Рекомбінантні вакцини (Генна інженерія)

ОГЛАВЛЕНИЕ Введение…3 1. Принципи конструювання рекомбінантних противірусних вакцин…4−24.

1. Одержання відповідного фрагмента нуклеїнової кислоты…4.

2. Вибір высокоактивной і добре вивченій в иммунологическом отно;

шении моделі вектора-носителя і клонування відповідного гена…9−21.

1. Одержання рекомбінантних ДНК…9.

2. Одержання рекомбінантних РНК…11.

3. Стратегія клонування генов…13.

4. Розмаїття векторних молекул…17.

3. Вибір системи експресії клонованого гена, здатної забезпечити максимальний вихід і функціональну повноцінність продукта…22.

4. Створення досить зручних і за можливості універсальних векторів для цільової доставки генів у клітини, і тканини организма…23 2. Вакцина проти лейкемії кішок, виготовлена з допомогою генної инженерии…24 Список литературы…26.

Існуючі традиційні вакцини, попри очевидний позитивний ефект їх широко він, мають також низку недоліків. До них належать: наявність небажаних біологічно активних і баластових компонентів в препаратах, неповноцінні імунологічні властивості самих антигенів. Крім того, існують захворювання, які викликають імунітету, вакцини проти яких взагалі відсутні не можуть бути сконструйовані з урахуванням класичних принципів. Усе це зумовлює необхідність вдосконалення вже існуючих вакцин і шляхом створення принципово нових типів вакцин. Одним із найперспективніших напрямів у сфері є отримання вакцинних препаратів з урахуванням методів генної инженерии.

Останнім досягненням генної інженерії і біотехнології було створення рекомбінантних противірусних вакцин, містять гібридні молекули нуклеїнових кислот. Дані вакцини мають цілу низку переваг. Вони характеризуються відсутністю (чи значним зниженням) баластових компонентів, повної нешкідливістю, низькою вартістю, що з здешевленням промислового виробництва вакцин. Экспрессируемый у клітинах вакцинированного тваринного білок має конформацию, близьку до нативной, і має високої антигенної активностью.

Отже, рекомбинантные противірусні вакцини є новітнім поколінням вакцин. Їх очевидну перевагу зумовлює широке застосування цього типу вакцин у медицині й ветеринарії для вакцинації населення і ще сільськогосподарських животных.

1. ПРИНЦИПИ КОНСТРУЮВАННЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ.

ПРОТИВІРУСНИХ ВАКЦИН.

Важливим умовою отримання ефективного вакцинного препарату є дотримання основних принципів його виробництва. Конструювання рекомбінантних противірусних вакцин передбачає: 1) отримання відповідного фрагмента нуклеїнової кислоти; 2) вибір высокоактивной і добре вивченій в иммунологическом відношенні моделі вектора-носителя і клонування відповідного гена (чи генів); 3) вибір системи експресії клонованого гена, здатної забезпечити максимальний вихід і функціональну повноцінність продукту; 4) створення досить зручних і з можливості універсальних векторів для цільової доставки генів у клітини, і тканини организма.

1.1. ОТРИМАННЯ ВІДПОВІДНОГО ФРАГМЕНТА.

НУКЛЕЇНОВОЇ КИСЛОТЫ.

Для конструювання рекомбінантних РНК чи ДНК необхідно одержати фрагмент нуклеїнової кислоти, який надалі і буде вбудовуватися в векторну молекулу.

Фрагменти ДНК для вбудови у вектор можна отримати з хромосомної ДНК, розщепивши її рестриктазами чи зруйнувавши випадковим чином (наприклад, з допомогою ультразвуку) на сегменти з приблизно однаковою довжиною. Виділення генів з допомогою «вирізання «з геному, зазвичай, складається з чотирьох етапів: 1) отримання клонотеки фрагментів геному; 2) виявлення фрагментів геному, містять необхідний ген, і точна локалізація гена у цьому фрагменті; 3) вирізання гена з фрагмента (ов) з допомогою рестриктаз і сшивка ділянок гена з допомогою ДНК-лигазы фага Т4, коли ці ділянки отримані із різних фрагментів; 4) ампліфікація гена в складі векторної молекули. Зазначений спосіб отримання генів є найбільш приемлимым стосовно протозойным збудників, бактеріям і декому складно влаштованих ДНК-содержащих вірусів. Такі операції проводяться, зокрема, під час створення про «бібліотек генів », то є набору однакових векторних систем, разом несуть у собі весь геном даного організму. Однак це підхід має низку істотних недоліків. По-перше, дуже складна завдання добору рестриктаз, дозволяють вирізати з геномної ДНК чи клонованого фрагмента геному цілісний ген. Зазвичай, разом із геном залишаються фланкирующие його зайві нуклеотидные послідовності, що заважає подальшому використанню цього гена, або ж рестриктазы відрізають частина гена, роблячи його функціонально неповноцінним. Удругих, створення клонотеки геному збудника представляє спеціальну завдання й вимагають великих витрат часу. Нарешті, для низки ДНК-содержащих вірусів (паповавирусы) доведено сплайсированный характер структури генів. Зрозуміло, що виділені гени цих вірусів внаслідок наявності интронных областей ще не виявлятимуть функціональної активності у бактеріальних клітках і виявляться непридатними під час вирішення завдань із конструювання рекомбінантних противірусних вакцин. По-третє, якщо ген становить незначну частку від усієї геномної ДНК, то виникають великі проблеми з його ізоляцією і идентификацией.

Найпоширенішим є шлях отримання генів через синтез ДНК-копий (кДНК) інформаційних або інших (в оптимальному разі - індивідуальних) РНК шляхом їх зворотної транскрипції. Цей спосіб включає у собі три етапу: 1) виділення високоочищених мРНК, які кодують індивідуальні структурні білки, або геномних РНК вірусів; 2) синтез двухцепочечной ДНК (гена) на матрицях РНК; 3) ампліфікація гена з допомогою методів молекулярного клонирования.

