Создание біологічного водія ритму серця

Создание біологічного водія ритму серця.

Майкл Розен (Michael R. Rosen), доктор медицини.

По смертності серцево-судинні захворювання як і займають провідне позиції у світі. Серед поширених серцевих патологій — аритмії, причинами яких може бути різні функціональні і органічні поразки міокарда (передусім інфаркт, ішемічна, хвороба, вроджені або куплені пороки серця тощо.). У нормально працюючому серці ритмічні скорочення міокарда відбуваються під дією імпульсів, які спонтанно зароджуються у клітинах сино-атриального вузла (мал.1). Інакше вона називається первинним водієм ритму, чи пейсмекером (анг. pacemaker — ставить ритм). Від неї порушення поширюється по предсердиям, примушуючи їх одночасно скорочуватися, і перекачувати кров в шлуночки, і сягає атрио-вентрикулярного вузла. Далі електричний імпульс через пучок Гиса сягає його кінцевих розгалужень — волокон Пуркинье — і викликає скорочення шлуночків, унаслідок чого кров виганяється з серця в органи влади та тканини організму.

.

Рис. 1. Схема розташування водія ритму і проводить системи в сердце.

Если у тій чи іншої причини порушення сино-атриального вузла немає або може перейти на передсердя, його роль виконують пейсмекеры другого порядку, локалізовані в предсердии чи атрио-вентрикулярном поєднанні. За повної поперечної блокаді, коли проведення порушення від передсердь до желудочкам повністю порушено, включаються пейсмекеры, які працюють у проводить системі шлуночків. Якщо й цього немає, то припинення кровообігу внаслідок зупинки шлуночків можуть призвести до необоротному пошкодження мозку і навіть смерті.

При повному порушенні автоматизму серця збуджуваність міокарда все-таки зберігається у протягом певного часу, і тоді допоможе приходять штучні водії ритму — кардіостимулятори. Хоча за майже піввікове використання (перший портативний водій серцевого ритму з батарейным харчуванням було розроблено на 1957 р.) електронні пейсмекеры виявили дуже добре, тим щонайменше вони мають ряд недоліків. По-перше, де вони регулюють реакцію серцевого м’яза на фізичні й емоційні навантаження. По-друге, у разі, коли, наприклад, хворий дитина, має значення маса кардиостимулятора й розміри його електродів, що найчастіше відповідають ростові, і розвитку пацієнта. По-третє, через локалізації пейсмекерного електрода у серце який завжди вдається домогтися оптимальної активації порушення та скорочення. По-четверте, штучні водії ритму періодично повинні тестуватися і потребують заміни батарейок кожні 5−10 років, тобто. практично повторної операції. І, насамкінець, деякі прилади (зокрема і медичні - наприклад, томографи) можуть проводити роботу електронного пейсмекера.

Словом, хоч би як годилися навіть найсучасніші кардіостимулятори, пошук альтернативи необхідний. Один із перспективних рішень — біологічний водій ритму, котрі можуть працювати необмежене час, відповідати на фізіологічні команди, змінюючи серцевий ритм залежно та умовами і активуючи серці зі огляду на специфіку захворювання будь-якої людини. Активне розвиток останніх років генної та клітинної терапії дозволяє сподіватися, що така біологічна пейсмекер буде створено, і в кардіології з’явиться новий спосіб лікування аритмій [1].

Во всіх дослідженнях зі створення біологічних пейсмекеров застосовувалися два підходу: запровадження специфічних генів у складі плазмидных чи вірусних векторів і різних типів стовбурових ембріональних клітин. При плануванні робіт бралися до уваги такі характеристики сино-атриального вузла:

— слагающие його клітини спеціалізовані, тобто. призначені для ініціації серцевих скорочень [2];

— спонтанна генерація імпульсів відповідає фізіологічним і емоційним потребами організму, що зумовлено взаємодією іонних каналів і насосів [3];

— поширення імпульсів має бути оптимальним для активації скорочення.

При розробці стратегії досліджень враховувалося, формування спонтанних імпульсів в сино-атриальном вузлі відбувається внаслідок активації спеціального струму If, канали якого відкриті понад сотню мілісекунд, а зміна цього струму у часу добре підбудовує ритм серця [4, 5]. У пейсмекерный струм вносять внесок і вхідні (наприклад, INa), і виходять (IK) струми, і навіть їхню взаємодію, у якому збільшення вхідного струму і/або зменшення що виходить призводить до почастішання ритму серця [3, 6−10].

Генная терапія.

