Определение активності ферментов

Российский хіміко-технологічний Университет им. Д. И. Менделеева Кафедра промислової биотехнологии.

МЕТОДИЧЕСКАЯ РОБОТА.

ПО ВИЗНАЧЕННЮ АКТИВНОСТІ ФЕРМЕНТОВ.

Виконала: студентка.

групи Э-35.

Тимошкина Е.А.

Преподаватель:

Мартимьянова Н.А.

Москва, 1996 г
СОДЕРЖАНИЕ.

Свойства ферментів як біологічних каталізаторів..

Получение ферментних препаратів..

Общие методи визначення активності ферментів..

Методы визначення активності протеолітичних ферментів.

Свойства ферментів як біологічних катализаторов.

Фермент — від латів. fermentum — закваска, знзим — від грецьк. ен — всередині, зими — закваска.

Ферменти, чи ензими, — це каталізатори білкової природи, які утворюються і функціонуючі переважають у всіх живих організмах. Походження термінів пов’язана з тим, що спочатку ферментативные процеси було відкрито і вивчені в бродильном виробництві. У кожній клітині є сотні різних ферментів. З їхньою допомогою здійснюються багато хімічні реакції, спроможними з великий швидкістю йти за температур, підхожих для даного організму, тобто. не більше від 5 до 400 З. Щоб ці реакції з тією ж швидкістю протікали поза організму, знадобилися б високих температур і різкі зміни деяких інших умов. Для клітини це означала б загибель, оскільки все робота клітини будується в такий спосіб, щоб уникнути будь-яких бодай якихось помітних змін — у нормальних умов її існування. Отже, ферменти можна з’ясувати, як біологічні каталізатори, тобто. як речовини, що прискорюють реакції. Вони абсолютно необхідні, оскільки без них реакції у клітинах проходили надто повільно і могли підтримувати життя. Сукупність біохімічних реакцій, катализируемых ферментами, становить сутність обміну речовин, що є відмінністю всіх живих організмів. Через ферментативний апарат, регуляцію його активності є і регуляція швидкості метаболічних реакцій, їх спрямованості.

Будучи каталізаторами, ферменти мають низку спільних із небиологическими каталізаторами властивостей:

1. Ферменти не входять до складу кінцевих продуктів реакції і із неї, зазвичай, у початковому вигляді, тобто. де вони витрачаються у процесі каталізу (нині доведено, деякі ферменти наприкінці хімічної реакції піддаються модифікації і навіть розпаду, а чи не звільняються в незмінному вигляді, як постулював Л. Михаэлис).

2. Ферменти що неспроможні порушити ті реакції, перебіг яких суперечить законам термодинаміки, вони прискорюють ті реакції, які можуть опинитися протікати і них.

3. Ферменти не зміщують становища рівноваги, а лише прискорюють його достижение.

Специфічні властивості:

1. Звісно ж, за своїм хімічним будовою все ферменти є белками.

2. Ефективність ферментів набагато вища, ніж небиологических каталізаторів (швидкість перебігу реакції з участю ферменту вище кілька порядків).

3. Ферменти мають вузької специфічністю, вибірковістю дії на субстрати, тобто. на речовини, перетворення яких вони катализируют. Висока специфічність ферментів обумовлена конформационной і електростатичної комплементарностью між молекулами субстрату і ферменту і унікальної структурою активного центру ферменту, забезпечують «впізнавання», високе спорідненість і вибірність перебігу однієї якусь реакцію з тисячі інших хімічних реакцій, осуществляющихся одночасно у живих клетках.

Залежно від механізму дії розрізняють ферменти відносною (чи груповий) специфічністю й абсолютною специфічністю. Так, на дію деяких гидролитических ферментів найбільше значення має тут тип хімічної зв’язку в молекулі субстрату. Наприклад, пепсин розщеплює білки тварини рослинного походження, хоча можуть суттєво різнитися один від одну немов з хімічної будовою і аминокислотному складу, і за фізико-хімічними властивостями. Проте пепсин не розщеплює вуглеводи чи жири. Пояснюється це тим, що місцем дії пепсину є пептиднаяСО-NHзв'язок. Для дії липазы, катализирующей гідроліз жирів на гліцерин і жирні кислоти, таким місцем є сложноэфирная зв’язок. Аналогічної відносної специфічністю мають й деякі внутрішньоклітинні ферменти, наприклад гексокиназа, що каталізує у присутності АТФ фосфорилування майже всіх гексоз, хоча одночасно у клітинах є специфічні кожної гексозы ферменти, виконують таку ж фосфорилирование.

