Методы виміру іонних токов

МІНІСТЕРСТВО СПІЛЬНОГО І ПРОФЕСІЙНОГО ОБРАЗОВАНИЯ.

РОСІЙСЬКОЇ ФЕДЕРАЦИИ.

НИЖЕГОРОДСЬКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЧЕРВОНОГО ЗНАМЕНИ.

ДЕРЖАВНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ЇМ. Н.И.ЛОБАЧЕВСКОГО.

БІОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ.

КАФЕДРА БИОФИЗИКИ.

Реферат на тему.

Методи виміру іонних токов.

Виконав студент.

4 курсу гр.144−7.

Савін А.В.

Нижній Новгород.

1. Метод фіксації потенциала.

Для вивчення потенциалзависимых мембранних каналів застосовується метод фіксації потенціалу. У цьому методі використовують електронну систему з зворотної зв’язком, що забезпечує автоматичне підтримку мембранного потенціалу. Різниця потенціалів з різних боків мембрани фіксують певному рівні, у своїй мембранний потенціал можна східчасто змінять на суворо певну величину. Такий метод дозволяє виміряти іонні струми, які відбуваються крізь мембрану через канали, які активуються за зміни потенціалу. Відповідно до законом Ома, якщо напруга на мембрані постійно, зміни струму однозначно пов’язані з змінами провідності. Натомість, ми можемо фіксувати мембранний потенціал на різних рівнях і вимірювати які під час цьому струми. Якщо ж використовувати розчини з различенным іонним складом, і препарати, вибірково блокуючі той чи інший канал, можна вивчатиме поведінку різноманітних іонних каналів, якими протікають обчислювані нами струми. Технічно фіксація потенціалу здійснюється так. При допомоги усилителя-регулятора внутрішньоклітинний потенціал порівнюють із управляючим потенціалом (див. мал.1). Будь-яке відхилення мембранного потенціалу від управляючого посилюється і виході підсилювача виникає управляючий струм. Цей струм тече через електроди, розташовані на різні боку мембрани у тому напрямі, що мембранний потенціал знову стає рівним управляючому. Таке автоматичне узгодження відбувається поза частку мілісекунди по тому, як задається ступінчастий управляючий потенциал.

Когда у відповідь таку ступінчасту деполяризацию відкриваються натрієві (або інші) канали, відповідні іони входить у аксон по электрохимическому градієнту і переносять з собою електричні заряди. Ці вхідні заряди прагнуть зрушити мембранний потенціал на позитивному напрямі, проте найменше відхилення від управляючого потенціалу негайно компенсується внаслідок видалення з клітин надлишкових зарядів з допомогою усилителя-регулятора. У цьому записується той струм, який підсилювачем підтримки мембранного потенціалу на необхідного рівня, і це струм з точністю дорівнює ионному току, протекающему через мембрану. Метод фіксації напруги, чи кламп метод, дозволяє вимірювати іонний потік при переміщенні іона по контрольованому градієнту електрохімічного потенціалу одержувати інформацію про електричної провідності мембрани і її пасивної проникності щодо даного нас іона. Цей метод використовується для виміру вольтамперных характеристик рослинних клітин, що дозволяє їм отримати інформацію про тонких механізмах функціонування різних систем мембранного транспорта.

2. Метод пэтч-кламп.

Метод пэтч-кламп (patch-clamp) дозволяє здійснювати локальну (крапкову) фіксацію мембранного потенціалу вимірювати струми через одиночні іонні канали. На цей час його є потужною засобом дослідження биомембран. Метод дозволяє: 1. проводити чимало досліджень у межах класичних електрофізіологічних підходів. 2. реєструвати струми і потенціали від клітин дуже малих розмірів (3−10 мкм) 3. реєструвати струми одиночних каналів амплітудою порядку пикоампер 4. досліджувати дію лікарських засобів при швидкому підбитті їх як до зовнішньої, і до внутрішній стороні мембраны.

Метод пэтч-кламп був у дослідницьку практику Неером і Сакманом, як у 1976 року ними було опубліковано статтю у журналі «Nature», що називалася «Струми через одиночні каналів навіть у мембрані волокна денервированной м’язи жаби». Це відкрило шлях до вивчення на молекулярному рівні електричних властивостей мембран і регуляції різних транспортних процессов.