Влияние на автоматизм серця симпатичної нервової системи, яке опосередковано дією її медіаторів (адреналіну і норадреналіну), добре вивчено. У зв’язку з цим перші роботи з створенню біологічних пейсмекеров були спрямовані на активацію b-адренорецепторов, що зумовлює фосфорилированию мембранних білків і посиленню вхідних струмів. Дослідники сподівалися домогтися підвищення автоматизму серця внаслідок запровадження передсердя свині спеціально сконструйованого плазмидного вектора з геном, кодирующим 2-адренорецептор [11, 12]. Справді, ритм передсердь став достовірно вище вихідного рівня. Здавалося, шлях до успіху прокладено, проте ефект тривав лише близько 24 год, і не впевненості, що, продовжуючи дослідження, у цьому напрямі, можна домогтися сталої роботи водія ритму. Неясно було й, що в разі сталося — корекція існуючої пейсмекерной активності чи формування нової.

Следующим кроком стали експерименти, у яких спробували впливати на виходить, гіперполяризуючий струм IK [13, 14]. Для цього використовували аденовирусный вектор з умонтованим мутантным геном Kir 2.1, кодирующим жодну з білкових субодиниць калієвого каналу [13]. Цю генну конструкцію вводили в порожнину лівого желудочка морської свинки, що привело через 3−4 дня до придушення калієвого струму IK на 80%. Протягом цієї часу спонтанний ритм реєструвався на электрокардиограмме, і потенціали дії кардіоміоцитів виявили його високий рівень. Головна вада такого підходу у тому, що придушення струму IK саме собою міг стати причиною аритмії. До того ж неясно, який із вхідних струмів забезпечував пейсмекерную функцію серця у разі, тому наслідки таких робіт непередбачувані [15].

Стратегия експериментів, проведених у нашої лабораторії, була для підвищення інтенсивності пейсмекерного струму If (чи струму автоматизму), що у нормі генерується лише у клітинах сино-атриального вузла. Цей змішаний струм (формується, як іонами натрію, і іонами калію) унікальна за своїй — природі, оскільки це єдиний струм, який збільшує тривалості потенціалу дії і регулюється автономної нервової системою [16, 17]. Відомо також, що канали, пропускають If, складаються з білків сімейства HCN (Hyperpolarization activated, Сyclic Nucleotide gated — активуються гиперполяризацией, а стан воріт — відкриття і закриття — залежить від циклічних нуклеотидів). Ген НСN2 вмонтували в аденовирусный вектор й Болгарія запровадили в клітинну культуру, що призвело як до підвищенню If, а й значного збільшення кількості розбитих клітин [18]. Понад те, при вплив ними изопротеренолом (синтетичним аналогом катехоламінів) ці клітини відповідали позитивним хронотропным ефектом (прискоренням серцевого ритму) і негативним хронотропным ефектом на ацетилхолин, звісно ж й відбувається у здоровому організмі. Отже, ці клітини потенційно здатні відповідати на фізіологічні команди [19].

Эксперименты продовжили на собак, які за допомогою катетера вводили в ліве передсердя аденовирусную конструкцію — AdHCN2 і AdGFP (GFP — green fluorescent protein — зелений флуоресцирующий білок, ген якого використовується для синтезу кольорової «мітки»). Потім стимуляцією блукаючого нерва (під наркозом) домоглися гноблення синусового ритму. Через чотири дні на області ін'єкції аденовируса виник новий ритм, чого було у контрольних тварин, яким вводили лише AdGFP чи фізіологічний розчин [20]. Понад те, в дезагрегированных клітинах серцевої м’язи, отриманих з місця ін'єкції, виявлено пейсмекерный струм в 100 разів більшою щільності проти нативными кардиомиоцитами.

Повторное запровадження AdHCN2 в желудочковую котра проводить систему тієї ж собак через чотири-сім днів із пригніченні синусового ритму сприяла появі на місці ін'єкції стійкого ускользающего ритму — близько 60 ударів на хвилину, частішого проти контролем (мал.2) [21]. Підвищена експресія HCN2 підтверджено з допомогою імунохімічних і біофізичних методів [22].

.

Рис. 2. ЕКГ собак, яким вводили аденовірусні конструкції з геном GFP (верхня запис) і генами GFP і HCN2 [21].

До ін'єкції синусовый ритм в обох собак був однаковий. Після його гноблення, що було викликано стимуляцією блукаючого нерва (час стимуляції зазначено стрілками), виникав идиовентрикулярный ритм, причому в тварини, якому вводили обидва гена, він був прискореним і виникав швидше проти контролем. На збільшених фрагментах записів видно, що у першому випадку (AdGFP + AdHCN2) порушення зароджується у лівій желудочке, тоді як у другому (AdGFP) — в правом.