Як зазначалося, першим етапом отриманні генів з допомогою методів зворотної транскрипції служить виділення очищення геномних РНК і мРНК. Геномные РНК виділяють головним чином із очищених вирионов, а мРНК — з інфікованих клітин. Для виділення мРНК з інфікованих клітин використовують різні способи. У одному з варіантів виділення мРНК з інфікованих клітин проводять безпосередньо з лизированных клітин (лизис ведуть у денатурирующих середовищах з метою запобігання руйнівної дії нуклеаз на мРНК) із наступною екстракцією фенолом і хлороформом чи центрифигурированием лизата через подушку 5,7M СsCl (для звільнення з клітинних ДНК) і заключній аффинной хроматографією на олиго (dТ)-целлюлозе (поли (У)-сефарозе). Виділення мРНК можна й з очищених полирибосом інфікованих клеток.

У разі потреби отримання специфічних мРНК, які кодують індивідуальні структурні білки збудника, використовують наступний спосіб. Інфіковані вірусом клітини руйнують механічним шляхом, або хімічними методами (використання неионных детергентів). Клітинний лизат звільняють від ядер і мітохондрій методом диференціального центрифугування і піддають хроматографії на антительном сорбенте. Під час цієї процедурі з антитілами, специфічними до якогось структурному білку збудника, зв’язуються полисомы, здійснюють синтез цього білка. Також то, можливо використаний метод непрямий иммунопреципитации полісом, у якому комплекс антитіло — полисома преципитируется з розчину додаванням другого антитіла, специфічного до першого. Як другого антитіла найчастіше беруть фіксовані формаліном клітини Staphilococcus aureus, лежить на поверхні яких міститься так званий білок А, має спорідненість до Fc-фрагментам Ig. З полісом, отриманих однією з описаних способів, далі вже виділяють мРНК.

Інший шлях виділення індивідуальних мРНК виходить з властивості мРНК взаємодіяти з комплементарними ДНК, пов’язані з твердим носієм (целюлоза, сефароза, нитроцеллюлозные фільтри). Цей метод добору, і очищення специфічних мРНК є найефективнішим. Проте його застосування можливе лише за наявності відповідних комплементарных ДНК.

Одержання препарату очищеної мРНК дозволяє можливість перейти до роботам по синтезу гена з допомогою зворотної транскрипції, яку здійснюють з допомогою ревертазы AMV в спеціально підібраних умовах. У процесі зворотної транскрипції матрицею служить мРНК, а запалом олиго (dT12−18) (для мРНК, мають поли (А)-тракт) чи хімічно синтезований олигонуклеотид, комплементарний 3 «-кінцю мРНК. Після синтезу на мРНК комплементарної ланцюга ДНК і руйнувань РНК (частіше використовується обробка лугом) здійснюють синтез другий ланцюга ДНК. У цьому реакції матрицею служить перша ланцюг ДНК. Реакція може катализироваться як ревертазой, і ДНК-полимеразой.

Після набуття двухцепочечной кДНК слід стадія отримання гена, яка полягає в гідролізі одноцепочечного ділянки ДНК, поєднує першу і другу ланцюга, нуклеазой S1.

Для отримання необхідних ділянок РНК використовують дві групи способів: 1) розщеплення полирибонуклеотидной ланцюга РНК в заданому місці; 2) синтез РНК (ферментативний на ДНКчи РНК-матрицах і химический).

Розщеплення полирибонуклеотидной ланцюга РНК може здійснюватися у присутності різних ферментів. З цією метою використовують ферменти: рибонуклеазу H, нуклеазы, ковалентно пов’язані з олигонуклеотидами (наприклад, стафилококковая нуклеаза), рибозимы (наприклад, рибозим L-19).

Історично першим способом спрямованої ферментативної фрагментації РНК (званої також адресованій, сайт-направленной чи сайтспецифічної фрагментацією РНК) є розроблений Московському університеті метод гідролізу РНК ферментом РНКазой H у присутності комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов. Цей метод досі залишається найбільш універсальним способом спрямованої фрагментації РНК.

Метод грунтується на властивості РНКазы М розщеплювати полирибонуклеотидную ланцюг РНК у складі ДНК-РНК-гетеродуплекса. До ділянці РНК, яким заплановано її фрагментацію, синтезується комплементарний олигодезоксирибонуклеотид у 6−10 нуклеотидних залишків. Далі отримують комплекс цього олигонуклеотида з РНК, і потім обробляють ферментом. Діяльність зазвичай використовують РНКазу М з Escherichia coli — цілком доступний фермент, що може бути досить легко очищено від усіх супутніх нуклеазных домішок. Цей метод знайшов досить широке застосування сайт-специфического розщеплення вірусних і рибосомних РНК, а також і ідентифікації продуктів процесингу деяких РНК.

Важливим гідністю аналізованого методу є і те, що у результаті гідролізу РНК рибонуклеазой М утворюються фрагменти, одного з яких 5 «-кінці міститься фосфатная група, а й у іншого 3 «-кінець вільний (нефосфорилирован). Такі фрагменти можна прямо залучити до реакції ферментативного лигирования.

Серйозним обмеженням цього і те, що земельна ділянка РНК, з яким пов’язується комплементарний йому олигодезоксирибонуклеотид, повинен мати однотяжевую конформацию і бути лежить на поверхні макромолекули РНК, що є за умов розщеплення компактну глобулу з розвиненою вторинної структурою. У окремих обох випадках ці обмеження вдається подолати, використовуючи досить довгі олигодезоксирибонуклеотиды (15−20- членные), які попередньо отжигают з частково чи цілком денатурированной РНК.