Абсолютної специфічністю дії називають здатність ферменту каталізувати перетворення лише єдиного субстрату. Будь-які модифікації у структурі субстрату роблять його недоступними на дію ферменту.

Стереохимическая специфічність ферментів обумовлена існуванням оптично изомерных Lі D-форм чи геометричних (цисі транс-) ізомерів хімічних речовин. «Так, відомі оксидазы Lі D-аминокислот, хоча у природних білках виявлені тільки L-аминокислоты. Кожен із видів оксидаз діють лише на специфічний стереоизомер.

+ЅО2.

L-аминокислота a-кетокислота + NH3 + H2O.

оксидаза L-аминокислот.

+ЅО2.

D-аминокислота a-кетокислота + NH3 + H2O.

оксидаза D-аминокислот Наглядным прикладом стереохимической специфічності є бактеріальна аспартатдекарбоксилаза, що каталізує відщеплення СО2 тільки від L-аспаргиновой кислоти з перетворення їх у L-аланин" [1].

4. Регулируемость ферментів як біокаталізаторів. «Через регуляцію ферментативного апарату здійснюється скоординованість всіх метаболічних процесів в часі та просторі, спрямоване відтворення живої метерии, підтримку сталості внутрішньоклітинної середовища, на пристосування до мінливим зовнішніх умов» [2].

5. Термолабильность ферментів. Швидкість хімічних реакцій залежить від температури, тому катализируемые ферментами реакції також чутливі до змін температури. Проте внаслідок білкової природи ферменту теплова денатурація у разі підвищення температури буде знижувати ефективну концентрацію ферменту з певним зниженням швидкості реакції. Отже, термолабильность, чи чутливість до підвищення температури одна із характерних властивостей ферментів, які відрізняють їхню відмінність від неорганічних каталізаторів. При 1000С майже всі ферменти втрачають свою активність (виняток складають, очевидно, лише одне фермент м’язової тканини — миокиназа, яка витримує нагрівання до 1000С). При низьких температурах (00С і від) ферменти, зазвичай, не руйнуються, хоча активність їх падає майже нуля. В усіх випадках має значення час впливу відповідної температури. Нині для пепсину, трипсина та інших ферментів доведено існування прямий залежності між швидкістю інактивації ферменту мірою денатурації білка. На термолабильность ферментів певний вплив надають концентрація субстрату, рН середовища проживання і інші факторы.

6. Залежність активності ферментів від рН середовища. Ферменти зазвичай найактивніші не більше вузької зони концентрації водневих іонів, відповідної тваринам тканин переважно вироблених у процесі еволюції фізіологічним значенням рН середовища 6.0 — 8.0. рН-оптимум дії ферментів лежать у межах фізіологічних значень. Винятком є пепсин, рН-оптимум якого дорівнює 2.0. Пояснюється це тим, що пепсин входить до складу шлункового соку, що містить вільну соляну кислоту, що створює оптимальну кислу середу на дію цього ферменту. З іншого боку, рН-оптимум аргиназы лежать у сильно лужної зоні (близько 10.0), такого середовища у клітинах печінки, отже, in vivo аргиназа функціонує, очевидно, над своєї оптимальної зоні рН середовища. Вплив змін рН середовища на молекули ферменту залежить від вплив на стан і рівень іонізації кислотних і основних груп (СООН-группы дикарбоновых амінокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азоту гистидина та інших.). При різних значеннях рН середовища активний центр може у частково іонізованою чи неионизированной формі, що б'є по третинної структурі білка і відповідно формуванні активного фермент-субстратного комплексу. З іншого боку, має значення і фінансове становище іонізації субстратів і кофакторов.

Получение ферментних препаратов.

Для отримання ферментних препаратів використовують як мікроскопічні гриби, і бактерії і дріжджі. Іноді отримання технічного ферментного препарату закінчується проведенням процесу ферментації, наприклад, в спиртової промисловості для осахаривания крохмалю використовують рідку культуру Aspergillus niger. Згодом її додають в рідкому вигляді у кількості 10−12% до осахареваемому затору. Проте активність ферментів в культуральної рідини швидко знижується. Тому широко практикують отримання сухих технічних ферментних препаратів.

Технічні препарати ферментів. Комплексний амилолитический ферментний препарат отримують шляхом вирощування цвілевих грибів на твердої у живильному середовищі із наступною сушінням і подрібненням отриманої маси. Більше активний препарат ферменту отримують шляхом екстракції такого «грибного солоду» з наступним випарюванням і сушінням. Ще активні ферментні препарати можна назвати з культуральної рідини шляхом осадження амилазы ацетоном і подальшим высушиванием коагулятом за нормальної температури 27−270С. Для осадження ферменту часто використовують і сульфат амонію. Попередньо культуральне рідина випарюють за нормальної температури 400 З до 40%-ного змісту сухих речовин. Коагулят сушать разом із наполнителем.