Безусловно, із усіх перелічених підходів генної терапії обнадіюють лише результати останнього, оскільки лише цього разі виникав стабільно вислизаючий идиовентрикулярный (власне желудочковый) ритм прийнятного фізіологічного рівня життя та отримані докази відповідей викликаного ритму на активацію автономних нервів та його медіаторів. І все-таки обрана стратегія викликає сумніви, оскільки після припинення синусового ритму і по появи идиовентрикулярного проходить від 5 до 30 з, що із клінічною погляду неприпустимо. Незрозуміло також, вдасться з допомогою ін'єкції аденовирусной конструкції домогтися тривалої активності вона буде зберігатися лише дні або тижні. Сумніви викликані короткочасною експресією гена, що пов’язаний із властивостями аденовируса, в який його убудовують. Річ у тім, що у ядрі клетки-мишени геном аденовируса існує переважно у эписомальной формі, тобто. як кільцевих внехромосомных молекул, які у кожному циклі розподілу піддаються реплікації з допомогою ДНК-полимеразы клітини. Вірусна ДНК може вбудовуватися в лінійної формі в геном інфікованої клітини, тим щонайменше число эписомальных копій вірусної ДНК буде більше, ніж інтегрованих, що активізує імунну систему й призведе до повернення реформованій клітини у початковий стан. З іншого боку, аденовіруси — причина звичайній застуди, тому, можливо, декого будуть вже матимемо вдосталь рівні антитіл до аденовирусному капсиду (покриваючому білку), що утруднить потрапляння AdHCN2 в клітину. Інші вірусні вектори, наприклад, РНК-содержащие ретровіруси, хоч і мають деякими перевагами (ефективністю передачі, геномної інтеграцією, стійкою експресією) потенційно патогенны, оскільки мають онкогенными послідовностями.

Клеточная терапія.

Открытие здібності ембріональних стовбурових ембріональних клітин трансформуватися по меншою мірою в 350 різних типів клітин послужили потужним поштовхом до активної їх вивченню і відкрило перспективи їх використання їх у біології та медицині, зокрема і кардіології. Проте потрібно було навчитися ідентифікувати і виділяти клетки-предшественники, котрі після диференціювання можуть бути клітинами необхідної лінії. Опубліковані 1999 р. в «Science» результати експериментів Д. Томсона і Дж. Беккера, яким вдалося виділити людські ембріональні стовбурні клітини та отримати перші лінії спеціалізованих клітин, було визнано третім за важливістю подією (після відкриття подвійної спіралі ДНК і розшифровки геному людини) в біології минулого століття.

Когда з’ясувалося, що існують певні підтипи ембріональних стовбурних клітин генерують імпульси, подібні зі спонтанними імпульсами істинних водіїв ритму, спробували використовувати ці клітини як біологічних пейсмекеров [22]. Але й тут виникло чимало проблем.

Во-первых, оскільки незрілі ембріональні власні стовбурні клітини після припинення диференціювання можуть втратити пейсмекерные характеристики, було великим досягненням, якби останавить розвиток отриманих кардіоміоцитів на стадії сино-атриальных клітин.

Во-вторых, важливо з’ясувати, які канали визначають спонтанний ритм пересаджених клітин, й переконатися, що це саме ті канали, що забезпечують роботу істинних водіїв ритму у серце людини. З іншого боку, треба знати, як створена конструкція відповідатиме на стимуляцію вегетативних нервів, тобто. визначити чутливість нових кардіоміоцитів до автономним нервовим впливам. Це питання виникли у зв’язку з з потенційної аритмогенностью створюваних водіїв ритму [23]. Відповівши на опікується цими питаннями, можна було зрозуміти: розвиток аритмії у разі - артефакт (наприклад, слідство експериментальних маніпуляцій) чи потенційно небезпечне властивість біологічних пейсмекеров, створених з урахуванням ембріональних стовбурних клітин. І, насамкінець, не розв’язано проблему імунної системи організму на присутність які завершили диференціювання клітин. У цьому плані більш перспективні, на наш погляд, мезенхимальные власні стовбурні клітини, які, як і ембріональні, полипотентны (тобто. здатні диференціюватися до кількох клітинних ліній, включаючи клітини кістякових м’язів і клітини сполучної тканини), та заодно, очевидно, мають «иммунопривилегированностью» — під час останніх стадіях розвитку викликають істотного імунної системи [24].