Інше обмеження методу фрагментації полирибонуклеотидов РНКазой М в присутності комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов у тому, що загалом разі передбачити, яка з фосфодиэфирных зв’язків в гетеродуплексе (чи безпосередній близькості до нього) піддасться розщеплення, вдасться. Понад те, фермент найчастіше гидролизует назвати не одне, а кілька сусідніх межнуклеотидных зв’язків. Зрозуміло, що з наступного конструювання рекомбінантних РНК такі фрагменти може стати непригодными.

Розщеплення РНК можна проводити і з участю нуклеаз, ковалентно що з олигонуклеотидами. Ідея, що у основі цього підходи до спрямованої фрагментації РНК, перегукується з кінцю 1960;х років, коли М. І. Гриневой та її співробітниками було запропоновано метод олигонуклеотид-направляемой модифікації нуклеїнових кислот. Принцип цього у тому, що з п’ятьма «- чи 3 «-концевым залишком олигонуклеотида, комплементарного заданому району ДНК і РНК, пов’язують модифицирующий агент, який після освіти дуплекса атакує одна з найближчих щодо нього підстав. Реагентами цього вдалося цілеспрямовано фрагментировать фенилаланиновую тРНК з дріжджів, РНКкомпонент (M1 РНК) РНКазы Р, і навіть 16S рибосомную РНК E.coli.

Проте, як у разі РНКазы М, розщеплення РНК олигонуклеотиднуклеазой найчастіше відбувається за кільком межнуклеотидным зв’язкам, що дещо обмежує можливості можливість застосування цього щоб одержати рекомбінантних РНК.

Для розщеплення РНК застосовують також рибозимы (природні РНК і синтетичні полирибонуклеотиды, здатні каталізувати низку перетворень в інших РНК). Перший рибозим, нагадує за своїми властивостями эндонуклеазы рестрикції, було отримано Т. Чеком. У науковій літературі його позначають його як рибозим L-19. Цей рибозим є РНК у 395 нуклеотидних залишків, в розмірі 5 «-кінцевий області якої є гексануклеотидная послідовність GGAGGG, відповідальна за специфічність розщеплення попередника 26S РНК при самосплайсинге. Ця послідовність комплементарна CUCUCU послідовності, розташованої на 3 «-кінці першого экзонного ділянки попередника 26S РНК. Якщо цю РНК замінити інший, але що містить доступну для комплементарного зв’язування CUCUCUA послідовність, то рибозим L-19 у присутності гуанозина чи гуаниловых нуклеотидів з вільною 3 «-гидроксильной групою розщепить ее.

Джерелом необхідних ділянок РНК може слугувати такий спосіб, як синтез фрагментів РНК. Ферментативний синтез сегментів РНК здійснюють з використанням різноманітних генно-інженерних конструкцій. Однак у зараз у переважну більшість випадків для препаративного отримання РНК використовуються РНК-полімерази, закодовані в геномах низки ДНК-содержащих бактеріофагів (Т3, Т7 і SP6). Вони характеризуються дуже високої активністю і на відміну від клітинних РНК-полимераз, складаються з однієї полипептидной ланцюга. Важливо і те, що ініціація і терминация синтезу РНК цими полимеразами відбувається однією певному нуклеотидном остатке.

Отримані однією з способів фрагменти нуклеїнових кислот надалі убудовують в векторні молекулы.

Підсумовуючи викладеного, можна дійти невтішного висновку, що одержання генів протективных білків збудників є досить складну завдання. Проте його виконання необхідне створення кінцевому підсумку рекомбінантних противірусних вакцинних препаратов.

1.2. ВИБІР ВЫСОКОАКТИВНОЙ І ДОБРЕ ВИВЧЕНІЙ В.

ИММУНОЛОГИЧЕСКОМ ОТНОШЕНИИ МОДЕЛІ ВЕКТОРА-НОСИТЕЛЯ І КЛОНИРОВАНИЕ.

ВІДПОВІДНОГО ГЕНА.

1.2.1. ОТРИМАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ ДНК.

Суть конструювання рекомбінантних ДНК полягає в вбудовування фрагментів ДНК, серед яких міститься цікавий для нас ділянку ДНК, в так звані векторні молекули ДНК (чи навіть вектори) — плазмидные чи вірусні ДНК, які можна перенесені у клітини прочи эукариот і там автономно репли-цироваться. На наступний етап проводиться підбір тих клітин, яких зазнають у собі рекомбинантные ДНК (з допомогою маркерних ознак, які має сам вектор), і далі індивідуальних клонів з цікавлячим нас сегментом ДНК (використовуючи ознаки чи проби, специфічні для даного гена чи ділянки ДНК).

За позитивного рішення низки наукових установ та біотехнологічних завдань конструювання рекомбінантних ДНК вимагає також створення систем, у яких забезпечується максимальна експресія клонируемого гена.

Існує три основних способи вбудовування чужорідної ДНК в векторні молекули. У першому випадку 3 «-кінці фрагментів ДНК, серед яких міститься цікавий для нас ділянку ДНК (ген або його сегмент, регуляторний район), з допомогою ферменту термінальній нуклеотидилтрансферазы нарощуються гомополинуклеотидной послідовністю (наприклад, поли (Т)). 3 «-кінці лінійної форми векторної ДНК у той спосіб нарощуються комплементарної їй гомополинуклеотидной послідовністю (тобто поли (А)). Це дозволяє з'єднати дві молекули ДНК шляхом комплементарного спарювання штучно отриманих «липких «концов.

У другий випадок «липкі «кінці створюються з допомогою розщеплення молекул ДНК (як векторної, і що містить цікавий для нас фрагмент) одній з эндонуклеаз рестрикції (рестриктаз). Рестриктазы характеризуються винятково високою специфічністю. Вони «дізнаються «в ДНК послідовність з кількох нуклеотидних залишків і розщеплюють у яких суворо визначені межнуклеотидные зв’язку. Тож у ДНК великих розмірів рестриктазы вносять обмежену кількість разрывов.

