Развитие антимікробної хіміотерапії й побудувати нові парадигми

Развитие антимікробної хіміотерапії і призначає нові парадигмы

А.М.Егоров, Ю. О. Сазыкин, В. П. Иванов, Державний науковий центр антибіотиків, Московська медична академія им. И.М. Сєченова, Москва, Россия.

Введение

Развитие хіміотерапії на суворо суворо науковій основі можна було, природно, лише після робіт Л. Пастера, тобто виявлення об'єкта, який повинні впливати антимікробні агенти. Цілком закономірно також, що періоду хіміотерапії передував період асептики і антисептики.

Возникновение антимікробної хіміотерапії датується досить вдало — першими роками і пов’язано, як відомо, із новими роботами П. Эрлиха та її школи. Суть над знаменитому препараті 606 (сальварсан) з низки арсенобензолов, якого які вже немає у фармакопеях світу. Захоплено зустрінутий, цей препарат зберіг свою об'єктивну цінність, але поступово був витіснено із практики спочатку неосальварсаном, отриманим самим Ерліхом, та був іншими препаратами. Суть полягає у сформульованих Ерліхом тезах, що протягом 100 років виглядали непорушними і тільки зараз піддаються обережному перегляду, причому з оговорками.

Как відомо, Ерліх сформулював ряд тез, що ж придбали значення парадигм, тобто сприйнятих всім науковим співтовариством «зразків », чи моделей розв’язання проблеми, дають реальний прообраз дійсності. Зміна парадигм по мері поглиблення знань можлива, але він рівносильна наукової Революції конкретної области.

Основополагающие тези Ерліха добре відомі. Їх аналіз показує, що Ерліх ставив на чільне місце кута хіміотерапевтичний індекс антимикробного препарату [1]. У переведенні, зробленому 1910 г., стиль якого стала кілька архаїчним нашого часу, враження таке: «Хемотерапия ставить завдання знайти такі речовини, які за великому вплив паразитів принесли б можливо менш шкоди організму ». І далі: «Засіб не вийде, якщо взаємини між ядовитостью і лікувальної дозуванням несприятливо ». Звідси уявлення про ідеальної по вибірковості магічною пулі, переходившее з підручника в підручник (магічна куля Эрлиха).

За першу третину ХХ століття після знаменитих препаратів Ерліха арсенал антимікробної хіміотерапії поповнився фактично лише сульфаниламидами. Починаючи ж із 40-х років настало безупинне запровадження у практику природних, синтетичних і напівсинтетичних речовин різноманітної хімічної структури з виключно високої біологічну активність. Остання обставина зумовило інтерес до механізму їх дії та на клітинному рівні, на рівні сумарних біохімічних процесів і, нарешті, на молекулярному уровне.

Можно стверджувати, тобто майже півстоліття вирішення завдання цілеспрямованого створення нових похідних антимікробних агентів йшов у залежність від побудови правильної моделі взаємодії прототипу з внутрішньоклітинної мішенню. У цьому мішень в мікробної клітині мовити як єдина (парадигма избирательности).

Ограниченность такого уявлення не враховуючи хронобиологических закономірностей і закономірностей транспорту антибіотика у клітину, поняття проміжних (тимчасових) мішеней, не повідомляючи субклеточной та молекулярною топографії всієї клітини прояснилася до середини 60-х годов.

Сложность організації клітини у прокариот дає змогу стверджувати, що абсолютизувати вибірковість не можна. Прикладом цього можуть бути хоча б три широко застосовуваних групи антимікробних агентів — b-лактамы, хинолоны і аминогликозиды .

b-Лактамы і хинолоны мають більше мішені в мікробної клітині (різні пенициллинсвязывающие білки, або ж ДНК-гираза і ДНК-топоизомераза IV).