Изначально власні стовбурні клітини були виявлено в кістковому мозку дорослого організму (точніше, в мезенхиме, чи строме, кісткового мозку). Згодом виявилося, що вони є практично переважають у всіх органах дорослих тварин і людини; тим щонайменше зазвичай їх виділяють з кісткового мозку. Отже, з’явилася приваблива перспектива: створення банку мезенхимальных стовбурових ембріональних клітин для клітинної терапії різних патологій. Що стосується, коли з будь-яким причин не можна використовувати донорські власні стовбурні клітини, їх джерелом може бути власний мозок пацієнта. Проте перш ніж це завжди буде введено в практику, потрібно понад старанно вивчити біобезпека, зокрема «иммунопривилегированность», стовбурових ембріональних клітин.

Мы розглядали мезенхимальные власні стовбурні клітини дорослої людини у ролі основного експериментального матеріалу. Насамперед нас залучили стабільність клітинних ліній та його низька антигенность. Проте мезенхимальные власні стовбурні клітини людини неспроможні генерувати пейсмекерный струм If, тож було навантажити їх геном HCN2, який, нагадаю, відпо-відає трансляцію синтезу білків, формують і що переносять If. Зроблено було з допомогою методу электропорации: клітини помістили в пульсує електричне полі, завдяки чому тимчасово відкривалися пори в клітинної мембрані, якими міг проникнути вірусний переносник зі вбудованим геном HCN2; у своїй ефективність зараження становила 35−45% [25].

.

Рис. 3. ЕКГ собаки через п’ять днів після імплантації мезенхимальных стовбурових ембріональних клітин людини, містять гени GFP і HCN2, в эпикард її лівого желудочка [26]. Зліва направо: синусовый ритм доі від початку стимуляції блукаючого нерва, идиовентрикулярный ритм під час вагусной стимуляції та своєчасне відновлення синусового ритму після припинення стимуляції блукаючого нерва.

Модифицированные людські власні стовбурні клітини з экспрессированным геном HCN2 були пересаджені в невелику область эпикарда лівого желудочка собак [25]. За тиждень вони і натомість гноблення ритму сино-атриального вузла розвинулися ритми ускользания із частотою 60 порушень на хвилину (рис.3). Локалізація джерела ритму на місці імплантації стовбурових ембріональних клітин визначалася з допомогою методу флуоресцентного оптичного картирования *.

* «Оптичні виміру трансмембранного потенціалу задумали американським дослідником Л.Коэном. Ідея полягає в властивості спеціально синтезованих молекул-флуорофоров, які, зв’язавшись з клітинної мембраною, здатні поглинати і випромінювати світ із ефективністю, яка від величини електричного поля, де знаходиться ця молекула. Отже, висвітливши серце, прокрашенное флуорофором, можна оптично виміряти кінетику трансмембранного потенціалу за змінами інтенсивності чи довжини хвилі флуоресценции. Понад те, застосовуючи сучасні методи двомірної реєстрації світла, можна складати карти зміни трансмембранного потенціалу лежить на поверхні серця. Оптична природа вимірів дозволяє змінювати просторова роздільність картирования сигналів шляхом простий заміни оптичного збільшення. Нині картування трансмембранного потенціалу ввозяться широкому діапазоні просторового масштабу: від одиничної клітини до цілого серця». (Єфімов І.Р., Самбелашвили О. Т., Микільський В.М. // Вісник аритмії. 2002. № 26. С.91−96.) — Примеч.ред.

Гистологические дослідження показали, що пересаджені в міокард собаки мезенхимальные власні стовбурні клітини людини сформували між собою й желудочковыми миоцитами звані щелевые контакти — канальні білки, які переносять електричний струм між сполученими клітинами (рис.4) [26]. Отриманий пейсмекерный струм виявляв типові йому властивості: активізувався при гіперполяризації клітини, відповідав на катехоламіни і ацетилхолин і блокувався цезієм [25].

.

Рис. 4. Мікрофотографія гістологічного зрізу міокарда собаки, якої імплантували людські стовбурових ембріональних клітин з экспрессированным геном HCN2 [26]. Білими стрілками показані щелевые контакти, які утворилися між стовбуровими клітинами, червоними — між стовбуровими клітинами і кардиомиоцитами, фіолетовою стрілкою зазначено місце проліферації стовбурових ембріональних клітин (интеркалярный, чи вставочный диск).