Третій спосіб є комбінацію двох перших, коли липкі кінці ДНК, освічені рестриктазой, подовжуються синтетичними послідовностями (рис. 1).

Кінці фрагментів ДНК можна перетворити на «липкі «, нарощуючи їх двутяжевыми олигонуклеотидами («линкерами »), до складу яких входить ділянку впізнавання рестрикта- [pic].

Малюнок 1. Схема конструювання рекомбінантною ДНК з допомогою рестриктаз.

PstI і поли (G) — поли (С)-линкера.

зой. Обробка такого фрагмента даної рестриктазой робить її придатним для вбудови у векторну молекулу ДНК, розщеплену тієї ж рестриктаэой. Часто як «линкера «застосовуються полинуклеотидные фрагменти, які містять специфічні ділянки відразу для кількох рестриктаз (їх називають «полилинкерами »).

Після вбудовування чужорідної ДНК в вектор їх ковалентное зшивання здійснюється ДНК-лигазой. Якщо ж розмір проломи в рекомбинированной молекулі перевищує одну фосфодиэфирную зв’язок, вона забудовується in vitro з допомогою ДНК-полимеразы чи in vivo з допомогою репарирующих систем клетки.

1.2.2. ОТРИМАННЯ РЕКОМБІНАНТНИХ РНК.

Одержання рекомбінантних РНК зазвичай здійснюють методами ферментативного або хімічної лигирования РНК. З іншого боку, недавно з’явилася принципово нова можливість вбудовування сегмента РНК в заданий становище інших молекул РНК з допомогою рибозимов.

Ковалентное зшивання окремих сегментів РНК і при отриманні рекомбінантних молекул, зазвичай, здійснюють з допомогою Т4 РНК-лигазы. Т4 РНК-лигаза закодована в геномі бактериофага Т4. Її виділяють з клітин E. coli, заражених цим фагом. Фермент зшиває друг з одним однотяжевые олигоі полирибонуклеотиды. Робота Т4 РНК-лигазы необхідний джерело енергії - аденозинтрифосфат. На рис. 2 приведено схема ферментативного лигирования двох коротких олігонуклеотидів. Як очевидно з цієї схеми, акцептором у реакції лигирования служить повністю дефосфорилированный, а донором — повністю фосфорований по концевым нуклеотидным залишкам олигонуклеотид. Це запобігає можливість зшивання однотипних олигонуклеотидов.

Ефективність ферментативного лигирования досить довгих полирибонуклеотидов сильно варіює і його важко передбачити виходячи лише з нуклеотидної послідовності сегментів РНК. Найкращі результати одержані тому випадку, коли сшиваемые кінці полирибонуклеотидов були просторово зближені з допомогою комплементарного зв’язування сусідніх із ними ділянок РНК.

Нещодавно було встановлено, що довгі сегменти РНК (у 200- 300 залишків) може бути з великим виходом пошито Т4 ДНК-лигазой. У цьому «стикування «сегментів здійснюється з допомогою олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного 3 «-кінцю одного сегмента і п’яти «-кінцю другого.

Метод хімічного лигирования грунтується на активації кінцевий фосфатной групи однієї з двох сшиваемых сегментів РНК водорастворимым карбодиимидом или.

[pic].

Малюнок 2. Схема зшивання двох олигорибонуклеотидов з допомогою Т4 РНКлигазы.

BrCN. Що стосується BrCN реакція протікає дуже й не супроводжується модифікацією нуклеотидних залишків, хоча під впливом карбодиимидов фосфодиэфирная зв’язок утворюється з вищим виходом. А, щоб забезпечити сближенность сшиваемых кінцевих нуклеотидних залишків в фрагментах РНК, було запропоновано використати олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные обом фрагментами на місці їх стыка.

Хімічне лигирование РНК, зазвичай, відбувається з істотно меншим виходом, ніж ферментативное. Проте він дає змогу отримувати рекомбинантные РНК із досить незвичними типами межнуклеотидной зв’язку (наприклад, пирофосфатной) і незвичними нуклеотидными залишками на місці стику двох фрагментов.

Одержання рекомбінантних РНК з допомогою рибозимов грунтується на оборотності реакції самосплайсинга (за відсутності гуанозина чи гуаниловых нуклеотидів). Це дає можливість для вбудовування интронной РНК в поставлене ділянку іншого сегмента РНК (рис. 3). Фрагмент РНК, куди виробляється убудовування, мусить мати нуклеотидну послідовність, ідентичну нуклеотидної послідовності 3 «-концевого ділянки 5 «- экзонного району 26S РНК і комплементарную тієї нуклеотидної послідовності в интроне, що відповідає за специфічність прямий реакції. Фрагмент, куди виробляється убудовування, береться в избытке.

Нині описана тут ланцюг реакцій може бути лише интронной РНК, одержуваної з попередника 26S РНК тетрахимены. Проте це можна думати, що конструювання нових рибозимов може істотно розширити можливості цього подхода.

1.2.3. СТРАТЕГІЯ КЛОНУВАННЯ ГЕНОВ.

Векторні молекули в обов’язковому порядку містять маркерні гени, котрі після перенесення вектора в клетки-реципиенты повідомляють їм нові властивості. Це то, можливо опірність антибіотика, до трансформації клітини не мали, або освіта ферменту, синтез якого в клетках-реципиентах не відбувався. Завдяки таким знову придбаним ознаками клітини з векторными ДНК може бути легко знайдено в популяції вихідних клітин. Одночасно можуть забрати ті клітини, які містять вектори з умонтованими у яких чужорідними ДНК (рекомбинантные ДНК). І тому убудовування чужорідної ДНК в вектор виробляється в такий спосіб, щоб одне із маркерних ознак вектора порушувався. Приміром, якщо бактеріальний вектор несе опірність двом антибіотиків, то чужорідну ДНК убудовують до одного [pic].

