Використання аналітичних органічних реагентів у тонкошаровій хроматографії

Зміст

1. Загальна інформація про метод тонкошарової хроматографії

2. Поняття аналітичних органічних реагентів у ТШХ

3. Роль аналітичних реагентів у процесі обробки хроматограм

4. Приклади застосування аналітичних органічних реагентів у ТШХ Використана література

1. Загальна інформація про метод тонкошарової хроматографії

Планарна хроматографія — один із варіантів хроматографічних методів, що базується на вибірковому розподіленні компонентів аналізуємої суміші між двома фазами, що не змішуються. Планарна хроматографія — спосіб аналізу, в якому процеси розділення суміші сполук здійснюються у плоскому шарі сорбенту (нерухомій фазі). Вона ділиться на паперову та тонкошарову хроматографію, які схожі за технікою виконання аналізу.

Тонкошарова хроматографія (ТШХ), однак, зайняла особливе місце серед інших хроматографічних методів завдяки простоті методики та доступності обладнання, широкій області застосування, високій економічності, достатньо високій селективності та чутливості. ТШХ є єдиним хроматографічним методом, який дозволяє проводити повний аналіз невідомої суміші, оскільки дослідник може перевірити, чи не залишилося на старті нерозділених компонентів. Метод тонкошарової хроматографії був запропонований у 1938 році вченими Н.А. Ізмайловим та М. С. Шрайбер. Проте широкі можливості метода були відкриті пізніше завдяки роботам Ю. Кірхнера та Е. Шталя.

2. Поняття аналітичних органічних реагентів у ТШХ

Поняття «органічний реагент» нині не має загальноприйнятого визначення. У вузькому розумінні під органічним реагентом розуміють органічну речовину, за допомогою якої виявляють, ідентифікують та визначають якусь хімічну сполуку, тобто органічний реагент служить тільки для отримання (виявлення) аналітичної інформації. Розширення поняття «органічний реагент» — це включення до їх числа ще й тих органічних речовин, які застосовуються на стадіях аналізу, що передують власне визначенню, а саме для розділення, виділення, маскування і т.д. Це осаджувачі, екстрагенти, маскуючі речовини, іонообмінники на основі полімерної органічної матриці, різні буферні суміші на основі органічних речовин і т.п.

У методі тонкошарової хроматографії розділені компоненти на пластинці чи полосці паперу утворюють окремі зони (плями) (рис. 1). Багато сполук не виявляються у видимій області, і для їх визначення невидимі зони проявляють оприскуванням пластини ТШХ спеціальними аналітичними органічними реагентами.

Рисунок 1. Схема аналізу методом ТШХ: 1 — аналізуюча суміш; 2−4 — стандартні речовини («свідки»).

3. Роль аналітичних реагентів у процесі обробки хроматограм

Для отримання інформації про якісний та кількісний склад аналізуємої суміші використовують різні методи детектування — як хімічні, так і фізичні. В останні роки значно зросло використання ферментативних методів, особливо в клінічній діагностиці, при визначенні пестицидів. Пластинки ТШХ виконують роль дискет, з яких хімічна, фізична або ферментативна інформація може бути зчитана у будь-який час і будь-де. Все це на відміну від інших варіантів хроматографії відбувається окремо від процесу розділення, і цим усувається вплив рухомої фази. Звідси випливає, що селективність (вибірковість) метода ТШХ складається із селективності процесу розділення та специфічності детектування, взятих разом (рис. 2). Ця перевага характерна тільки тонкошаровій хроматографії.

Рисунок 2. Збільшення селективності за рахунок поєднання методів.

Ідентифікацію речовин (якісний аналіз) можна проводити по рівнянню значень R_f аналізуємої речовини та стандарту («свідка»). Якщо на хроматограмі утворюються забарвлені зони, це значно спрощує її обробку. Невидимі хроматограми проявляють (знаходять зони розділених речовин) хімічними або фізичними способами.

При хімічному способі плівку або папір оприскують розчином або тримають у парах реагента, що взаємодіє с компонентами аналізуємої суміші. Ці реактиви розділяють на два типи:

— 1- реагенти загального призначення, які дозволяють виявити велику кількість сполук різних класів;

— 2- більш специфічні реагенти, що дозволяють виявити сполуку окремого класу або з певною функціональною групою.

