Методы поділу иммуноглобулинов

КАЗАХСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНИВЕРСИТЕТ.

Кафедра биохимии.

РЕФЕРАТ.

«Методи виділення иммуноглобулинов».

Виконала Сулемейнова Г.

Керівник: доктор біології, професор Жумашев Ж.Ж.

Алмати, 1999 год.

Імуноглобуліни — основні захисні білки організму, оскільки вони мають властивостями різних антитіл. Вони зберігають у крові, молозиві і молоці, слині та інших рідинах. З їхніми кількістю і активністю пов’язані життєстійкість, фізіологічне стан і продуктивність животных.

Діяльність описані властивості імуноглобулінів, як білків, і навіть способи поділу імуноглобулінів сільськогосподарських животных.

Подані дані про характеристиці, виділенню імуноглобулінів, можуть дати сучасні ставлення до захисних білках животных.

ІМУНОГЛОБУЛІНИ — СПЕЦИФІЧНІ ЧИННИКИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА.

Найважливіші чинники специфічного імунітету — імуноглобуліни, здійснюють гуморальную захист организма.

Дж.Хереманс (1959), вивчаючи активність імунної сироватки людини, виявив, що антитіла містяться, по меншою мірою, у трьох фракціях сироватки: в (- й у двох фракціях (- глобулінів, званих (2А і (2М — глобулинами. Ці фракції, активні в иммунологическом відношенні, Хереманс запропонував назвати иммуноглобулинами (Ig). Пропозиція Дж. Хереманса лягло основою міжнародної номенклатури, ухваленій у 1664 р. спеціальної комісією ВООЗ. З цієї номенклатурі (-глобулін називається IgG, B2Aглобулін — IgA і В2М — IgM. Імуноглобулін і двох легких (L) і двох важких (М) полипептидных цілей. І кожен клас імуноглобулінів характеризується особливим типом важких ланцюгів (, (, (, d, (.

Легкі ланцюга бувають двох типів — (чи (, каждвй у тому числі відрізняється Зкінцевий послідовністю амінокислот. Як важкі, і легкі ланцюга складаються верб двох різних ділянок (областей) — вариабельной (V) і постійної (З). С-концевая половина полипептидной ланцюга має постійну аминокислотную послідовність, та її N — кінцева частина — вариабельную. Кожен постійний (Сl) і вариабельный (Vl) ділянку легкої ланцюга включає 107−110 амінокислотних остатков.

Важкі ланцюга побудовано з чотирьох ділянок — VH, C1H, C2H, C3H. Вариабельные ділянки їх складаються приблизно з 110−114 амінокислотних залишків, постійні - 330.

У вариабельной частини полипептидных ланцюгів перебувають певні, так звані «гипервариабельные ділянки », з найбільшим числом амінокислотних замін. У легких ланцюгах їх розташовано між 24−34; 52−55; 89−97 аминокислотными залишками. Гипервариабельные ділянки важких ланцюгів займають аналогічні становища, але точна локалізація їх поки що не встановлено (Кульберг, 1975; Поляк 1981).

Наявність вариабельных ділянок дає молекулам антитіл можливість пристосовуватися до різноманітних антигенным детерминантам. Будова постійних областей важких ланцюгів визначає ефекторні функції молекул до поверхням макрофагів. В-лимфоцитов, опасистих клітин, і навіть проникнення через плацентарну мембрану (Єгоров, 1972; Leslie, Cohen, 1973).

Гнучкість молекул імуноглобулінів, забезпечує пристосовуваність до різним конфігураціям молекул антигену, обумовлюється також наявністю особливого «шарнирного ділянки «у середині важких ланцюгів, що містить багато залишків амінокислоти пролина і який перешкоджає освіті вторинної структуры.

Нині виходячи з вивчення первинної структури полипептидных ланцюгів висунуто так звана «доменна «гіпотеза будівлі імуноглобулінів, за якою молекулу імуноглобулінів може бути розбитий до дільниць з відносно незалежними конфігураціями як глобул. Кожен домен полягає приблизно з 100−110 амінокислотних залишків і має одну дксудьфидную зв’язок, яка пов’язує ділянки ланцюгів, створюючи петлю з 60 амінокислотних залишків (Еdelman, 1970; Незлин, Рохлін, 1970; Роljak, 1972).

Молекула імуноглобуліну G складається з 12 доменів: по 4 у важких і з 2 у легенях полипептидных ланцюгах (мал.1). Використовуючи молекулярні моделі і ряд загальних термодинамічних принципів укладання третинної структури білків, встановлено, що конформації всіх 12 доменів імуноглобуліну G характеризуються велику кількість (- складок і наявністю одне-двох витків (- спіральної структури (Зав'ялов, Троїцький, 1973).

З вивчення впливу протеолітичних ферментів зроблено висновок, що молекули імуноглобулінів складаються з у трьох фрагментів двох типів, пов’язаних гнучкими ділянками полипептидных ланцюгів: дві з них названі Fabі тільки Fcфрагментами (Рогtег, 1959, 1960; Utsumi Karush, 1955, 1967).

До складу FABфрагментів входять ціла легка ланцюг і N — кінцева половина важкої ланцюга. Структурна особливість FABфрагмента наявність двох глобулярных субодиниць — V і З. V побудована з цих двох доменів VH і V1L, а Зз CL і C1H. Fc-фрагмент містить дві домену — C2H і Сн3 (Роljak, 1972).

Рис. 1. Схема будівлі молекули IgG1 людини (з книги.