Малюнок 3. Схема прямого і наверненого процесу самосплайсинга.

из генів антибиотической стійкості. І тоді бактерії з рекомбінантною ДНК, на відміну бактерій з вихідним вектором, можуть рости у присутності одного з антибиотиков.

Інший вельми поширений приклад пов’язані з наявністю в векторної ДНК поруч із генами, надаючи клітині стійкість до антибіотиків, фрагмента лактозного оперона, забезпечує освіту у клітинахреципиентах активного ферменту (-галактозидазы. Колонії клітин із таким ознакою легко виявляються при вирощуванні їх у твердому агарі, що містить як субстрату (-галактозидазы 5-бром-4-хлор-3-индолил-(- галактозид (X-gal), оскільки його розщеплення призводить до утворення бромхлориндола — барвника, пофарбованого у блакитній колір. Якщо ж у ген (- галактозидазы цього вектора її вмонтовано чужорідна ДНК в такий спосіб, що це ген виявився порушеним, то трансформовані їм клітини становитимуть безколірні колонії. Саме ж присутність рекомбинантного вектора у клітинах то, можливо зафіксовано з їхньої стійкості до антибиотику.

На наступний етап серед популяції клітин із рекомбінантними векторами необхідно відібрати індивідуальні клони, містять лише цікаві для нас гени чи його фрагменти. Звісно ж, що це у принципі можна тільки у разі, тоді як вихідні клітини проникло у середньому однієї молекулі рекомбінантною ДНК. Спосіб ж відбору клонів значною мірою залежить від природи клонируемого гена.

Очевидно, найпростішим є випадок, коли клонируемый ген здатний комплементировать ауксотрофную мутацію в штамме-реципиенте. У цьому вся разі клітини высеваются на середу, позбавлену речовини, який буде необхідний зростання даного штами, і лише клітини, містять рекомбинантную ДНК з потрібним геном, здатні зростати в цій середовищі. З таких клонів отримують гомогенну культуру клітин, використовувана щоб одержати шуканого сегмента ДНК, проробляючи усі фінансові операції у порядку (тобто з клітин виділяють вектор, потім із нього вычленяют необхідний фрагмент ДНК й дуже далее).

Набагато частіше для відбору необхідних клонів доводиться вдаватися до методу ДНК-ДНКчи ДНК-РНК-гибридизации. І тому необхідно розташовувати «зондами «(індивідуальними молекулами ДНК чи РНК чи його фрагментами), комплементарними нуклеотидної послідовності клонируемого гена. Це може бути спеціально синтезовані олигодезоксирибонуклеотиды у 15−20 залишків, послідовність яких обрано виходячи з повністю чи частково відомої первинної структури гена чи закодованої у ньому білка. Це може бути кДНК, синтезовані на індивідуальних РНК-копиях даного гена (як такі або у вигляді отклонированных, тобто значно помножених у кількості фрагментів ДНК). Нарешті, що можуть бути самі індивідуальні РНК, закодовані у цьому гені. Зрозуміло, що у всіх випадках «зонди «повинні нести радіоактивну мітку (зазвичай 32Р) з досить високої удільної активностью.

Якщо ж індивідуальний «зонд «недоступний, то застосовують методи, які із великої числа рекомбинантов (106) дозволяють вибрати порівняно невелику групу (близько 102), що включає рекомбинант з потрібним геном. Ця група підрозділяється на підгрупи (наприклад, на 10) по 10 рекомбинантов. З кожної підгрупи виділяється ДНК, використовувана для синтезу мРНК і наступної трансляції її з виявлення відповідного продукту шуканого гена.

Трансляція мРНК можна здійснити в бесклеточной системі. Проте у разі эукариотических генів мРНК часто переносять в ооциты жаби (ксенопуса) з допомогою техніки мікроін'єкції, де транслюється. Продукт трансляції зазвичай виявляють з допомогою антител.

Далі в підгрупі, де виявлено шуканий ген, тим самим методом досліджується кожен клон.

За наявності зонда з чашки Петрі, де вирощені колонії клітин, робиться відбиток (репліка) на нитроцеллюлозном фільтрі. Клітинам дають вирости на фільтрі, потім їх одягнули руйнують, піддають ДНК лужної денатурації і фільтр прогрівають при 80 °C, після чого ДНК необоротно з нею пов’язується. Фільтр відмивають від домішок і обробляють радіоактивним «зондом «в умовах, оптимальних для ДНК-ДНКчи ДНК-РНК-гибридизации. Після відходу надлишку «зонда «методом ауторадиографии визначають становище клітинного клона, що містить ділянку ДНК з нуклеотидної послідовністю, комплементарної «зонду ». Цей клон стає згодом джерелом клітин для одержання потрібного гена або його фрагмента.

Для селекції клонів, несучих необхідний ген, досить застосовуються і імунологічні методи. Принцип відбору перших етапах той ж, що й за використанні ДНКі РНК-зондов. Далі з колоній з рекомбінантними ДНК робиться репліка з допомогою полімерної платівки, на якої закріплені антитіла до продукту шуканого гена. Становище клонів, які б виробляли цього білка, визначається також за допомогою антитіл, але вже настав мічених радіоактивним йодом (125I).

1.2.4. РАЗНООБРАЗИЕ ВЕКТОРНИХ МОЛЕКУЛ.

Під поняттям «вектор «розуміється молекула нуклеїнової кислоти, здатна після введення клітину до існування з допомогою наявності у ній сигналів реплікації і транскрипции.