До реагентів загального призначення відносяться концентрована сульфатна кислота, розчин біхромату калія у концентрованій сульфатній кислоті, 1%-ий спиртовий розчин йоду, фофорно-молібденова кислота, родамін. Одна з переваг ТШХ в порівнянні з паперовою хроматографією — можливість використання агресивних проявників.

Оприскування пластинок реагентами, як правило, повинно проводитись за допомогою пульверизаторів різної конструкції у витяжній шафі або в особливій камері, куди поміщають пластинку. Після оприскування пластинку із сорбентом іноді необхідно нагрівати зазвичай до 80−110 °С для того, аби виявити дію реагента.

планарна хронографія реагент тонкошаровий Таблиця 1. Реагенти загального призначення для виявлення та ідентифікації речовин у тонкошаровій хроматографії.

Приклади специфічних реагентів-проявників для виявлення різних класів органічних сполук приведені у табл. 2.

Таблиця 2. Специфічні реагенти для виявлення та ідентифікації речовин у тонкошаровій хроматографії.

4. Приклади застосування аналітичних органічних реагентів у ТШХ

Прикладом селективного реагента, який дозволяє візуально за кольором плям виявляти присутність аміносполук різної природи у сумішах, є 4-хлор-5,7-динітробензофуразан (рис. 3):

Рисунок 3. ТШ-хроматограма аміносполук.

Проявник — 4-хлор-5,7-динітробензофуразан;1 — диметиланілін; 2 — анілін; 3 — 2,2,4-триметилдигідрохінолін; 4 — дифеніламін; 5 — феніл-б-нафтиламін; 6 — б-нафтиламін; 7 — гидразид саліцилової кислоти; 8 — гидразин солянокислий; 9 — гидразин; 10 — ізоніазид; 11 — фосфабензид.

Так само в аналітичній хімії як реагент на велику кількість окисників є бензидин. Бензидин (4,4'-диамінодифеніл) — білі або злегка жовтуваті кристали, що темніють на повітрі та світлі. Важко розчинний у воді, легко — у спирті та ефірі.

Використовується у вигляді 0,2%-ого розчину в оцтовій кислоті. При цьому оприскану пластинку нагрівають 10 хвилин при 100 °C. Застосовують для визначення альдоз. Моноальдози дають коричневі плями. Для виявлення хлорованих пестицидів оприскують пластинки 0,1%-им розчином реагента, а далі 5−10 секунд опромінюють короткохвильовим УФ-світлом. На кремовому фоні проявляються плями з окраскою від жовтодо синьо-зеленої. Межа визначення — від 0,5 до 1 мкг пестицидів.

Бромтимоловий синій (3', 3'-дибромтимолсульфофталеїн) — трифенілметановий барвник, малорозчинний у воді, кислотно-основний індикатор.

В якості реагента готується розчин з 40 мг бромтимолового синього у 100 мл 0,01 н. натрій гідроксиду.

За методикою після оприскування пластинки також необхідною є її обробка парами амоніаку. Застосовують при визначенні ліпідів (синьо-зелені плями). Межа визначення — 0,1−1 мкг.

Рисунок 4. Розчини бромтимолового синього при різних значеннях рН (зліва направо: кисла, нейтральна та лужна реакції).

Сечовина — тривіальна назва карбаміду (діамід вугольної кислоти). Білі кристали, що розчинні в полярних розчинниках (воді, етанолі, рідкому аміаку).

Для виявлення ефірів сахарози готують реактив складу: 1 г сечовини розчиняють у 48 мл води, насиченої бутанолом, і додають 4,5 мл 85%-ої ортофосфорної кислоти. Оприскану пластинку нагрівають 30 хвилин при 105−110 °С до появи інтенсивних сіро-блакитних плям на майже безкольоровому фоні. Межа визначення — 0,3 мкг.

Як специфічний реагент на гуанідинову групу сечовину використовують в суміші з 1-нафтолом та бромом (суміш отримала назву реактива Сакагучи). Готується розчин а: розчин, що містить 16% сечовини та 0,2% б-нафтолу в етанолі (5:1), та розчин б: в 500 мл 5%-ого розчину натрій гідроксиду розчиняють 3,3 мл брома. Пластинку оприскують розчином а, висушують при 40 °C та оприскують розчином б. Аргинін і гомоаргинін змінюють колір з рожевого на червоний.

Для виявлення фенолів, пластифікаторів, катехоламінів застосовується п-нітроанілін.