Аминогликозиды, зокрема стрептоміцин, також багатозначні у своїй взаємодії з микроорганизмом:

реагирование з 30S рибосомной субъединицей на стадії ініціації білкового синтезу веде до припинення синтезу білка;

реагирование з 30S рибосомной субъединицей на стадії елонгації полипептидной ланцюга веде до синтезу «летальних «білків;

взаимодействие з oriC локусом запобігає репликацию ДНК.

К цього слід додати, що, реагуючи з іонами магнію зовнішньої мембрани, стрептоміцин «самопромотирует «своє насичення клітину. Нарешті, він також викликає часткову деструкцію цитоплазматической мембрани. Будь-яка молекулярна модель «поза клітини », наприклад модель взаємодії стрептоміцину з рибосомой, зможе вичерпно пояснити механізм антимикробного ефекту цього антибиотика.

Обращают на увагу недавні (друга половина 90-х) дослідження у сфері макролидных препаратів. Виявилося, що рокситромицин, кларитромицин і азитромицин, очевидно, мають позитивний ефект під час лікування атеросклерозу, артритів і астми — хвороб неінфекційної природи, на думку, яка панувала багато десятилетия.

В справжнє час точаться дискусії про этиологическом значенні у тих захворюваннях внутриклеточно локалізованих бактерій, зокрема хламідій. На думку ряду авторів, саме тут слід шукати причину ефективності даних антибіотиків.

Однако існує й інша думка: ефективність макролидов пояснюється корекцією ними «надмірних «запальних реакцій, обумовлених полиморфноядерными нейтрофилами і моноцитами, оскільки зазначені макролиды виявляються високих концентраціях в фагоцитах [2] .

Таким чином, можна говорити про зміну парадигм чи патології, чи хіміотерапії. Позитивним якістю певних антибиотических структур виявляється саме відсутність суворої вибірковості дії. Слід зазначити, що який володіє пряму дію на пухлини кларитромицин останніми роками звернули увагу як протипухлинний препарат. Його механізм дії реалізується, очевидно, лише на рівні интерлейкинов [2, 3 ].

Вообще можна вказати, що з 90-х уже минулого століття тривають систематичні спроби поєднувати лише у низкомолекулярной структурі дві риси — антибактеріальну і иммуномодулирующую активність. Поки вони найбільш вдалим результатом такого цілеспрямованого пошуку вважається цефодизим. За підсумками цефалоспориновой структури отримано лікарський препарат, діючий (на клітинному рівні) на дві мішені - бактерію і фагоцит і у якого антибактеріальних і иммуностимулирующим ефектом [2, 4 ].

Предлагается ретроспективний аналіз величезного переліку антибіотиків для виявлення серед них фармакологічно активних речовин чи що стали б прототипом для речовин що така, які можна отримані шляхом хімічної модифікації. Звісно, у своїй не ставиться, як відомо, обов’язкова завдання збереження антимікробної активности.

Так, наприклад, ведуться активні пошуки похідних еритроміцину і циклоспоринаА, які мають, відповідно, мотилиноподобным дією (стимуляція перистальтики кишечника) та здібністю повертати фенотип резистентной пухлинної клітини до вразливому. У цьому декларується (як не спричинить бажана) втрата антибактеріальної чи иммуносупрессорной активності, властивою прототипам.

Воззрения Ерліха були єдино правильними у тому рівні знань, який був доступний на початку ХХ століття. Зміна парадигм в хіміотерапії обумовлюється зараз досягненнями фундаментальних наук, які призвели до значно більше глибокому розумінню взаємодії ліки з патогеном в інфікованому організмі. Багато чого очікується також від комбінаторної хімії, геноміки і протеомики (протеом — повний набір чи сукупність білків в клетке).

Комбинаторная хімія конструює нові структури, використовуючи «принцип подоби «- з фрагментів, біологічна активність яких «у цьому чи іншому напрямі «була вже доведено. Необхідність аналізу кількісної кореляції структурно-функціональних відносин не вимагає доказательств.