Векторні молекули повинні мати такими свойствами:

1) здатністю автономно реплицироваться в клстке-реципиенте, тобто бути самостійною репликоном;

2) утримувати чи кілька маркерних генів, завдяки експресії яких в клетки-реципиента з’являються нових ознак, дозволяють відрізнити трансформовані клітини від исходных;

3) утримувати за одним чи, найбільше, дві ділянки (сайту) для різних рестриктаз різних районів (зокрема у складі маркерних генів), але не області, відповідальної право їх репликацию.

Залежно від цілей експерименту вектори можна умовно розділити на дві групи: 1) використовувані для клонування і амплификации потрібного гена; 2) спеціалізовані, застосовувані для експресії вбудованих чужорідних генів. Друга ж група векторів об'єднує вектори, покликані забезпечити синтез білкових продуктів клонованих генів. Вектори для експресії містять послідовності ДНК, що необхідні транскрипції клонованих копій генів і показу їхніх мРНК в штами клеток.

Як прокариотических векторів використовуються плазміди, бактеріофаги; як эукариотических векторів застосовують віруси тварин і рослин, вектори з урахуванням 2 мкм дріжджів і мітохондрій і кілька штучно сконструйованих векторів, здатних реплицироваться як і бактеріальних, і у эукариотических клітинах (човникові векторы).

Плазмідами — це внехромосомные генетичні елементи проі эукариот, які автономно реплицируются у клітинах. Більшість плазмидных векторів отримано з урахуванням природних плазмід ColE1, pMB1 і p15A.

Бактеріальні плазмідами ділять на два класу. Одні плазмідами (наприклад, добре вивчений чинник F, визначальний підлогу у E. coli) самі в змозі переходити з клітки у клітину, інші такий здатністю що немає. По ряду про причини і передусім на запобігання неконтрольованого поширення потенційно небезпечного генетичного матеріалу, переважна більшість бактеріальних плазмидных векторів створено з урахуванням плазмід другого класу. Багато природні плазміди вже містять гени, що визначають стійкість клітин до антибіотиків (продукти цих генів — ферменти, модифікують чи расщепляющие антибіотичні речовини). З іншого боку, в ці плазмідами при конструюванні векторів вводяться додаткові гени, що визначають опірність іншим антибиотикам.

На рис. 4 показаний одне із найбільш поширених плазмидных векторів E. coli — pBR322. Він сконструйовано з урахуванням детально вивченій плазміди E. coli — колициногенного чинника ColE1 — і має ориджин реплікації цієї плазміди. Особливість плазміди ColE1 (і pBR322 відповідно) полягає у тому, що у присутності інгібітору синтезу білка антибіотика хлорамфеникола (опосередковано ингибирующего репликацию хазяйської хромосоми) її число в E. coli зростає від 20−50 до 1000 молекул на клітину, що дозволяє отримувати велику кількість клонируемого гена. При конструюванні вектора pBR322 із вихідних плазмід делегували низку «зайвих «сайтів для рестриктаз.

Нині поруч із безліччю зручних векторних систем для E. coli сконструйовані плазмидные вектори для інших грамотрицательных бактерій (зокрема таких промислово важливих, як Pseudomonas, Rhizobium і Azotobacter), грамположительных бактерій (Bacillus), нижчих грибів (дріжджі) і растений.

Плазмидные вектори зручні для клонування відносно невеликих фрагментів (до 10 тис. пар підстав) геномів невеликих розмірів. Якщо ж потрібно отримати клонотеку (чи бібліотеку) генів вищих рослин i тварин, загальна довжина геному яких нині сягає розмірів, то звичайні плазмидные вектори цих цілей непридатні. Вирішення проблеми створення бібліотек генів для вищих эукариот вдалося розв’язати з допомогою в ролі клонирующих векторів похідних бактериофага (.

Серед фаговых векторів найзручніші системи створено з урахуванням геномів бактеріофагів (і М13 E.coli. ДНК цих фагов містить довгі області, які можна делегувати чи замінити на чужорідну ДНК, не чіпаючи їх спроможність реплицироваться у клітинах E.coli. При конструюванні сімейства векторів з урахуванням ДНК (фага з її спочатку (шляхом ділень коротких ділянок ДНК) було видалено багато сайти рестрикції з області, не істотною для реплікації ДНК, і залишилися такі сайти в області, настановленим вбудовування чужорідної ДНК. У цю область часто убудовують маркерні гени, дозволяють відрізнити рекомбинантную ДНК від вихідного вектора. Такі вектори широко йдуть на отримання «бібліотек генів ». Розміри замещаемого фрагмента фаговой ДНК і відповідно встраиваемого ділянки чужорідної ДНК обмежені 15−17 тис. нуклеотидних залишків, оскільки рекомбинантный фаго ;

[pic].

Малюнок 4. Детальна рестрикционная карта плазміди pBR322.

вый геном, який 10% більше або на 75% менше геному дикого (фага, не то, можливо упакований в фаговые частицы.

Таких обмежень теоретично немає для векторів, сконструйованих з урахуванням нитчатого бактериофага М13. Описано випадки, коли в геном цього фага була вмонтована чужорідна ДНК завдовжки близько 40 тис. нуклеотидних залишків. Відомо, проте, що фаг М13 стає нестабільним, коли довжина чужорідної ДНК перевищує 5 тис. нуклеотидних залишків. Але фактично вектори, отримані з ДНК фага М13, використовуються головним чином заради секвенування і мутагенезу генів, й розміри які вбудовуються у них фрагментів набагато меньше.

Ці вектори конструюються з реплекативной (двутяжевой) форми ДНК фага М13, у якому вмонтовані «полилинкерные «ділянки (приклад такої конструкції показаний на рис. 5). У фаговую частку ДНК входить у вигляді однотяжевой молекули. Отже, цей вектор дає змогу отримувати клонований ген або його фрагмент як і двутяжевой, і у однотяжевой формі. Однотяжевые форми рекомбінантних ДНК широко використовують у справжнє час щодо нуклеотидної послідовності ДНК методом Сэнгера й у олигодезоксинуклеотид-направленного мутагенезу генов.