Комплекс ферментів протеолитического і амилолитического дії отримують з допомогою культури Bacillus subtilis. Це аэробные, грамположительные, рухливі палички. Для цих бактерій характерний дуже багата комплекс гидролитических ферментів. Як джерела харчування вони можуть скористатися білки, вуглеводи, спирти, органічні кислоти. Bacillus subtilis культивують як методом поверхового культивування на отрубях, і у рідких середовищах особливого складу методом глибинного культивування.

Целлюлолитические ферментні препарати. Виробництво целлюлаз полягає в використанні культури гриба Trichoderma viride. Існуючі нині засоби одержання целлюлаз в глибинної культурі передбачає вирощування микроорганизмов-продуцентов целлюлаз на живильному середовищі, що містить як джерело вуглецю, зазвичай, очищену целюлозу, або ж містять її природні субстрати. Проте целлюлазы з допомогою як основне компонента середовища природної целюлози (наприклад, деревна тирса) існує низка технологічних труднощів. Більше раціонально використання живильне середовище, що містить розчинну «індуктор». Такий сприятливим середовищем то, можливо молочна сироватка, основним компонентом якої є лактоза (попередньо від молочної сироватки відокремлюють білок). Як продуцента можна використовувати гриб Trichoderma lignorum, дозволяє отримати сув’язь целлюлолитических ферментів, необхідний розщеплення природних целлюлозусодержащих субстратів.

Общие методи визначення активності ферментов.

Перш ніж переступити до виділення ферменту, необхідно обрати і старанно відпрацювати метод визначення активності, під медичним наглядом якого виробляється вибір найефективніших прийомів очищення ферментів, та був і виконання послідовних стадій його препаративного отримання. Активність ферменту змінюється за умов реакції і від температури, рН середовища, від концентрацій субстратів і кофакторов. Зважаючи на це, щодо активності ферменту різних стадіях очищення необхідно суворо дотримуватися одні й самі умови. Бажано не обмежуватися визначенням активності за одним якомусь методу. Кількість субстрату, що перетворювався за умов тесту з визначення активності ферменту, має бути пропорційно кількості останнього, і часу инкубирования. Якщо немає такий пропорційності, то активність розраховують по попередньо побудованому каліброваному графіку, отражающему залежність швидкості реакції кількості одиниць ферменту. Коли хід реакції нелинеен у часі, слід визначати початкову швидкість реакції (по тангенсу кута нахилу дотичній до початковому відтинку кривою перетворення). І тому найлегше застосовувати такі методи зміни активності, що дозволяють безупинно ознайомитися з ходом перетворення на часу: спектрофотометрические методи, потенциометрические, полярографические тощо. Для виміру швидкості ферментативної реакції, необхідно вибрати буфер, який гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку рН розчину, близька до оптимальної для даного ферменту. Реакцію проводять за нормальної температури, що у вона найчастіше в межах 25−400С. При дослідженні ферментів, потребують присутності кофакторов (іонів металів, коферментів та інших.), концентрація яких може знижуватися принаймні очищення ферменту, в реакційну суміш слід додавати відсутні кофакторы, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ тощо. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори у складі досвідчених сумішей. В багатьох випадках додавання желатину, альбуміну та інших добавок запобігає денатурацію ферментного білка.

Спектрофотометрические методи. Спектрофотометрические методи засновані на поглинанні світла певних ділянках спектра багатьма сполуками, можуть бути активними групами ферментів, субстратами чи продуктами реакції. Становище максимуму поглинання при визначеної довжини хвилі визначається наявністю в досліджуваному матеріалі певних груп — аналітичних форм. Для виміру спектрів використовують спеціальні прилади — спектрофотометры, фотометрические абсорбциометры та інших. Цей метод вирізняється високою чутливістю, швидкістю визначення, малим витрачанням ферменту і реактивів і дає змоги стежити за течією реакції у часі. І тому реакційну суміш вміщують у кюветі, уставлену в термостатируемый кюветодержатель. Через малий проміжок часу після додавання ферменту (чи субстрату) та швидкого перемішування вимірюють поглинання при довжині хвилі, властивій використовуваного субстрату чи кінцевий продукт, що утворюється у цій реакції. З допомогою спектрофотометрического методу можна вимірювати безпосередньо концентрацію деяких ферментів (після достатньої очищення) за величиною характерних максимумів поглинання міцно пов’язаних коферментів (простетических груп). Треба мати довільно обрану одиницю ферменту, з допомогою якої можна було б кількісно висловити чистоту і активність різних фракцій. Найчастіше вибір одиниці залежить від обраного методу визначення. У разі спектрофотометрического методу такий одиницею може бути кількість ферменту, що викликає певне зміна в оптичної щільності за певний час при умовах досвіду, якщо визначається продукт реакції, то одиницею буде кількість ферменту, що викликає освіту певної кількості речовини на хвилину, тощо. Тоді питому активність ферменту, що є мірилом чистоти ферментного препарату, висловлюють числом одиниць на 1 мг речовини (білка).