Есть прийоми для підвищення ефективності робота зі створення низки речовин з запланованим різноманіттям. Проте зміна функції речовин, у тому випадку, наприклад, при взаємодії з кінцевої мішенню, ще означає вирішення питання щодо створенні ліки. Потрібна облік взаємодії з проміжними мішенями тощо. д.

Ретроспективный аналіз робіт зі створення раціонального молекулярного дизайну, наприклад фторхинолонов, справляє враження глибокого систематичного передбачення результатів експериментів. Реально систематичного просування шляхом від налидиксовой кислоти до сучасних фторхинолонам був, у разі стосовно створенню принципово нових рядов.

В останні роки ведеться дедалі більше жвава дискусія про можливості, що відкриваються перед хіміотерапією з допомогою використання геноміки і протеомики. Здійснено повне секвенування геному багатьох патогенних бактерій. Міжнародні бази даних, що володіють особливо докладними відомостей про геномах про «модельних «мікроорганізмів (Escherichia coli, Staphylococcus aureus та інших.), і навіть про геномі эукариот нижчих та вищих, може швидко давати інформацію в галузі структурної, порівняльної і метаболической геноміки [5, 6 ]. Це дозволяє ідентифікувати у патогенів гени, включені в відомі метаболічні процеси, диференціювати гени з ще невідомими функциями.

Амплификация даного дослідника гена з допомогою полімеразної ланцюгову реакцію, використання у наступному систем транскрипції і трансляції дозволяють виявити кодируемый їм продукт і можливість установити його функцію лише на рівні фенотипу. Таким чином, з’являється можливість перевірки активності рядів як синтетичних, так і природних речовин, у ролі інгібіторів функцій конкретних генів, точніше — кодованих ними продуктів. Інакше кажучи, добір і вивчення нових антимікробних агентів йде немає від організму до гену, як від гена до організму відповідно до вживленим зараз у літературу терміном «зворотна генетика » .

Успехи геноміки (та генної інженерії) дозволяють виявляти гени, необхідні патогену за його розмноженні лише у інфікованому організмі й вести потім пошук інгібіторів функцій їх продуктів. Тож з останнього часу отримала популярність система «InVivo Expression Technology «(IVET), використовувана для відбору генів вірулентності (ivi гени) [7, 8 ].

Геном досліджуваного патогена фрагментируется з допомогою набору рестриктаз: окремими фрагментах опиняються або ivi гени, чи «життєво важливі «гени. Останні необхідні клітині на її розвитку і invivo, і invitro.

Ингибиторы їх функцій можуть бути встановлені і штучної у живильному середовищі, тобто відомими шляхами. Гени ж вірулентності, мало вивчені взагалі, представляють, як мішені для хіміотерапевтичного агента, особливий інтерес, оскільки патоген, втративши вірулентність, скоро знищуватись захисними силами организма.

Система IVET, заснована на захопленні промотора тих генів, які экспрессируются лише invivo, дозволила знайти, наприклад, у сальмонел приблизно% таких генів. Системи виявлення ivi генів, засновані різними підходах, розробляють різних лабораторіях. До генів вірулентності входять як гени, які кодують освіту адгезинов, инвазинов тощо. п., а й гени, дозволяють микроорганизму переносити дефіцит необхідних речовин, у макроорганизме, наприклад, гени системи транспорту заліза, реутилизации пуринов.

Несомненно, що на парадигмах сучасної хіміотерапії, а точніше — хіміотерапії найближчого майбутнього має позначитися розвиток протеомики [9, 10, 11 ].

Протеомика в обов’язковому поєднані із молекулярної біологією, геномікою і білкової хімією знаменує якісно нове поглиблення знань у всіх галузях біології, у цьому однині і мікробіології. Зазвичай, в статтях, присвячений питанням протеомики, підкреслюється, що її розвиток стає можливим. Понад те, воно неминуче саме у «постгеномную «эру.