п-Нітроанілін — жовта кристалічна речовина, добре розчинна у гарячій воді, етанолі, диетиловому ефірі, бензолі, ацетоні, хлороформі, погано — у холодній воді.

Розчин 5%-ого натрій нитриту при перемішуванні додають до 10 мл розчину, який готувався з 1 г п-нітроаніліну розчиненого у 200 мл 2 н. соляної кислоти, до повного знебарвлення. Отриманою сумішшю оприскують пластинки. Забарвлення багатьох пластинок можна посилити, оприскуючи пластинки розчином карбонату натрію. Межа визначення — 0,5 мкг катехоламінів, 0,003 мкг адреналіну.

Етилендиамін (1,2-диаміноетан) — органічна речовина класу амінів. Рідина без кольору із запахом амоніаку. Етилендиамін розчинний у воді, спирті, гірше — в ефірі, не розчинний у бензолі.

Для виявлення катехамінів змішують рівні об'єми етилендиаміну та води або розведеного розчину натрій гідроксиду. Оприскані пластинки нагрівають 20 хвилин при 50−60 °С. Хроматограму розглядають в УФ-світлі. Межа визначення — 0,003−0,005 мкг.

Дитизон (дифенілтіокарбазон) — кристали синьо-чорного кольору, нерозчинні у воді, добре розчинні в хлороформі та чотирихлористому вуглеці. З багатьма катіонами дитизон утворює забарвленні внутрішньо-комплексні сполуки.

Готують 0,01%-ий розчин дитизону в чотирихлористому вуглеці або хлороформі. Оприскують пластинку реагентом, розглядають плями, які утворились, потім оприскують 25%-им розчином амоніаку та спостерігають за зміною забарвлення плям. Застосовують для виявлення йонів важких металів, солей олова та органічних речовин, ртутьвмісних органічних фунгіцидів (використовується 0,5%-ий розчин реагента). Межа визначення для фунгіцидів — 0,5−20 мкг.

Дипікриламін — оранжево-жовта кристалічна речовина майже нерозчинна у воді, розчинна в ацетоні, концентрованій азотній кислоті.

Для виявлення тартрата холіна 0,2 г дипікриламіна розчиняють у суміші 50 мл ацетону та 50 мл води. Пластинку численно оприскують реагентом до появи плям — темно-червоних на жовтому фоні (забарвлення стає більш інтенсивним після 5-хвилинного нагрівання при 80 °С). Межа визначення — 5 мкг.

Дифеніламін ((N-феніл)-анілін) — безбарвні кристали, які темнішають на світлі. Легко розчинний у діетиловому ефірі, бензолі, ацетоні.

Готують 1%-ий розчин дифеніламіну у 95%-ому етанолі. Оприскану пластинку опромінюють короткохвильовим УФ-світлом. Застосовують для виявлення ефірів азотної кислоти (жовто-зелені плями на безбарвному фоні). Вибухові речовини (для оприскування використовують 5%-ий розчин дифеніламіну) дають різнокольорові плями. Також виявляються хлоровані пестициди (реактив розбавляють етанолом у відношенні 1:10) з межею визначення до 0,5 мкг.

Необхідно пам’ятати, що у деяких випадках реакція на шарі сорбенту залежить від його природи. Наприклад, при визначенні кофеїну шляхом обробки пластинки хлором з послідуючим оприскуванням розчином калій йодиду та бензидину реакція дає негативні результати на силікагелі та позитивні на оксиді алюмінію.

Використана література

1. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография. — М.: Мир, 1981. — т.1. — 616 с.

2. Хроматография в тонких слоях под ред Э.Шталя. — М.: Мир, 1965. — 508 с.

3. Евгеньева И. И. Планарная хроматография и анализ органических веществю — Соросовский образовательный журнал, № 11. — 1999.

4. Саввин С. Б., Стрельникова Е. Б. Опыт исторической периодизации применения органических реагентов в аналитической химиию — Журнал аналитической химии, т. 38, вып. 4. — 1983.

5. Кибардин С. А., Макаров К. А. Тонкослойная хроматография в органической химии. — М.: Химия, 1978. — 126 с.

6. ГОСТ 28 366–89 Реактивы. Метод тонкослойной хроматографии. — М.: Стандартинформ, 2008. — 7 с.

7. Индикаторы под ред Э.Бишопа. — М.: Мир, 1976. — т.1,2.