Перенесення чужорідних генів у клітини тварин здійснюється з допомогою векторів, отриманих з ДНК низки добре вивчених вірусів тварин — SV40, деяких аденовірусів, вірусу папіломи бика, вірусу віспи тощо. Конструювання цих векторів проходить за стандартною схемою: видалення «зайвих «сайтів для рестриктаз, запровадження маркерних генів у області ДНК, не суттєві на її реплікації (наприклад, гена тимидин-киназы (tk) з HSV (вірусу герпесу)), запровадження регуляторних районів, що підвищують рівень експресії генов.

Зручними виявилися звані «човникові вектори », здатні реплицироваться як і клітинах тварин, і у клітинах бактерій. Їх отримують, зшиваючи друг з одним великі сегменти векторів тварин і звинувачують бактерій (наприклад, SV40 і pBR322) те щоб райони, відповідальні репликацию ДНК, залишилися незатронутыми. Це дає змогу провадити основні операції з конструювання вектора в бактеріальної клітині (що технічно набагато простіше), та був отриману рекомбинантную ДНК використовуватиме клонування генів у тваринної клетке.

[pic].

Малюнок 5. Рестрикционная карта вектора М13 mp8.

1.3. ВИБІР СИСТЕМИ ЕКСПРЕСІЇ КЛОНИРОВАННОГО.

ГЕНА, ЗДАТНОЇ ЗАБЕЗПЕЧИТИ МАКСИМАЛЬНИЙ ВИХІД И.

ФУНКЦІОНАЛЬНУ ПОВНОЦІННІСТЬ ПРОДУКТА.

Отримані рекомбинантные молекули переносяться у визначені групи клітин, яка має забезпечити експресію цих генів, тобто синтез відповідних білків у кількості, економічно рентабельних по порівнянню зі звичайною технологією їх производства.

Зазвичай для даної мети використовують бактеріальні чи дріжджові культури клітин, і навіть системи експресії з урахуванням эукариотических клеток.

З бактеріальних клітин найбільш вивченій в молекулярно-генетичному плані є грамотрицательная бактерія Escherichia coli, для неї з найбільшої визначеністю планувати генно-інженерні конструкції. Проте E. coli слабко освоєна промисловістю. З іншого боку, вона належить до условно-патогенным в людини мікроорганізмам, що далі міг створити труднощі і при отриманні її основі фармацевтичних препаратов.

Відзначені недоліки E. coli легко долаються при конструюванні методами генної інженерії штамів-продуцентів з урахуванням клітин Bacillus subtilis. Ця ґрунтова бактерія безпечна в людини і тварин і звинувачують чудово освоєна мікробіологічної промисловістю. Бактерія B. subtilis за рівнем вивченості слід за E. coli. Важливе відмінність його від E. coli — здатність ефективно секретировать в навколишнє середовище низку білків, тому особливо цікаві робота зі створення штамів-продуцентів B. subtilis, секретирующих чужорідні білки з клітин. Проте ця бактерія має свої вади: рекомбинантные плазміди в B. subtilis характеризуються нестабільністю, яке виражається в перебудовах і делециях ДНК; бацили секретують в культуральне середовище дуже багато протеаз, що ускладнює питання максималізації генноинженерного отримання цільового білка з урахуванням бацилл-продуцентов.

Серед эукариотических мікроорганізмів найбільш вивченим є нижчий эукариот Saccharomyces cerevisiae. Один із переваг P. S. cerevisiae як експериментальної системи — простота і надійність її генетичного аналізу. У клітинах дріжджів є ферментативна система гликозилирования білків, що забезпечує можливість синтезу у яких повноцінних білків вищих эукариот. Аналогічних систем процесингу білків в бактеріальних клітинах немає. Багато штами дріжджів освоєно мікробіологічної промисловістю. Доведено їх нешкідливість в людини і тварин. Саме на P. S. cerevisiae створено перший штамм-продуцент поверхового антигену вірусу гепатиту Б, що дозволило отримати й випробувати вакцину проти даного вірусного захворювання человека.

З появою генної інженерії увагу багатьох дослідників залучила система культивованих клітин тварин. Особливу увагу до культурам клітин тварин став виявлятися після виявлення те, що частина эукариотических генів розколотою і у системі клітин вищих эукариот можна досягнути правильної експресії таких генів. З іншого боку, багато білків тварин і звинувачують їх вірусів синтезуються спочатку з більш високомолекулярних попередників, які під час специфічного протеолитического процесингу переходить до так звану зрілу форму. Такий процессинг даних білків, очевидно, можна лише у системі клітин тварин. Усе це переконливо свідчить важливість розробки експресуючої системи з урахуванням клітин животных.

Задля більшої найефективнішою експресії клонованих генів у векторні молекули убудовують певні фрагменти ДНК, дозволяють збільшити вихід чужорідного білка. Так, задля досягнення вищого рівня експресії гена HBsAg у клітинах E. coli було використано різні за силою промотори (промотори генів cat, kan, bla, trp і тандемно розташованих промоторів генів kan і trp). Рівні синтезу послідовностей HВsAg (нативного у складі химерних білків) становили, залежно від використовуваних конструкцій векторів від 100 до 100 000 молекул на клетку.

1.4. СТВОРЕННЯ ДОСТАТОЧНО ЗРУЧНИХ І ПО ВОЗМОЖНОСТИ.

УНІВЕРСАЛЬНИХ ВЕКТОРІВ ДЛЯ ЦІЛЬОВОЇ ДОСТАВКИ ГЕНІВ В.

КЛІТИНИ І ТКАНИНИ ОРГАНИЗМА.

