Вивчення каталазної активності

Реферат

на тему:

Вивчення каталазної активності

Каталаза широко розповсюджена в організмі людини та тварин, в усіх рослинах та мікроорганізмах, за винятком облігатних анаеробів [8]. У грибів, на відміну від інших організмів, каталаза зустрічається частіше, ніж пероксидаза [1, 9]. Функцією ферменту є запобігання накопичення пероксиду водню, який утворюється під час дисмутації супероксидного аніону та при аеробному окисненні відновлених флавопротеїдів [8]. Каталаза характеризується високою питомою каталітичною активністю, майже не потребує енергії активації, швидкість реакції цього ферменту лімітує лише швидкість дифузії субстрату до активного центру [8]. Сутність каталітичної дії каталази полягає у розкладанні пероксиду водню з виділенням молекулярного кисню.

Мета роботи — вивчення каталазної активності (КА) міцелію і культурального фільтрату в залежності від часу ферментації та накопичення біомаси штамами їстівних дереворуйнівних грибів Pleurotus ostreatus і Pleurotus floridae.

Об`єктами досліджень були штами P-35 і P-77 гливи звичайної та штам P-Fl гливи флоридської. Чисті міцеліальні штами отримували загальними методами [1, 10], що застосовують для одержання чистих культур макроміцетів, а саме вилученням «тканинних» ізолятів з плодових тіл грибів, які вирощували у промислових умовах. Культури та посівний міцелій підтримували на агаризованому суслі методом пересівів. Для визначення КА штами Р-35 і Р-77 (Pleurotus ostreatus) і штам Р-Fl (Pleurotus floridae) вирощували в колбах Ерленмейєра місткістю 250 мл на рідкому глюкозо-пептонному живильному середовищі об'ємом 50 мл з рН 6,4. Ферментацію проводили у термостатах при 26 °C, протягом 5, 10, 15, 20 і 25 діб. Каталазну активність визначали в культуральному фільтраті (КФ) і гомогенаті міцелію (МГ) за методом, основою якого є утворення стійкого забарвленого комплексу пероксиду водню з солями молібдену [8]. Інтенсивність забарвлення вимірювали на спектрофотометрі при довжині хвилі 410 нм супроти нульової проби з дистильованою водою. Активність каталази розраховували за формулою:

Е = (Ak — Ad) х V х t х k х p (мкат/л), де Е — активність каталази — стандартна одиниця ферментативної активності (мкат/л), Аk і Аd — екстинкція контрольної та дослідних проб, V — об'єм проби, що вносили (0,1 мл), t — час інкубації (600 с), k — коефіцієнт мілімолярної екстинкції пероксиду водню, який дорівнює 22,2 Ч 103 мМ-1 Ч см-1, p — коефіцієнт розведення. Ріст штамів грибів оцінювали за накопиченням біомаси ваговим методом. Дослід проводили у триразовій повторності. Цифрові дані обробляли за методом дисперсійного аналізу. Порівняння середніх проводили за методом Дункана [11].

Динаміка зміни каталазной активності міцелію і накопичення біомаси штамами Р-35, Р-77 і Р-Fl наведена в таблиці. Каталазну активність культурального фільтрату у всіх досліджених штамів не зафіксовано. Результати дисперсійного аналізу експериментальних даних показали 95% вірогідність (L = 0,05) впливу часу культивування на накопичення біомаси (обчислене значення вірогідності F = 173,08, стандартне Fst = 2,69) та на рівень каталазної активності міцелію штамів Р-35, Р-77, Р-Fl (F = 2710,75, Fst = 3,01). Статистичний аналіз також вказує на вірогідність (L = 0,05) спільного впливу штамів Р-35, Р-77, Р-Fl і часу їх культивування на накопичення біомаси (F = 3,09, Fst = 2,27) та на рівень каталазної активності міцелію цих штамів (F = 3,48, Fst =2,51). Штами Р-35, Р-77, Р-Fl не виявляють вірогідного впливу на накопичення біомаси (F =2,34, Fst = 3,32) і на рівень каталазної активності їх міцелію (F = 0,91, Fst = 3,40).

З даних таблиці видно, що найбільше накопичення біомаси спостерігається у штаму Р-77 на 15 добу, а у штаму Р-35 — на 15 і 20 добу культивування. Допуск Дункана дорівнює: Ddk = 0,578, а модуль різниці середніх — МРС = 0,3. На 5 добу культивування відмінність між значеннями біомаси штамів Р-35 і Р-77, Р-35 і Р-Fl, Р-77 і Р-Fl не достовірна: Ddk = 0,578 і МРС = 0,332- Ddk = 0,608 і МРС = 0,462- Ddk =0,578 і МРС = 0,13 відповідно. На 10 добу культивування між накопиченням біомаси штамами Р-77 і Р-Fl (Ddk = 0,608, МРС = 0,67), Р-35 і Р-Fl (Ddk = 0,578, МРС = 0,66) з’являється достовірна різниця. На 15 добу культивування в значеннях біомаси штамів Р-77 і Р-35 вірогідної різниці немає: Ddk = 0,578, МРС = 0,3.