Для цілей визначення ферментів можна використовувати як вимір поглинання світла, але й виміру флюоресценції - спектрофлюорометрические методи. Таке визначення активності ферменту часом по чутливості перевершує спектрофотометрические методи аж на порядок величини. Деякі коферменти і субстрати мають сильної флюоресценцией. НАД і НАДФ в відновленому стані мають сильну флюоресценцію і флюоресцируют в окисленому стані. Тому спектрофлюорометрию використовують із вивчення кінетики і механізму дії никотинамидных і флавиновых ферментів.

Колориметрические (фотометрические) методи. У основі цих методів лежить вимір з допомогою візуального чи фотоелектричного колориметра пофарбованого продукту, що утворюється при взаємодії субстрату чи продукту дії ферменту зі специфічними реактивами, які зазвичай додаються в фіксовану досвідчену пробу, узяту після зупинки ферментативної реакції. Ці методи дуже різноманітні. Розроблено кількісні методи, засновані на биуретовой реакції, коли він склад білка, очевидно ні позначатися на результатах визначення, т.к. ця реакція на пептидные зв’язку, а чи не на бічні групи в білці. Метод Горнелла і співавторів, заснований на вимірі смуги поглинання у сфері 550−650 нм, використовується визначення значних кількостей (1−10 мг) білка в пробі. Пропонуються биуретовые микрометоды, засновані на поглинанні ультрафіолетового проміння медно-белковыми комплексами: вказують визначати 0.1 — 2.0 мг білка в пробі. Кількість небілкових речовин, що потенційно можуть проводити визначення з допомогою биуретовой реакції, невелика, однак слід вносити поправки тих речовини, що є в високим концентраціях (солі амонію, сахароза). Найбільш цінними є ті фотометрические методи, що дозволяють стежити у часі над перебігом ферментативної реакції без її припинення зі зміни забарвлення хромогенного субстрату чи доданого індикатора. Метод Фолина і Чиокальто, запропонований визначення кількості білка, грунтується на хромогенной природі деяких бічних груп амінокислот, і навіть на присутності в білках пептидних зв’язків. Цей метод має високої чутливістю (на пробу досить 0.01 — 0.1 мг білка), але хто небілкові речовини заважають визначенню.

Нині визначення кількості білка широко користуються вимірами інтенсивності поглинання світла при 280 нм, що обумовлено присутністю в білці ароматичних амінокислот. Кількість цих амінокислот у різних білках різний і, отже, інтенсивність неоднакова. У кюветі завтовшки 1 див у розчину, що містить 1 мг «усередненого» білка один мл, оптична щільність дорівнює 1 при довжині хвилі 280 нм. Нуклеїнові кислоти поглинають при 280 нм, але зробити поправку з їхньої присутність, проводячи вимірювання, і при 260 нм і за 280 нм. Дуже важлива швидкість виміру активності ферментів. Те саме стосується і до виміру кількості сухого залишку чи кількості білка. Тим самим було воліють швидкий метод визначення білка шляхом виміру величини поглинання при 280 нм. Вигране час важливіше, завдяки тому, що удільне поглинання який виділяється білка іноді істотно відрізняється середньої величини поглинання суміші білків, присутніх в вихідному матеріалі.

Манометрические методи. Ці методи використовуються щодо активності ферменту у його випадках, як у досліджуваних реакціях одне із компонентів перебуває у газоподібному стані. До таких реакцій належить головним чином, які пов’язані з процесами окислення і декарбоксилирования, що супроводжуються поглинанням чи виділенням кисню і вуглекислоти, і навіть реакції, у яких виділення чи зв’язування газу відбувається внаслідок взаємодії продуктів ферментативного перетворення з доданим до системи реактивом. Спостереження над перебігом реакції у часі проводиться у спеціальних приладах — манометрических апаратах Варбурга.