Если геноміка полягає в диференціації кожного гена з їхньої сукупності в геномі та її характеристиці у різних аспектах з допомогою баз даних, то протеоміка — на диференціації і характеристиці клітинних білків і з використанням баз данных.

Протеомика, кажучи з часткою умовності, ближчі один до пізнання фенотипу клітини, що вирощується за умов чи що під впливом розв’язання тих чи інших стресових чинників. Виявлення гена саме собою ще означає, що він экспрессируется у разі, тобто що його продукт повинен прийматися у увагу завжди. У той самий час виявлення кодованого геном продукту і визначення її кількості, зазвичай, має враховуватися при характеристиці властивостей клетки.

Стандартный аналіз протеома починається з вилучення розчинних білків та його розділення бізнесу і візуалізації методом двумерного електрофорезу в гелі. Індивідуальний білок після попередньої обробки аналізується методами масс-спектрометрии чи іншими методами (капілярна рідинна хроматографія). Ідентифікація білків здійснюється з допомогою знов-таки відповідних баз данных.

Такая методологія дозволяє вловити відповідь клітини яка за якісними і кількісним змін білкової експресії на різноманітні зовнішні впливи, включаючи реакцію на доданий антибіотик, на чинники імунітету; уловлюються також із характеру білкової експресії зміни, які ведуть патогенності, антибиотикорезистентности і т.д.

Одна із поважних завдань протеомики — контролю над посттрансляционными модифікаціями білків. З допомогою баз даних котрі залучили себе увагу білки класифікуються по функцій, внутрішньоклітинної локалізації та інших показниками, що характеризує їх роль.

Техника двумерного електрофорезу вимагає, проте, часом вдосконалення. Наприклад, ведеться пошук особливих прийомів підвищення ідентифікації гидрофобных (пов'язаних з мембранными структурами) белков.

Актуальным є зменшення трудомісткості аналізу сукупності білків мікробної клітини, що у ній налічується кілька тисяч індивідуальних білків. Проте він менш вже досягнуто ідентифікація щодо одного експерименті близько 2000 белков.

В останнє час почала розвиватися кількісна протеоміка, що дозволяє кількісно зіставляти експресію окремих білків. У цілому нині протеоміка як доповнює геноміку, її напрям, що отримало назву «метаболической «чи «функціональної «, а є етапом (не останнім) наближення до розуміння клітини як єдиної динамічною сукупності макромолекулярных структур.

Возможно, що у майбутньому доведеться термінологічне оформлення і «постпротеомной «ери, коли предметом уваги виявиться склад парламенту й кількісне співвідношення (на цей час ростового циклу) всіх низькомолекулярних метаболітів — продуктів ферментативних реакцій. З огляду на, що реалії хіміотерапії часто-густо базуються на препаратах, є аналогами ферментних субстратів, можна також очікувати принципового внеску до хіміотерапію будущего.

Интересно відзначити, що основні чинники, що стосуються механізму дії пеніциліну, як виявилося, застосовні і решти b-лактамным антибіотиків, отримано за третину століття до формування протеомики саме у відповідність до методологією цієї, невідомої тоді, наукової дисципліни. Саме тоді, коли було встановлено, що пеніцилін, будучи ингибитором D-аланинтранспептидазы, припиняє освіту пептидогликана клітинної стінки у бактерій, і коли увага зосереджувалася на пеніциліні як аналог субстрату в активному центрі цього ферменту, геть несподівано виник новий, начебто зайвий, термін — «пенициллинсвязывающие білки » .

Методами електрофорезу (разом із радиоизотопными) було показано необхідність урахувати топографії всієї мікробної клітини за встановленні механізму дії b-лактамов. Множинність D-аланинтранспептидаз, однакових по каталітичної функції, але за молекулярної масі та інших фізико-хімічним властивостями, відповідальних за завершення синтезу пептидогликана на полюсах клітини, або за формуванні клітинної перегородки, або за подовженні палочковидных форм, виявилася вкрай важливою. Вони мали неоднаковим спорідненістю до найрізноманітніших b-лактамам. У кінцевому підсумку це відіграло роль тому, що b-лактамы стали найбільшої за розмаїттям та значущості групою антибиотиков.