Основу методу послужило виявлення факту, що з певних умовах клітинна мембрана формує дуже щільний контакти з поверхнею кінчика скляного микроэлектрода. При невеличкому розрідженні, утворюваному всередині піпетки, між склом і мембранным фрагментом виникає контакт, має гигаомное опір. У результаті виходить електрично ізольований ділянку мембрани, і галас реєструючого сигналу зменшується кілька порядків. Оскільки контакт мембрани зі склом дуже міцний, то під кінчиком електрода фрагмент треба або ізолювати від клітини, або зруйнувати, отже проникнути всередину клітини. Є кілька варіантів методу пэтч-кламп (рис.2).

Найбільш близькими до природним умовам є варіант виміру іонних струмів на прикреплённой, але неушкодженої (cell-attached) клітині, оскільки досліджуваний ділянку г99зэмембраны не відокремлюється від клітини і порушується його зв’язку з цитоплазмой. Вимірювання на цілої клітині при руйнуванні мембрани в кінчику микропипетки (whole-cell) дозволяє заміняти іонний склад цитоплазми і вивчати на диализированных в такий спосіб клітинах іонні струми як фіксації напряжения.

Йонні струми через невеликі мембранні фрагменти вимірюють з допомогою пипеток, які мають діаметр кінчика порівняємо з розмірами фрагментів. Опір пипеток, заповнених розчином 150 ммоль/л KCl і занурених в розчин той самий концентрації, приблизно лінійно залежить від площі отвори кінчика і варіює від 1 до 5 МОм. Площа отвори кінчика піпетки можна варіювати від 1 до 8 мкм2, змінюючи ступінь нагріву спіралі на останньому етапі витягування. Ці розміри на межі дозволу світлового мікроскопа. Зовнішню поверхню покривають гидрофобным матеріалом — силгардовой гумою. Особливістю незастывшего силгарда є його здатність розтікатися тонкої плівкою поверхнею скла сталася на кілька міліметрів, покриваючи заодно й кінчик микроэлектрода. Оскільки высокоомные контакти утворяться тільки із чистим склом, цю плівку необхідно видаляти лише оплавленням мікроелектродів. Працюючи на мембранних фрагментах використовується кілька типів пипеток. Піпетки з тугоплавкого скла отримали практиці більше застосування, ніж піпетки з місцевого м’якого скла. Перші мають більше удільне опір, ніж м’яке скло з дешевше температурою плавлення. У результаті внесок шуму, обумовленого ёмкостью зв’язку через скляну стіну у піпетках з тугоплавким склом меньше.

Піпетки з товстостінного тугоплавкого скла випливає низка переваг. Уперших, при більшої товщині стінок шунтирующая провідність через скло менше. По-друге, що на деяких препаратах гигаомные контакти більш стабільні й розмір освіти значно більше, ніж для аналогичных тонкостенных пипеток Табл.1. Геометричні параметры.

кінчиків пипеток, виготовлених із різних типів ст. капилляров.

|Материал, з которого|Площадь |Площадь|Ширина |Кут | |виготовлені піпетки |отверсти|кольца,|кольца,|конуса,| | |ямкм2 |мкм2 | | | | | | |мкм |град | |Тонкостінні |1.0 |0,79 |0,19 |24 | |капіляри CEE BEE — | | | | | |м'яке скло | | | | | |Кимакс — тверде |1,2 |0,82 |0,2 |20 | |боросиликатное скло| | | | | |Алюмінієве — тверде| 1,0|0,9 |0,22 |25 | |алюмосиликатное | | | | | |скло | | | | | |Тонкостінні |1,01 |1,71 |0,39 |10 | |капіляри Jencons — | | | | | |тверде | | | | | |боросиликатное скло| | | | |.

Мембранні фрагменты.