Інші методи. Так само як великий ряд методів, які включають поляриметрию, вискозиметрию, потенциоі кондуктометрические вимірювання, і т.п. Також визначення активності можна виконувати, використовуючи методи хроматографії і електрофорезу на папері. Ці методи высокочувствительны і специфічні, що зробила їх у часто незамінними, вказують значно скоротити витрати ферменту на вимір активності, але завжди застосовні через тривалості поділу речовин, у процесі хроматографії (і электрофореза).

Специальные методи визначення активності пепсину і папаина. Пепсин і папаин ставляться до одної з найчисленніших груп ферментів — протеолитические ферменти (протеази). Вони належать до класу гидролаз, до підкласу пептидгидролаз і катализируют розщеплення білків і полипептидов відповідно до рівнянням :

R1CONHR2 + H2O ® R1COOH + H2NR2 ,.

R1 і R2 — залишки амінокислот, дічи поліпептиди.

Т.е. протеази катализируют розщеплення пептидной зв’язку ¾, CO¾, NH¾, .

Тепер трохи докладніше про пептидгидролазах.

Подкласс пептидгидролаз ділиться ми такі группы:

1. аминопептидазы (a-аминоацилпептидгидролазы) катализируют гідроліз полипептидов за місцем пептидной зв’язку, що поруч з вільною аминной группой.

действие.

R1 ферменту R2.

| ¯, |.

H2N ¾, З ¾, З ¾, NH ¾, З ¾, З ¾,.

| ║, ­ | ║,.

H O H O.

2. карбоксипептидазы (пептидиламинокислотные гидролазы) катализируют розщеплення полипептидов за місцем пептидной зв’язку, що поруч з вільною гидроксильной группой.

R.

¯, |.

¾, CO¾, NH¾, C¾, H.

|.

действие COOH.

фермента.

3. дипептидазы (дипептидгидролазы) катализируют гидролитическое розщеплення на вільні аминокислоты.

NH2CH2CONH¾, CH23/4,COOH + H2O ® 2CH2NH2COOH.

глицил-глицин гликолол.

Дипептидазы розщеплюють лише пептидные зв’язку, поруч із якими перебувають одночасно вільні карбоксильная і аминная групи. Вплинув на дію дипептидаз надає наявність a-водородных атомів, утримуваних атомів вуглецю, пов’язаних із вільної карбоксильной і аминной групами. При заміні цих атомів іншими угрупованнями активність ферментів знижується або зовсім зникає.

4. протеиназы — (пептидилгидролазы) гидролизуют безпосередньо білок. У цьому утворюються поліпептиди і вільні амінокислоти. До цієї підгрупі протеиназ належить пепсин, трипсин, хімотрипсин, папаин та інших. У процесі дії ферментів на субстрати вирішальну роль грає структура молекул субстрату (відповідну частину молекули субстрату), у якій стався розрив. Характер розпаду білкової молекули на пептиди і амінокислоти залежить від природи субстрату і зовнішніх умов (рН, температури та інших.). Як білкових субстратів використовують желатин, гемоглобін, казеїн, сироватковий альбумин.

Методы визначення активності протеолітичних ферментов.

Модифікаційний метод. Модифікаційний метод із застосуванням субстрату казеїну грунтується на визначенні швидкості ферментативної реакції гідролізу субстрату під впливом досліджуваних протеолітичних ферментів, які у матеріалі, взятому на аналіз. Швидкість реакції визначають за кількістю які утворилися амінокислот — тирозина (a-амино-b-оксифенилпропионовая кислота) і триптофану (a-амино-b-индолилпропионовая кислота), які колориметрической реакцією з реактивом Фолина. Цим методом визначають зазначені амінокислоти як і вільному, і у пов’язаному стані.

За кількістю тирозина і триптофану, утримується в гидролизате, визначають кількість перетвореного білка у процесі ферментативної реакції (з розрахунку вмісту у білці 6% тирозина і 1.8% триптофану). У основу розрахунку активності протеолітичних ферментів покладено залежність ступеня гідролізу білка від кількості одиниць активності ферменту, введених у ферментативну реакцію. За підсумками цієї залежності складається график.

Бо у даному методі кількість амінокислот, характеризуючих кількість що перетворювався білка, визначається за інтенсивністю забарвлення реакційних середовищ — оптичної щільності після реакції з реактивом, то графіці для простоти розрахунку замість кількості перетвореного білка ставиться пропорційна йому оптична щільність розчину. Під час упорядкування графіка по осі абсцис відкладають число одиниць ферменту, запроваджене ферментативну реакцію, а, по осі ординат — оптичну щільність, отриману після колориметрической реакції з реактивом Фолина.

.

Зміст белка, мг Одиниці активности.

Зависимость оптичної щільності кількості перетворену на процесі ферментативної реакції белка.