Роль протеомики в хіміотерапії у майбутньому вочевидь пов’язана з рішенням багатьох проблем, що стоять перед наукою. Як приклад слід зазначити на назрілу необхідність вивчення методами протеомики клітин Helicobacter pylori при мікроеволюції цього патогена в інфікованому організмі [12] .

Известно, що культура H. pylori при стресовій ситуації invivo диференціюється хіба що на дві субпопуляции — друга клітин гине і лизируется, а решту частина адаптується і поглинає ДНК, вивільнену з лизировавшихся клітин. Передбачається, що спільна сигнал для популяції - «quorum santis «- забезпечує виживання культури у важких умовах з допомогою збагачення геному компетентних клітин. Але яка має підтвердити біологічне значення цього явища треба вивчити експресію спожитих генів, використовуючи методи протеомики, зокрема количественной.

Широкое використання підходів із боку як геноміки, а й протеомики необхідне з’ясування причин сучасної епідемії туберкульозу. Це стосується як до характеристиці протеома клітин мікобактерій, наприклад, доказ реальності компенсаторних мутацій вивчення їх фенотипического висловлювання, так і до проблеми гетерогенності людської популяції щодо сприйнятливості до туберкульозу [13] .

Число таких додатків методології протеомики безпосередньо вирішення завдань хіміотерапії велике. Доцільно тим щонайменше згадати про протеомике стосовно біогенезу вторинних метаболітів з антибиотическими властивостями у актиноміцетів. Проблема експресії «молчащих «генів, включених в біогенез антибиотических структур, може дуже важлива поповнення переліку природних хіміотерапевтичних веществ.

Напрашивается можливість зіставлення генів, експресія яких ж виконує функцію в пристосуванні патогенного мікроорганізму до дії несприятливих чинників invivo, й у пристосуванні грунтового мікроорганізму до мінливої зовнішньої среде.

Проблема стає, в такий спосіб, общебиологической. Прикладні самі цілі тут різні: пошук генів, тобто їх білкових продуктів як нових мішеней для хіміотерапевтичних речовин, і вишукування генів, тобто кодованих ними ферментів, включених в біогенез ще описаних хіміотерапевтичних агентов.

Как випливає з всього викладеного, провідної ролі у кожному новий напрям, від якої очікується прогрес антимікробної хіміотерапії, грають не мікробіологи. У першому разі - це хіміки-органіки і биоорганики, й інші - генетики, зокрема генні інженери, у третій — фахівці з білкової хімії і біохіміки. Використовуючи методологію комбінаторної хімії, геноміки і протеомики, вони які з підставою свідчить про реальність нових підходів для отримання антимікробних агентов.

И все-таки сама блискуча розробка теоретичних основ цих підходів ще означає безпосереднього внеску до практику. Останній може затриматися через недостатнього уваги до особливостей мікробної клітини загалом і особливостям конкретного патологічного процесса.

Образно кажучи, наміри фундаментальних наук декларированы, а міць їх методології продемонстровано. Настала чергу істотного практичного внеску до розв’язання актуальних проблем химиотерапии.

Как свого роду зразок порівнювати пошукових стратегій, розділених піввіковим періодом, і у зв’язку з недавно відзначеним 50-летним «ювілеєм цефалоспоринов «цікаво повернутися до своєї історії відкриття цефалоспоринаС [14, 15 ]. вона є прикладом самовідданого праці без далекосяжних теоретичних побудов: до того ж час цефалоспорины чотирьох поколінь є полусинтетическими варіантами цього цефалоспорина. Його відкриття — ланцюг випадків і щасливого вибору правильного напрями исследований.