Працюючи з декотрими клітинами, наприклад, з ізольованими з допомогою ферментів клітинами міокарда, гигаомные контакти іноді формуються спонтанно, при дотику кінчиком піпетки до клітини высокоомный контакт формується без подсасывания. І тут не спостерігається жодних деформацій клітинних мембрани, і його площа мембранного фрагмента можна оцінити за значенням опору піпетки до освіти контакту. Але у більшості випадків контакт формується лише за невеличкому розрідженні, утворюваному всередині піпетки. У цьому поверхню мембрани деформується, частина її втягується всередину піпетки на 2−3 мкм, приймаючи Qобразну форму. Коли фрагмент ізолюють механічним отведением кінчика піпетки від поверхні клітини, його У-образная форма мало змінюється. При подальшому подсасывании утворюється сферичний пузырёк. Якщо відома питома ёмкость мембрани (зазвичай, вона становить 1 мкф/см2), площа фрагмента можна оцінити за величиною його ёмкости; зазвичай площа варіює від 2 до 25 мкм2.

Електронні схеми для пэтч-кламп регистрации.

Електронна схема пэтч-кламп реєстрації повинен мати такі параметри, щоб було можливим зареєструвати пересування лише кількох сотень елементарних електричних зарядів через малий ділянку клітинної мембрани. При максимально знижених власних шумах вимірювальної апаратури, струми через одиночні электровозбудимые Са-каналы, можна зареєструвати лише у нефизиологических умовах — наприклад, при використанні розчинів, містять Ва2+ замість Са2+.

Стандартним методом виміру малих струмів є реєстрація створюваного ними падіння напруги на высокоомном опір. На рис. 3 представлений три електричні ланцюга, з допомогою яких здійснюються подібні виміру. Найбільш зручно автоматичне підтримку необхідного значення Vб з допомогою операційного підсилювача, що є керований потенціалом джерело напруги (рис. 3, в).

Реєстрація від цілої клітини за умов щільного контакта.

Попри те що, що метод пэтч-кламп розробили для реєстрації струмів через одиночні канали, пэтч-пипетки з успіхом використовувати також і реєстрації струмів від цілої клітини (РЦК), особливо коли розміри її невеликі. Після утворення гигаомного контакту мембранний фрагмент під піпеткою можна зруйнувати, прикладаючи до неї короткі імпульси негативного тиску. Така маніпуляція здебільшого не порушує контакту піпетки з мембраною, і цього між піпеткою і вмістом клітини встановлюється добре ізольований від що омиває розчину проводить шлях. Такий спосіб проникнення клітину завдає їй набагато менше ушкоджень, ніж запровадження стандартного микроэлектрода. Вхідний опір невеликих клітин велике проти ефективним опором кінчика піпетки, тому під час роботи із нею електричні виміру робити від ділянки мембрани набагато більшої площі, ніж у вихідного фрагмента. На відміну від різних варіантів ПК реєстрації цей метод дозволяє здійснити реєстрацію від мембрани цілої клітини, а чи не від маленького мембранного фрагмента.

Для реєстрації на цілої клітині пэтч-пипетки заповнюють відповідним розчином з низькою концентрацією іонів кальцію. Піпетку притискають до поверхні клітинної мембрани, у результаті формується высокоомный контакт. Потім потенціал піпетки змінюють до негативного значення й подають імпульси напруженості із амплітудою на кілька мілівольт. У цьому етапі виробляється компенсація швидкої ёмкостной компоненти, зумовленої ёмкостью власника і стінок піпетки. До пипетке докладають імпульси негативного тиску до того часу, поки знову з’являться ёмкостные перехідні процеси (виникає додатковий струм). Реєстрацію від цілої клітини робити протягом години без візуальних чи електричних ознак порушення мембрани. Якщо досліджувана клітина щільно прикріпилася до культуральної чашці, плавним отведением її від піпетки можна було одержати конфігурацію outside-out. Після такого процедури клітинна мембрана швидко «зашивається» та клітинка є интактной. Але вміст клітини відповідає розчину в пипетке. Це використовують у різноманітних цілях: 1. зміни вмісту обраної клітини з мінімальним ушкодженням її мембрани. 2. Для проводити дослідження з різними внутриклеточными розчинами в одній й тієї клітині шляхом зміни які реєструють пипеток. 3. Для реєстрації щодо одного експерименті інтегральних струмів й одиночних каналів. Піпетки мали бути зацікавленими порівняно широкі й мати кінчики з великим кутом сходження. Між розчином, у пипетке і вмістом клітини відбувається швидкий обмін, тому розчин заповнення пипеток може бути близький за складом до клітинному содержимому.