Зависимость оптичної щільності від кількості одиниць активності протеолітичних ферментов.

Зараховуючи кількість уведених у реакцію одиниць активності ферменту до дії 1 р препарату, визначають його активність. Для розрахунку прямий, зображеною на графіці, становить розрахункове уравнение.

За одиницю протеолитической активності прийнято стільки ферменту, яке каталізує за 30 хвилин гідроліз 1 р білка в прийнятих умовах до продуктів, не осаждающихся трихлоруксусной кислотою. 1 г становить 25% від взятого на ферментативну реакцію белка.

Протеолитическая активність характеризується числом одиниць активності ферменту, що міститься один р препарату i твердих напівпродуктів чи 100 мл рідких матеріалів. Метод призначений для аналізу очищених ферментних препаратів грибного походження і зміст усіх напівпродуктів, які утворюються за її производстве.

Визначення пепсину по Ансону і Мирському. Він грунтується наступних принципах. Гемоглобін піддають впливу пепсину, що залишилося гемоглобін в облогу беруть трихлоруксусной кислотою. Фенольные властивості залишку (тирозин), зумовлені фотометрически, використовують як міру активності фермента.

Субстратом служить 2%-ный розчин гемоглобіну в 0.06 зв. розчині соляної кислоти, 5 мл субстрату нагрівають до 250С, додають 1 мл розчину ферменту, залишають протягом 10 хв., додають 10 мл 0.3 зв. розчину трихлоруксусной кислоти, енергійно збовтують, фільтрують і п’яти мл фільтрату виливають в мірну колбу на 25 мл. Сюди доливають 10 мл 0.5 зв. розчину їдкого натра і трьох мл фенольного реактиву (реактив Фолина-Чиокалтеу розводять попередньо подвійним обсягом води) і доводять водою до мітки. Через кілька хвилин забарвлений розчин фотометрируют щодо стандартного розчину, що містить 0.0008 мэкв тирозина в розмірі 5 мл 0.2 зв. розчину соляної кислоти (до розчину додають 0.5% формальдегіду як антисептика). Щоб не допустити можливих помилок ставлять холостий досвід. Одиниці пепсину висловлюють в миллиэквивалентах тирозина (не більше від 6.10−4 до 11.10−4): одиниці пепсину = миллиэквиваленты тирозина х1.47.

Визначення протеолітичних ферментів за Муром і Штейна. Метод грунтується у тому, що містять a-аминогруппу амінокислоти дають з нингидридом забарвлену похідну — дикетогидриндилидендикетогидриндамин, і навіть альдегид-аминокислоты і углекислоту.

Забарвлений продукт має характерним максимумом поглинання при 570 мm, а інтенсивність забарвлення залежить кількості амінокислоти. З пролином і оксипиролином реакція відбувається у іншому напряму, а максимум поглинання одержуваного у своїй пофарбованого продукту розташований при 440 мm.

Инкубацию ферменту зручно здійснювати мірних колбочках по 5 мл, у яких змішують і врівноважують при постійної температурі на водяній бані все компоненти крім ферменту. Після цього додають фермент, розчин змішують і беруть проби на дослідження. Для кінетичних вимірів концентрацію ферменту бажано підібрати в такий спосіб, щоб аликвотные частини можна було брати щоп’ять минут.

Аликвотные частини проби, взяті відразу після додавання ферменту, та був через відповідні інтервали, додають в фотометрические пробірки, містять 2 мл реактиву нингидрида — це відразу ж обриває реакцію. Після цього суміш 20 хв. нагрівають на водяній бані, отримана забарвлення стійка мінімум 24 години. Середня помилка під час аналізу повторних проб становить ±2%. Після розведення кип’яченою суміші проби і нингидрида 10 мл суміші, що з рівних обсягів води та н. пропанола, інтенсивність забарвлення визначають на спектрофотометре Колемана при 570 мm.

Для калібрування користуються постійними кількостями стандартних амінокислот, містять реакційні компоненти. З допомогою калібрувальних кривих, побудованих окремо кожної досліджуваної амінокислоти, виміру інтенсивності забарвлення (стосовно контрольної колбі) перераховують в миллимоли. При розподілі цих величин на миллимоли субстрату, використаного у процесі реакції, можна знайти відсоток гидролиза.

Побудова каліброваної кривою виключає помилки, які від якісних відмінностей реакції амінокислот на кольорової реактив. До оптичної щільності 0.1 залежність між величиною поглинання і пишатися кількістю субстрату носить лінійний характер.