Итак, мезенхимальные стовбурні клітини дорослої людини, судячи з усього, можна використовувати як субстрату на формування сино-атриального вузла, було підтверджено в експериментах на собак. Але спочатку, ніж дійде чергу до людини, доведеться зробити ще дуже багато. Наприклад, перевірити in situ чутливість біологічного водія ритму до автономним нервовим впливам, порівняти тривалість функції створеного біологічного пейсмекера та її роботи з відповідними параметрами электрокардиостимулятора, перевірити на токсичність і тератогенность. З іншого боку, з’ясувати, затримаються чи використовувані генні конструкції і клітини саме там, куди їх запровадили, чи мігрують. Невідомо також, чи залишатимуться власні стовбурні клітини після трансплантації дискретними і/або диференціюються до інших клітинні типи, і вони відторгатися. І нарешті, слід усунути недолік біологічних пейсмекеров, що проявився як і експериментах з допомогою аденовирусных конструкцій, і стовбурових ембріональних клітин, несучих ген HCN2, — скоротити інтервал між зупинкою синусового ритму і по виникнення идиовентрикулярного (в ідеалі він має тривати одну-дві секунди).

До того часу, доки вдасться відповісти на опікується цими питаннями, рано казати про практичне застосування біологічних водіїв ритму і від електронних пейсмекеров — головного досягнення 20-го століття, у лікування захворювань проводить системи серця. Проте є підстави сподіватися, що ні забариться той час, коли з допомогою генної і серпоподібною клітинною терапії вирішуватимуться багато проблем в різних галузях медицини, і тільки наш уява може працювати обмежити застосування цих методик.

Работа виконано з допомогою USPHS-NHLBI (проекти № HL-28 958, HL-67 101, HL-20 559, GM-55 263) й обрамлена премією «Heritage», заснованої Американської асоціацією серця (American Heart Association).

1. Zivin A., Bardy G.H. Cardiac pacemakers // Foundations of Cardiac Arrhythmias / Eds. P.M.Spooner, M.R.Rosen. N.Y., 2001. P.571−598.

2. Hoffman B.F., Cranefield P.F. Electrophysiology of the Heart. N.Y., 1960.

3. DiFrancesco D. // J. Physiol. 1981. № 314. P.377−393.

4. DiFrancesco D. // J. Physiol. 1982. № 329. P.485−507.

5. Brown H.F., Kimura J., Noble D. // Proc. R. Soc. Lond. B. 1984. № 222. P.329−347.

6. Hagiwara N., Irisawa H., Kameyama M. // J. Physiol (Lond). 1988. № 395. P.233−253.

7. Hagiwara N., Irisawa H., Kasanuki H. // J. Physiol (Lond). 1992. № 448. P.53−72.

8. Noma A., Irisawa H. // Jpn J. Physiol. 1975. № 25. P.287−302.

9. Ono K., Ito H. // Am. J. Physiol. 1995. № 269. P. H453-H462.

10. Li J., Qu J., Nathan R.D. // Am. J. Physiol. 1997. № 273. P. H2481-H2489.

11. Edelberg J.M., Aird W.C., Rosenberg R.D. // J. Clin. Invest. 1998. № 101. P.337−343.

12. Edelberg J.M., Huang D.T., Josephson M.E., Rosenberg R.D. // Heart. 2001. № 86. P.559−562.

13. Miake J., Marbбn E., Nuss H.B. // Nature. 2002. № 419. P.132−133.

14. Miake J., Marbбn E., Nuss H.B. // J. Clin. Invest. 2003. V.111. № 10. P.1529−1536.

15. Silva J., Rudy Y. // Circ. Res. 2003. № 92. P.261−263.

16. Santoro B., Liu D.T., Yao H. et al. // Cell. 1998. № 93. P.1−20.

17. Ludwig A., Zong X., Jeglitsch M. et al. // Nature. 1998. № 393. P.587−591.

18. Qu J., Barbuti A., Protas L. et al. // Circ. Res. 2001. № 89. P. E8-E14.

19. Rosen M.R., Brink P.R., Cohen I.S. et al. // Cardiovasc. Res. 2004. V.64. № 1. P.12−23.

20. Qu J., Plotnikov A.N., Danilo P.Jr. et al. // Circulation. 2003. № 107. P.1106−1109.

21. Plotnikov A.N., Sosunov E.A., Qu J. et al. // Circulation. 2004. № 109. P.506−512.

22. Gepstein L. // Circ. Res. 2002. № 91. P.866−876.

23. Zhang Y.M., Hartzell З., Narlow M. et al. // Circulation. 2002. V.106. № 10. P.1294−1299.

24. Liechty K.W., MacKenzie T.C., Shaaban A.F. et al. // Nat. Med. 2000. V.6. № 11. P.1282−1286.

25. Potapova I., Plotnikov A., Lu Z. et al. // Circ. Res. 2004. V.94. № 7. P.952−959.

26. Valiunas V., Doronin P. S., Valiuniene L. et al. // J. Physiol. 2004. V.555. № 3. P.617−626.