Важливим моментом при конструюванні ДНК-вакцин є проблема цілеспрямованої доставки генів у необхідні клітини, і захисту впроваджуються ДНК від дії нуклеаз крові. Через війну експериментальної праці були створені різноманітні конструкції, дозволяють доставляти цільові гени в клетки-мишени.

Однією з таких конструкцій є модель молекулярного вектора для доставки генів у такі клітини, як лімфоцити і кераноциты. Як модельного використали ген, який кодує гібридний білок: чинник некрозу опухолей-альфа — интерферон-гамма. У центрі вектора перебуває интактная плазмидная ДНК, яка містить доставляється ген, але в поверхні розташовуються антитіла до клеткам-мишеням. Конъюгат полиглюкина зі спермидином і антитілами застосовується для зв’язку компонентів (позитивно заряджений спермидин забезпечує зв’язування конъюгата з плазмидной ДНК). Описаний молекулярний вектор дозволяє цілеспрямовано доставляти гени у клітинимішені, зводячи до мінімуму їхнє потрапляння до інших види клітин, захищати доставляемые гени від нуклеаз крові й використовувати позитивно заряджений комплекс спермидин-полиглюкин за стимулятор проникнення ДНК в клетки.

Нині також створена векторна модель для постачання клітини кісткового мозку гена, що кодує гранулоцитарный колониестимулирующий чинник людини (чГ-КСФ). Цей білок належить сімейства гемопоетичних чинників розвитку і одна із фізіологічних регуляторів, специфічно і високоефективно стимулюючих пролиферацию і диференціювання гемопоетичних попередників нейтрофилов. чГ-КСФ збільшує тривалість життя клітин кісткового мозку, посилює функціональну активність зрілих нейтрофилов. Створений вектор представляє собою багатошарову конструкцію. «Центральним ядром «конструкції є плазмида pGGF8, яка містить ген чГ-КСФ. Її оточує полисахаридная оболонка, що складається з полиглюкина і спермидина. Зовнішній білковий шар містить суміш сироваткового альбуміну й білків доставки — трансферина. Ефективність описаної векторної моделі було доведено досвідченим путем.

Отже, при конструюванні рекомбінантних противірусних вакцин чимале значення має створення спеціального вектора-носителя, забезпечує адресну доставку генів і захист від дії нуклеаз крови.

2. ВАКЦИНА ПРОТИ ЛЕЙКЕМІЇ КОШЕК,.

ВИГОТОВЛЕНА З ДОПОМОГОЮ ГЕННОЇ ИНЖЕНЕРИИ.

Збудником лейкемії кішок є ретровирус типу З. Вірус лейкемії кішок (FeLV) має у ролі генетичного матеріалу молекулу РНК. Захворюваність й дитяча смертність серед домашніх кішок у Швейцарії досить висока. Вакцина проти FeLV, виготовлена традиційним шляхом, була розроблена кілька років тому й у про продаж у Швейцарії. Висока ціна сучасних вакцин і відсутність впевненості у відношенні тривалості і надійності вакцини викликали необхідність створення вакцини з допомогою генної инженерии.

При конструюванні рекомбінантною вакцини оболочечный протеїн вірусу (env-ген) клонировался в пивних дріжджах (Saccharomyces cerevisiae). Env-ген спочатку лигировался з промотором дріжджів (пируваткиназный промотор), а потім клонировался в так званому «Shuttle «-векторі. Вектор «Shuttle «(човниковий вектор) може розмножуватися як і бактерії E. coli, і у пивних дріжджах P. S. cerevisiae. Он містить з одного боку репликационные оригины як дріжджів, так E. coli, з другого боку селекційний маркер для дріжджів (leu2 ген) й у E. coli (резистентність до ампицилину). З літра дріжджової культури виділяють безліч міліграм env-протеина і потім тестують в досвіді по вакцинації. Результат вселяє надію: 10 кішок були імунізовані env-протеином, причому 4 відповіла антитілами. Через 2 тижня провели зараження FeLV. Тепер усі тварини давали відповідь антителами.

Отже, отримана вакцина виявилася ефективним засобом боротьби з цим заболеванием.

1. Грен Еге. Я., Пумпен П. П. Рекомбинантные вірусні капсиды — нове покоління иммуногенных білків і вакцин // Журнал ВХО. — 1988. — т.

II, № 5. — з. 531−536.

2. Дмитрієв Б. А. Проблеми та перспективи створення синтетичних вакцин.

// Імунологія. — 1986. — № 1. — з. 24−29.

3. Лебедєв Л. Р., Сизов А. А., Масычева У. І., Карпенко Л. И.,.

Рязанкин І. А. Молекулярний вектор для доставки генів у клітинимішені // Біотехнологія. — 2001. — № 1. — з. 3−12.

4. Мерців М. П., Беклемишев А. Б., Савич І. М. Сучасні підходи до конструювання молекулярних вакцин. — Новосибірськ: Наука, 1987,.

210 с.

5. Сизов А. А., Лебедєв Л. Р., Масычева У. І., Кашперова Т. А., Одегов.

А. М. Розробка вирус-подобной конструкції для рецепторопосередкованого транспорту гена чГ-КСФ у клітини кісткового мозку in vivo // Біотехнологія. — 2001. — № 1. — з. 13−18.

6. Шабарова З. А., Богданов А. А., Золотухін А. З. Хімічні основи генетичної інженерії. — М.: Вид-во МДУ, 1994, 224 с.

7. Щелкунов З. М. Клонування генів. — Новосибірськ: Наука, 1986, 232 с.

8. Юров Р. До., Народицький Б. З., Юров До. П. Конструювання і ДНК-вакцин // Ветеринарія. — 1998. — № 12. — з. 25−27.

9. Hubscher U. Генна інженерія і ветеринарія. Вакцини, виготовлені за допомогою генної інженерії, і аналіз высоковариабельных участков.

ДНК. -Schweiz. Arch. Tierheilk., 1987, 129, № 11, 553−564.