Фактори підвищення експресія трансгенів в організмі тварин

Поряд з низькою ефективністю більшості методів трансгенеза основним лімітуючим чинником отримання трансгенних є випадковий характер інтеграції трансгена в геном. На експресію трансгена в організмі тварин впливають послідовності, прилеглі кв ділянці інтеграції, що є причиною великої варіабельності рівня експресії. Рівень синтезу трангенного продукту може варіювати у різних тварин від ектопного до слабкого або навіть знаходиться нижче порога детекції.

Вплив ділянки інтеграції на рівень і характер експресії пояснюється так званим позиційним ефектом [Wilson era /., 1990, Sippel et al., 1997). Крім того, обмежені знання регуляторних послідовностей більшості генів призводять до використання часто повністю не охарактеризованих геномних фрагментів, що і є причиною низької ефективності експресії в експериментах з перенесення генів [Palmlter, Brinster, 1986].

Для того щоб подолати позиційний ефект і таким чином збільшити ймовірність оптимальної експресії трансгенів, інтегрованих у випадковій локалізації, був застосований цілий ряд різних стратегій.

Першим таким підходом, що дозволив збільшити рівень експресії, було введення в генні конструкції гомологічних інтрони послідовностей.

Позитивний вплив на рівень експресії трансгенів справляло введення в генні конструкції S / MAR-елементів Найбільш вдалим рішенням проблеми подолання позиційного ефекту стало інтеграція в певну ділянку геному за допомогою гомологічною рекомбінації в ембріональних стовбурових клітинах, оскільки це забезпечує контроль трансгенної конструкції всіма регуляторними послідовностями, присутніми в обраному ендогенному локусі. Оптимальна локалізація трансгенів у геномі клітини господаря може бути обрана виходячи з рівня та характеру експресії експериментального трансгена. Ще одним підходом, що дозволив дайної інтеграції трансгена в геном господаря є включення в генні конструкції всіх регуляторних елементів, відповідальних за його експресію. Стандартні плазмідні, космідні або фагових вектори в більшості випадків не можуть бути використані, внаслідок їх обмеженої місткості. Дана стратегія може бути використана із застосуванням векторів типу штучних хромосом, які мають підвищену клонуючої здатністю.

Найбільш широке застосування для отримання трансгенних тварин знайшли векторні системи на основі YAC (огляди Montoliuetal. 1993, Jakobovits, 1994, Peterson, 1997, Peterson etal 1997) YAC-еукаріотичні клонуючі вектори, здатні до стабільного збереження геномних фрагментів ДНК довжиною більше 1 мільйона п. о. [Burke., 1987]. Вони являють собою лінійні фрагменти ДНК, що містить всі необхідні елементи для їх збереження в клітинах дріжджів у вигляді штучних хромосом. Перші результати успішного використання YACs в експериментах з трансгенезу на мишах були отримані в 1993 році [Jakobovits et a /., 1993, Schedl et a /., 1993, Strauss etal., 1993].

Для введення YACs в ембріони мишей знайшли застосування три різних підходи: пронуклеарная мікроін'єкція очищеної в гелі YAC-ДНК [Schedl et a /., 1993], ліпофекція YAC-ДНК в ембріональні стовбурові клітини [Strauss et a /., 1993] і злиття дріжджового сферобласта з ембріональними стволовими клітинами [AtoboWte ef a /., 1993). Дослідження експресії YACs у різних ліній трансгенних мишей виявило залежність рівня експресії від числа копії трансгена. З іншого боку, рівень експресії не залежав від позиційного ефекту У той час, як YAC-технології широко використовуються для отримання трансгенних мишей [огляди Peterson et al., 1997, Giraldo and Montoliu, 2001) Кілька досліджувачів повідомили про успішне створення YAC-трансгенних сільськогосподарських тварин.

Результати отримання трансгенних тварин з використанням YAC.

Були отримані свині і щури допомогою ксенотрансплатаціі і спрямованої експресією рекомбінантних генів в молоко трансгенних тварин, що число молекул YAC, мікроін'еціруемих в пронуклеус зигот значно менше, ніж при використанні плазмідних конструкцій (це обумовлено великим розміром YAC), загальна ефективність одержання трансгенних сільськогосподарських тварин з використанням векторів на основі УАС практично не відрізняється від результатів, отриманих з використанням стандартних генних конструкцій. Так, Brem з співавторами [1996, використовуючи концентрації YAC-ДНК 1−4 нг / мкл, отримали 7,4% трансгенних кроликів, що відповідало загальній ефективності 0,74%. Roue з співавторами ін'єктувати в пронуклеус зигот кроликів розчин YAC в концентрації 1 нг / мкл і досягли ступеня інтеграції 11,8% при загальній ефективності 0,71%. Таким чином, розмір ін'еціруемой ДНК суттєво не впливав на ефективність одержання трансгенних тварин.

Було встановлено, що при мікроін'єкції YAC в пронуклеос зигот тварин часто відбувається інтеграція в геном тільки частини молекули. Причиною може бути механічне пошкодження молекул ДНК великої довжини в ході приготування розчину ДНК і мікроін'єкції в пронуклеос. Щоб припинити пошкодження додають поліаміни, які формують комплекси з ДНК і стабілізують її допомогою утворення компактних структур.

Не дивлячись на величезні переваги векторів на основі YAC, вони мають ряд недоліків, що виражаються в певних труднощах лри створенні і підготовці YAC-конструкцій. До них відносяться химеризмом інсерцій (більше 50% клонів в YAC бібліотеці), нестабільність інсерцій, перебудови і потенційна контамінація ендогенними дріжджовими хромосомами, що ускладнює їх ефективне очищення. З метою виключення таких проблем були створені інші типи векторів на основі штучних хромосом, такі як клони Р1-фага, BAC — «bacterial artificial chromosome», PAC — «P1 bakteriophage-derived artificial chromosome» .

Клонуються система бактеріофага Р1 може ефективно зберігати інсерцій гетерологічних ДНК розміром 70−100 т.п. о. [Stemberg, 1999].

Поряд з YACs BACs використовуються для виконання широкого спектру фундаментальних досліджень, що включає вивчення мутацій, дослідження функції і дії генів in vivo, ідентифікація та аналіз регулярних послідовностей, що знаходяться на значній відстані від структурного гена. Потенційні можливості BACs знайшли також застосування для підвищеної експресії рекомбінантних білків у молочній залозі трансгенних тварин [Stinnakre et al., 1999, Zuelke, 1998].