Відтворюваність становить ±3%. Заважає вплив амонію, амінів та інших речовин, які у біологічному матеріалі і дають кольорову реакцію з нингидридом, виключається з відповідних неодружених проб. Аналіз порівняно спрощується, коли вивчають протеолитические ферменти, субстратами яких є пептиди, які містять вільних аминогрупп. І тут вся що настає забарвлення повністю посідає вивільнену амінокислоту.

Микрометод визначення активності протеиназ А. П. Алексеенко. Запропонований микрометод визначення активності протеолітичних ферментів грунтується на вимірюванні вмісту аргініну в пептидах, вивільнюваних при гідролізі протеиназами білкових субстратів. Зміст аргініну визначають з допомогою стабилизированной й удосконаленої реакції Сакагучи (хроматограмму занурююється у 0.1% розчин 8-гидроксихинолина в ацетоні, висушують надворі, обприскують розчином 0.2 мл Br2 в 100 мл 0.5 М NaOH, аргінін та інші гуанидины дають оранжево-червоні плями, тауромицин і гликоциамин — лише тимчасову забарвлення), що дозволяє визначити зміст аргініну в розчинах трихлоруксусной кислоти після осадження і видалення нерозчинних білків. Знаючи зміст аргініну в білковому субстраті і визначаючи його кількість в які у розчин пептидах, можна розрахувати відсоток гідролізу білкового субстрату изучаемыми протеиназами. У цьому полягає найголовніша перевага методу, оскільки метод Ансона це не дає можливості розрахувати відсоток гідролізу білка, атакуемого протеолитическими ферментами. З усіх існуючих методів лише метод Мура і Штейна дозволяє визначити відсоток гідролізу білкових субстратів, але він обмежений застосування, адже потребує попереднього проведення повного кислотного гідролізу як белка-субстрата, і які утворилися пептидів. У цьому методиці калибровочная крива будується по розчинів вільного аргініну. Введення у реакцію пептидів і білків у вигляді їхнього биуретовых комплексів підвищило чутливість реакції Сакагучи із рештками аргініну і зробив її такою ж чутливої, як й у вільного аргініну. Як білкового субстрату використовують класичний субстрат — гемоглобін і окислений по Сангеру лизоцим. Цей низькомолекулярний білок, у якому 12.7% аргініну чудово розщеплюється пепсином (рветься близько тридцяти связей).

Перш ніж розпочати визначенню активності ферментів в досліджуваних тканинних субстратах, необходимо:

1. Визначити залежність активності від рН і вибрати оптимальну реакцію середовища для прояви активності досліджуваного ферменту.

2. Побудувати графік залежності активності ферменту від час його інкубації з субстратом. вибрати до роботи ті терміни інкубації, при яких зберігається лінійна залежність між величиною активності ферменту і часом його инкубации.

3. Визначити залежність величини активності від концентрації білка в пробі. Вибрати такі концентрації ферменту, у яких величина активності ферменту було б пропорційна його концентрації. Слід враховувати, що у тканинних екстрактах і біологічних рідинах можуть може бути інгібітори протеолітичних ферментів. При розведенні проби їх концентрація знижується, а протеолітичних — збільшується. Визначаючи «чинник розведення», можна разом з добором оптимальних умов визначення протеолитической активності виявити та наявність ингибитора.

4. При визначенні активності ферменту потрібно працювати при постійної швидкості ферментативної реакції, достигаемой за повної насиченні ферменту субстратом, при так званої максимальної швидкості ферментативної реакції. У кожному окремому разі максимальну швидкість необхідно знайти експериментально, вимірявши активність препарату в різних концентраціях субстрату, за постійних концентраціях білка і часу инкубирования.

Визначення активності протеиназ по белковому субстрату.

К 0.5 мл субстрату у відповідній буферном розчині додають 0.5 мл проби, що містить фермент (екстракт, біологічну рідина), инкубируют встановлений дослідним шляхом час, після чого білки в пробі в облогу беруть 5 мл 10% трихлоруксусной кислотою. Відокремлюють осад центрифугированием, а надосадочную рідина (ТХУ-центрифугат) піддають подальшому опрацюванні. Контрольні проби — проби, де реактив додано у порядку: до 3 мл 10% розчину ТХУ додають 0.5 мл розчину, що містить фермент і 0.5 мл субстрату. Рекомендується проба на автолиз субстрату: до 0.5 мл субстрату додають 0.5 мл прокипяченного розчину, що містить фермент, инкубируют разом із досвідченими пробами і обложеної ТХУ.