Ошибочная в цілому концепція самоочищення морської води з допомогою антибіотиків, утворених морськими мікроорганізмами, разом із відсутністю захворювань черевний тиф у купающихся поблизу місця скидання стічних вод мовби сприяли виявлення в Сардинії гриба — продуцента цефалоспоринаС.

Этот антибіотик малоактивен загалом і цілком неактивен проти збудника черевного тифу. Утворювався він у малих кількостях і він при цьому «замаскований «присутністю антибиотических тритерпеновых структур (вже до того що часу) і пенициллинаN. Він було виділено як випадково виявлена микропримесь в препаратах пенициллинаN. Його цінність як така була відсутня, і знадобилося проявити інтуїцію і ентузіазм, щоб вивчати цю структуру.

Как згадував багато років через одне із авторів препарату Э. Абрахам, лише диво могло розв’язувати всі нові й нові проблеми, із якими зіштовхувалися шляху до цефалоспоринам (не знаючи, що з часом цефалоспорины становитимуть щонайменше половини що застосовуються у клініці антимікробних антибіотиків). Але тут Э. Абрахам віддав належне правильної організації прикладної науки: «Успіх — в інтуїції, терплячості і готовність на ризик фармацевтичних компаній «[14] .

Действительно, початкове фінансування університетських досліджень (в Оксфорді) було доповнене після підтвердження цінності препарату особистою участю на пізніх стадіях його розробки лабораторій фірми «Lilly » .

Создание принципово нових лікарських засобів інноваційними шляхами в ХХІ столітті буде, безсумнівно, найуспішнішим при інтернаціоналізації исследований.

Список литературы

СазыкинЮ.О. П. Эрлих і почав сучасної антимікробної хіміотерапії. Антибіотики і химиотер 1999; 44(12):5−14.

LabroM.T. Antibacterial agents — phagocytes: new concepts for old in immunomodulation. Int JAntimicrob Agent 1998; 10:11−21.

MikasaK. SawakiM., KitaE., et al. Significant survival benefit of clarithromycin threatment for patients with unrespectable lung cancer. Proceedings of the 4th International conference on the macrolides, azalides, streptogramins and ketolides. Barcelona, Spain; 1998. 40, 4.05.

LabroM.T. Experimental evaluation of antibiotics as immunomodulators. JChemother 1994; 6 (Suppl.5):10−4.

ЕгоровА.М., СазыкинЮ.О. Антимікробні агенти у майбутньому. Внесок геноміки у тому створення. Антибіотики і химиотер 1999; 44(12):5−14.

MoirD.T., ShawK.J., HareR.S., VovisG.F. Gemomics and antimicrobial drug discovery. Antimicrob Agent Chemother 1999; 43:439−46.

HeithottD.M., ConnerC.P., HannaP.C., etal. Simultaneous identification of bacteral virulence genes by invivo gene expression, PNAS USA 1997; 94:934−9.

MahanM.T., TobiasT.W., StauchT.M. Antibiotic — based selection of the bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. PNAS USA 1995; 92:669−73.

CordwellS., NoawensA., VerrillsN., et al. The microbial proteome database — an automated laboratory. Catalogue for monitoring protein expression in bacteria. Electrophoresis 1999; 20:3580−8.

MannM. Quantitative proteomics? Nat Biotechnol 1999; 17:954−5.

WashburnM.P., YatesJ.R. Analysis of the microbial proteome. Current Opinion Microbiol 2000; 3:292−7.

LorenzM.G., WackernagelW. Bacterial genes transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol Rev 1994; 61:627−32.

DaviesJ. Antibiotic resistance in mycobacteria In: Genetics and tuberculosis. John Wiley and Sons; 1998. р.195−205.

AbrahamE.P. Reflections on the development of the cephalosporins. Giorn Ital Chimioter 1970; 17:4−12.

Hamilton-MillerJ.M.T. Sir Edward Abraham’s contribution to the development of the cephalosporins: a reassessment. Int JAntimicrob Agent 2000; 15:179−84.