На 20 добу ферментації достовірної різниці в накопиченні біомаси дослідженими штамами не спостерігали. Так, для штамів Р-35 і Р-Fl — Ddk = 0,58, МРС = 0,12- для штамів Р-77 і Р-Fl — Ddk = 0,608, МРС = 0,25- а для штамів Р-77 і Р-35 — Ddk = 0,578, МРС = 0,13.У віці 25 діб достовірну відмінність в значеннях біомаси спостерігали тільки між штамами Р-35 і Р-77. В значеннях біомаси штаму Р-35 на 15 і 20 добу культивування вірогідної різниці немає: Ddk = 0,578, МРС = 0. Вірогідної різниці в значеннях біомаси немає також у штаму Р-77 на 20 і 25 добу росту: Ddk = 0,578, МРС = 0,3, на 15 і 25 добу: Ddk = 0,608, МРС = 0,47, на 15 і 20 добу культивування: Ddk = 0,578, МРС = 0,17. Для штаму Р-Fl на 15 і 25 добу ферментації допуск Дункана дорівнює: Ddk = 0,578, МРС = 0,34, на 15 і 20 добу — Ddk = 0,608, МРС = 0,51, і на 20 і 25 добу культивування — Ddk = 0,578, МРС = 0,17.

Таблиця 1.

Накопичення біомаси і каталазна активність міцелію штамів гриба Pleurotus.

Активність каталази культурального фільтрату штамів Р-35, Р-77 і Р-Fl на 5, 10, 15, 20 і 25 добу росту і активність каталази міцелію цих штамів на 5 добу культивування не виявлена. Найбільша активність каталази міцелію спостерігається у штамів Р-35 і Р-77 на 20 добу росту: Ddk = 55,188, МРС = 39,96. Вірогідна різниця відмічається в значеннях каталазної активності в міцелії штамів Р-77 і Р-Fl: Ddk = 55,188, МРС = 66,6- Р-35 і Р-Fl: Ddk = 58,023, МРС = 106,56 на 20 добу культивування. На 10, 15 і 25 день росту різниця в значеннях активності каталази міцелію штамів Р-35, Р-77, Р-Fl не вірогідна. Так, для штамів Р-35 і Р-Fl на 10 добу культивування Ddk = 55,188- МРС = 4,44- для штамів Р-35 і Р-Fl на 15 добу — Ddk = 58,023, МРС = 44,4- для штамів Р-77 і Р-Fl на 25 добу — Ddk = 55,188, МРС = 13,32. В значеннях активності каталази міцелію штама Р-35 на 10 і 15 добу (Ddk = 55,188, МРС = 0), міцелію штама Р-77 на 10 і 15 добу (Ddk = 55,188, МРС = 4,44), міцелію штама Р-Fl на 10 і 15 добу (Ddk = 55,188, МРС = 39,96), 20 і 25 добу культивування (Ddk = 55,188, МРС = 46,62) вірогідної різниці немає.

Таким чином, аналіз експериментальних даних дозволяє зробити наступні висновки. Для штамів їстівних грибів гливи звичайної і гливи флоридської характерна міцеліальна каталазна активність, у культуральному фільтраті ферментативну каталазну активність не виявлено. Досліджені штами мають близьку за рівнем міцеліальну каталазну активність. П’ятиденний міцелій штамів Р-35, Р-77, Р-Fl каталазну активність не виявив. Активність каталази штамів з віком до 15−20 діб підвищується до певного рівня, а потім декілька знижується або її значення стабілізується в умовах досліду.

1. 1.Бухало А. С. Высшие базидиомицеты в чистой культуре. — К.: Наук. думка, -1988. — 144с.

2. 2.Соломко Э. Ф., Дудка И. А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности // ВНИИСЭНТИ: Обзорная информация. Сер. 3. — М., 1985. — 48 с.

3. 3.Бухало А. С., Соломко Е. Ф., Митропольська Н. Ю. Базидиальні макроміцети з лікарськими властивостями // Укр. ботан. журн. — 1996. — Т. 53, N 3. — С. 192−201.

4. 4.Денисова Н. П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов, таксономические и экологические аспекты их изучения: Автореф. дис… д-ра биол. наук.-Л., 1991.-31с.

5. 5.Бойко М. І. Фізіолого-біохімічні особливості системи Pinus sylverstris L.- Heterobasidion annosum (Fr.) Bref. і перспективи практичного використання екзоферментів деяких дереворуйнівних грибів: Автореф. дис. … д-ра біол. наук. — К., 1996. — 51 с.

6. 6.Федотов О. В., Негруцький С. Ф., Бойко М. І. Порівняльна характеристика грибів порядку Aphyllophorales-продуцентів молокозгортаючих ферментів// Укр. ботан. журн. — 1997. — Т. 54, N2. — С. 145−153.

7. 7.Федотов О. В. Активні продуценти молокозгортаючих ферментів серед гіменоміцетів, їх біологічні особливості та перспективи застосування: Автореф.дис. … к-та біол. наук. — К., 1995. — 20 с.

8. 8.Королюк М. А., Иванова Л. И., Майорова И. Г., Токарев В. Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. — 1988, N 1. — С. 16−18.

9. 9.Пидопличко Н. М., Борисова В. Н., Элланская И. А. О пероксидазе у микромицетов. — В кн.: Методы экспериментальной микологии: Справочник / В. И. Билай, И. А. Дудка, С. П. Вассер, М. А. Элланская и др. — К.: Наук. думка, 1982. — 550 с.

10. 10.Дудка И. А. Вассер С. П., Элланская И. А. Методы экспериментальной микологии. Справочник. — К.: Наук. думка, 1982. — 550 с.

11. 11.Приседский Ю. Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів. — Донецьк: Кассиопея, 1999. — 210 с.