А загалом досконально механізми взаємодії мутагенів не выяснены.

2. Матеріали й методы.

Робота використовували мишей лінії СВА у віці 3 — 3,5 міс. Нітрат свинцю і торію в концентраціях 0.03, 0.1, 0.3 г/кг ваги (враховуючи зміст іона свинцю Pb2+ і торію Th4+ вводили самцям з питвом і опромінювали гамма-излучением 1,8 Грн протягом месяца.

Після закінчення 30 діб після зняття впливу (тривалість сперматогенезу в миші - 35 діб) по 5 самців з кожної групи отсаживали індивідуально із чотирьох — 5-ту одновозрастными інтактними самками визначення рівня ДЛМ. Через 16 — 18 днів від початку спарювання здійснювали забій самок і підрахунок жовтих тіл в яєчниках, і навіть живих ембріонів і резорбций в матці. По процентному співвідношенню цих показників визначали ембріональну смертность:

. ранні домінантні літали (РДЛ) = сума ембріонів і резорбций / кількість жовтих тел.,.

. пізні літали (ПДЛ) = кількість резорбций / кількість жовтих тел.,.

. загальна ембріональна смертність (ДЛМ) = кількість ембріонів / кількість жовтих тел.

По 10 самців через 35 діб після зняття впливу забивали для визначення рівнів АГС. При приготуванні використовували стандартну методику (Soares et al., 1979) в модифікації А. О. Ракина: эпидидимус самця змаліли на годинному склі в 2−3 краплях фізрозчину, потім додавали 2−3 краплі 10-відсоткового воднорастворимого эозина, після чого піпеткою відокремлювали емульсію і переносили в препаровальное скло, розподіляли ним і висушували при кімнатної температурі. Готовий препарат аналізували під мікроскопом, підраховували кількість аномалій в вибірці з 500 спермиев.

Статистичну обробку даних проводили із застосуванням стандартного пакета програм «Microsoft Excel — 7 », визначення достовірності відмінностей використовували критерій малих доз Фішера (Плохинский, 1980).

3. Результати і обсуждение.

Дослідження генотоксической ефективності іонів свинцю, вводяться у організм у субвитальных концентраціях (1 — 10% ЛД50/30) (Левіна, 1972), зосереджена найбільш вразливою стадії сперматогенезу — етапі формування сперматоцитов (померанцева та інших., 1988). У цьому плані терміни тестування ДЛМ і АРГ мають забезпечувати детекцию мутаційних подій, які мають подібні механізми реалізації (Мендельсон, Сергєєва, 1990). Слід зазначити, що застосовувані нами концентрації нитрат-иона не є мутагенними (Ракин, 1990), що дозволяє розглядати як генотоксического чинника лише який міститься у поєднанні свинец.

Домінантні летальні мутації. Оскільки доімплантаційна (ранні домінантні літали) (РЛД) і постимплантационная загибель ембріонів (пізні домінантні літали) (ПДЛ), зазвичай результат порушення різних спадкових механізмів, ми визнали за необхідне розподілити їх на анализ.

1). У таблиці 1 на малюнку 1 представлені результати визначення рівнів РДЛ, ПДЛ і сумарних леталей (ДЛМ) у груп самців, підданих запалу свинцем у різних концентраціях. Як із представлених даних, РДЛ у 1-му, 3-му і контрольному варіантах показники досвіду мало відрізняються. Виключення становлять результати аналізу цих параметрів в варіанті 2, частота РДЛ. І тут достовірно нижче він у контролі (Р (0,001). Оскільки фізіологічне стан интактных самок, як у експерименті було однаковим, можна припустити, що з самців з варіанта 2 відбувається зниження запліднюючої здібності сперміїв або внесення в зиготу таких порушень геному, які перешкоджають дробленню яйця (Шевченка, Померанцева, 1985). Отже, критерієм РДЛ генетично ефективною була концентрація свинцю 0,1 г/кг.

При аналізі ПДЛ, є на думку багатьох дослідників істинними домінантними леталями (Ватти, 1965; Мендельсон, Сергєєва, 1990; Ракин, 1990; Померанцева, Рамайа, 1993; та інших.), було виявлено тенденція зниження ефекту зі зростанням концентрації свинцю. Найменша частота ПДЛ зафіксовано у варіанті 1 (5,7%), а найбільша — у варіанті 3 (12,1%) (Р (0,05). у своїй значення леталей у контролі немає достовірних відмінностей з цими, отриманими під час аналізу результатів кожного окремо взятого варіанта досвіду. Можна відзначити, що генотоксичность мінімальної концентрації початку більше, ніж максимальної, а, по відношення до контролю ефективність свинцю (критерієм ПДЛ) несущественна.

Зблизька сумарних значень ДЛМ простежується дозовая динаміка порушень, схожа з такою РЛМ, коли концентрація свинцю 0,1 г/кг індукує статистично достовірно менше ушкоджень, аніж за спонтанному мутагенезі (Р (0,05). Підвищення частоти ДЛМ в варіантах 1 і трьох проти контрольним значенням параметра не достоверны.

Такі нелинейные ефекти виходу генетичних порушень були дуже показові та інших дослідженнях (Петін, 1997; Гераськин, 1996). У нашому випадку при концентрації свинцю в інтервалі від 0,03 до 0,1 г/кг, найімовірніше перевищено той «поріг поражаемости «для типу порушень, манливих у себе формування ДЛМ (реципрокные транслокации і великі хромосомні аберації) (Шевченка, Померанцева, 1985). При подальшому підвищенні концентрації початку репаративные системи не справлялися із зростаючим кількістю мутаційних подій, що призвело до підвищення рівня нарушений.

2). При гамма-випромінювання тварин виявлено значне збільшення рівнів ембріональної смертності (всіх етапах) проти контролем (Р (0,001) (див. Табл. 3 і рис. 3). Це явно свідчить про високої мутагенної активності ІІ даної інтенсивності. Вочевидь, що репаративные системи клітин неспроможні були цілком компенсувати повреждающее дію гамма-излучения.

3). Комплексне вплив ІІ в дозі 1,8 Грн і свинцю в концентраціях 0,3 і 0,1 г/кг (див. Табл. 3 і рис. 3) виявило значний генотоксический потенціал поєднань даних мутагенів за критеріями РДЛ і ДЛМ (Р (0,05). У той водночас результати обробки мишей свинцем у концентрації 0,03 г/кг в поєднанні з гамма-облучением дозволяють дійти невтішного висновку про низькою мутагенної активності даного поєднання які впливають чинників. Відтак можна з упевненістю дійти невтішного висновку, що «поріг поражаемости «сперматогониев меншою за критеріями РДЛ і ДЛМ при вплив гамма-випромінення в дозі 1,8 сГр перебуває у проміжку концентрацій свинцю 0,1 і 0,03 г/кг. Аналіз рівнів ПДЛ переважають у всіх варіантах комплексної обробки мишей не виявив статистично достовірних відмінностей із частотою цих порушень у контрольній групі, що дозволяє: зробити висновок про низькою генетичної ефективності сукупної початку при індукції постимплантационной гибели.

Дослідження монотонностей дозових залежностей виходу РДЛ зв ДЛМ однозначно свідчить про їхнє лінійному характері (r рдл = 0,9011 (P.