Таб. 2. Типові електричні параметри, одержувані при реєстрації на хромафинных клітинах в конфігурації РЦК.

|Послідовне опір, |4 МОм | |Rs | | |Ёмкость клітини, З |5 пФ | |Посаду. Часу фіксації |20 мкс | |потенціалу, RsC | | |Посаду. Часу обміну іонів, tоб|5с | |Опір клітини, R |10ГОм | |Опір витоку, Rут |20ГОм | |Шум (среднеквадр. значення, 0−400|0,15 пА | |гц) | |.

Дані таблиці від значень, отримані з звичайними скляними микроэлектродами за трьома основними пунктах: 1. більшість клітин із діаметром менш 20 мкм при проколюванні звичайним микроэлектродом пошкоджується, тоді як РЦК робити навіть у клітинах діаметром менш 10 мкм, не порушуючи їх. 2. Опір витоку микроэлектрод-клетка під час використання звичайних мікроелектродів вбирається у 500 МОм, тоді як відповідне значення опору витоку при РЦК може бути 20 ГОм і більше. 3. Звичайні мікроелектроди мають опір кінчика Rs понад сто МОм, а типові значення для РЦК на хромафинных клітинах становлять 4 МОм.

Метод РЦК застосовується для реєстрації струмів в мембрані пухлинних клітин гіпофізу, внутрішніх сегментів паличок сітківки, островковых клітин підшлункової залози, клітин міокарда, зовнішніх сегментів паличок сітківки, нейронів спинного мозку ссавців і др.

Пэтч-кламп реєстрація при неплотном контакте.

Метод реєстрації від цілої клітини за умов щільного контакту дозволяє реєструвати іонні струми, які відбуваються через невеликі мембранні фрагменти, які утримують тільки чи кілька іонних каналів. Для отримання про кінетиці роботи каналів або про щільності струмів через мембрану проводиться одночасна реєстрація роботи багатьох каналів з допомогою методу пэтч-кламп чи застосовується класичний метод фіксації мембранного потенціалу. Реєстрація при неплотном контакті власне ідентична реєстрації одиночних каналів, крім те, що ділянку мембрани, у якому фіксується потенціал, на 3 порядку більше, і навіть непотрібен формування гигаомных контактів. Метод дозволяє легко отримувати стабільні электрофизиологические дані від локальних ділянок мембрани, використовуючи интактные клітини практично і їх ізоляції чи інших напрямів обробки. Наприклад, можна проводити виміру на цілої м’язі, не виділяючи одиночні клітини. Відпадає необхідність, і використання внутрішньоклітинних мікроелектродів. Проте, слід зазначити, що коректну інформацію про мембранної провідності усе ж дає реєстрація струмів через одиночні канали, оскільки дозволяє уникнути багатьох артефактів, які можна отримані при реєстрації макроскопічного струму. Є, по крайнього заходу, чотири основних проблеми, із якими випадає зіштовхуватися при реєстрації макроскопічних струмів. По-перше, важко створити умови для для реєстрації струму лише крізь канали даного нас типу. По-друге, вплив послідовного опору може спричинить розбіжності між істинним мембранным і підтримуваним потенціалом. По-третє, накопичення іонів в примембранной області, може викликати залежить від часу зміна струму через окремі канали. І, нарешті, потенциал-зависимость провідності відкритого каналу то, можливо помилково прийнята за потенциал-зависимость активації канала.

1. Медведєв С.С. Електрофізіологія рослин. — СПб.: Изд-во.

С-Петебург. ун-ту, 1998. — 184 с.

2. Реєстрація одиночних каналів / під ред. Сакмана Б. и.

Неера Еге. — М.: «Світ», 1991.

3. Эккерт Р., Рэнделл. Д, Огастин Дж. — Фізіологія тварин, механізми і адаптація. — М.: «Мир», 1991.

4. Hedrich R., Schroeder.J.I. and Fernandez J.M. — Patch-clamp studies on higher plant cells: a perspective. // Trends biochemistry science.

— 1987. — v.12. pp. 49−52&.

———————————- [pic].

[pic].

[pic].

[pic].