Визначення змісту аргініну в ТХУ-центрифугантах по модифікованої реакції Сакагучи. До 0.5 мл ТХУ-центрифуганта додають 0.5 мл 2.5мМ розчину CuSO4, 0.5 мл 5 М. КІН, 0.5 мл розчину ДХН (2,4-дихлор-1-нафтол). Розчин встряхивают і вносять 0.5 мл гипобромита натрію, миттєво виникає яскраво-рожева забарвлення. Розчин встряхивают і крізь 20−30 секунд стабілізують проби додаванням 0.2 мл розчину 2-тиогликоля (щоб запобігти руйнації пофарбованого продукту надлишком гипобромита натрію. Після додавання 2-тиодигликоля в проби як досвідчені, і контрольні, з’являється жовтаве забарвлення з допомогою побічного продукту реакції між надлишкової ТХУ і гипобромита натрію. Побічний продукт також стабілізується 2-тиодигликолем. Оптична щільність проби вимірюється спектрофотометром при 520 нм в кюветі завтовшки 1 см.

Визначення активності протеиназ за реакцією з реактивом Фолина. До 0.5 мл тієї самої ТХУ-центрифуганта додають 0.5 мл 2.5 мМ розчину CuSO4, 4 мл 0.5 зв. розчину NaOH і 1.5 мл розведеного втричі реактиву Фолина. Через 30 хвилин вимірюють на спектрофотометре оптичну щільність при 760 нм.

Калібровані криві по пепсиновому гидролизату окисленого лизоцима. 30 мг окисленого лизоцима розчиняють в 50 мл підкисленою води (40 мл Н2О + 10 мл 0.3 зв. розчину HСl. і до отриманому розчину додають 0.5 мг пепсину. Суміш залишають при кімнатної температурі наступної доби. Після цього терміну інкубації препарат це не дає осаду з ТХУ. Цей препарат використовують поруч із розчинами аргініну і тирозина як стандарт для побудови калібрувальних кривих. Готують розведення із вмістом від 60 до 600 мкг/мл вихідного лизоцима. У проби вводять відповідне досвідченим пробам кількість ТХУ. Готують також розчини вільного аргініну і тирозина з концентраціями від 0.04 до 0.25 мкмоль/мл. З кожної проби беруть за 0.5 мл (у трьох паралельних пробах) визначення змісту аргініну і тирозина по Фолину.

Калібровані криві. 3 отримано з допомогою микрометода з урахуванням реакції Сакагучи (520 нм) по розчинів аргініну (x) і з пептидному гидролизу лизоцима (про), 1 і 2 — з допомогою реакції Фолина (760 нм): 2 — по розчинів тирозина, 1 — по пептидному гидролизу лизоцима. Значення оптичної щільності.

проб, обмірювані при 520 нм чи 760 нм, завдані на графік проти концентрації аргініну чи тирозина чи його залишків в пепсиновом гидролизате лизоцима. Крива 1, що відбувається вище кривою 2, отримана при реакції реактиву Фолина з рас-
.

.

Количество амінокислоти чи його залишку.

в гидролизате в наномолях на 1 мл.

творами тирозина еквівалентній концентрації. Крива 3 отримана внаслідок реакції Сакагучи як із вільним аргинином, і з його залишками, які у пептидах пепсинового гідролізату лизоцима. Розташування досвідчених точок точно по прямий свідчить у тому, що у гидролизате, обложеному ТХУ, весь аргінін повністю реагує з реактивом Сакагучи.

Вплив Фолина на тирозин не специфічно. Крім тирозина в пептидах з цим реактивом реагують триптофан, цистеин. Утворювані міддю з тетрапептидами і полипептидами биуретовые комплекси полегшують таку взаємодію. Отже, вираз величини активності протеолітичних ферментів в тирозиновых еквівалентах і з Фолину, як і іноді роблять, неправильно.

Отже, ми розглянули особливості ферментів як біологічних каталізаторів, показані їх відмінності між небілкових каталізаторів, способи виміру активності запропонованих ферментів — пепсину і папаина. На жаль, нині достатньо незначна кількість публікацій з дослідженню папаина.

1. Березов Т. Т., Коровкін Б.Ф. Біологічна хімія: Підручник.- М.: Медицина, 1990. с. 115.

2. Основи біохімії: Підручник для студ. биол. спец. ун-тов/под ред. А.А. Анісімова.- М.: Выс.шк., 1986. — с.133−140.

3. Фёршт Еге. Структура і механізм дії ферментів.- М.: Світ., 1980. з. 373−388.

4. Кочетов Г. А. Практичне посібник з энзимологии.- М., 1989.

5. Діксон М., Уебб Еге. Ферменти: пер. англ.- М.: Світ, 1982. т.1. з. 370−375.

6. Асатіані В.С. Біохімічна фотометрия.- М.: Вид. АН СРСР, 1957. с.248−253.