Імуноглобуліни " .- М.: Світ., 1981).

Lланцюга розділені на дві гомологичные області VI. (вариабельная) і СL (константная). Стовщені лінії Н-цепей відповідають шарнирному ділянці. Показано 4 гомологичные області Н-цепей (VF, С1Н, С2Н, С3Н), всередині - і межцепочные дисульфидные зв’язку, Nкінцеві ділянки обох ланцюгів і основні фрагменти (FAB, FAB «і Fc).

До складу молекул деяких класів імуноглобулінів входять додатково полипептидные ланцюга. У молекулі сироваткового і секреторного імуноглобуліну, А вона названа Jланцюжком. (НАLPERN, KOSHLAND, 1970). З’ясовано, що аналогічні поліпептиди містяться й у молекулах імуноглобуліну М (Меstresky et al., 1971). J-цепочки імуноглобулінів М й О мають однакові молекулярну масу, электрофоретическую рухливість, антигенну специфічність і амінокислотний склад (Меtresky et al, 1971; Моrrison, Коshland, 1972). У полімерних молекулах імуноглобулінів різних видів тварин також полипептид, аналогічний полипептиду Jланцюжка імуноглобулінів людини (Kobajashi et al, 1973).

Молекулярна маса Jланцюга коштує від 14 000- 27 000. Таке розбіжність пояснюється, очевидно, схильністю J ланцюгів утворити димеры (Коshland, 1975). Зміст вуглеводів у яких близько 7,5 міль %. Визначено амінокислотний склад Jланцюгів виділених з IgA і IgМ людини, і навіть тварин. Ізольовані ланцюга вирізняються високою змістом аспарагінової, глутаминовой кислот і цистеина і майже в повній відсутності трипто-фана (Morrison, Коshland, 1972; Zikand 1972; Kehoe et al, 1972; Mestesky et al 1975).

Передбачається, що J ланцюга необхідні приєднання секреторного компонента до IgA і полегшують димеризацию IgA b і полімеризацію IgМ. По думці Л. В. Часовниковой та інших. (1983), велика інформаційна стабільність молекул IgA, проти IgM обумовлена наявністю Jланцюга, об'єднуючою молекулу IgA в димерную форму.

До складу секреторного IgА входить іще одна полипептид, під назвою секреторне компонентом (Brandtzaeg, 1968, 1974; Fomasi et al, 1968). Секреторный компонент виявлено в усіх видів сільськогосподарських тварин, корів (Mashetal, 19б9; Butler et al, 1972); свиней (Bourle, 1969); кроликів (Halperl, Koshland, 1970); овець та кіз (Pahud Mach, 1970); коней (Pahud Mach, 1972). Він існує як і що з секреторне IgA — (сСК), і у вільному вигляді - (нСК). Молекулярна маса пов’язаного і вільного секторного компонентів в людини коштує від 50 000 до 90 000, у овець, кіз та коней молекулярна маса нСК 80 000- 85 000 (Pahud Mach, 1970, 1972). Зміст вуглеводів — 15,9 — 22,8%. Визначено також амінокислотний склад вільного секреторного компонента в людини, великої рогатої худоби і собаки (O'Daily, Cerba, 1971; Fomasi, Jrey, 1972; Mestesky, 1972; Fhopson et al, 1975).

Секреторный компонент пов’язаний про шарнірної областю молекули IgА у зоні розташування вуглеводів (Winkelhanke, 1979). Вважають, що його функція залежить від захисту секреторного IgА від впливу протеолітичних ферментів, що дуже важливо (Стефані, 1973; Чернохвостова, 1974).

Активні центри — ділянки молекул, від яких здатність антитіл специфічно зв’язуватися з антигеном. Зазвичай вони займають невелику ділянку (приблизно 2% від усієї поверхні цілої молекули антитіла), який, перебувають у Fabфрагментах, надає молекулі імуноглобуліну унікальні мінливість і специфічність (Носсел, 1973).

Відомо, що у побудові активного центру беруть участь тільки гипервариабельные ділянки як важких, і легких ланцюгів Fab-фрагмента (Poljak et al, 1973, Padlan et al, 1973; Leslie et al, 1973). У цьому основна роль належить важким ланцюгах, а легкі беруть участь у просторової організацій важких, перешкоджаючи їх агрегации.

Вуглеводні компоненти. Усі класи імуноглобулінів відрізняються одна від друга кількісним змістом вуглеводного компонента. Найбільш багаті вуглеводами імуноглобуліни М, А, Є. і Д (7,5 — 12,0%). У молекулах IgG міститься близько 2,9% вуглеводів. У складі імуноглобулінів виявлено манноза, галактоза, галактозамин, глюкозамін, фукоза і сиаловая кислота.

Вивчення вуглеводневих груп представляє великий інтерес, обумовлений їх через участь у самосборке молекули імуноглобуліну М з полимеризующихся субодиниць (Каверзнева та інших., 1975; Лапук та інших., 1975; Хургин та інших., 1975; Каверзнева, 1981; Каверзнева, Чухрова, 1984; Каверзнева, 1984).

Передбачається, що вмикання глюкозомина і маннозы на етапі складання у важку ланцюг молекул імуноглобулінів сприяє конформационным змін, полегшуючим замикання S-Sзв'язків. Ці вуглеводи грають певну роль при секреції імуноглобулінів з продукованих клітин (Сидорова, 1971).

Электрофоретические властивості. Імуноглобуліни — найменш заряджені білки сироватки крові й мають малої электрофоретической рухливістю. У електричному полі при лужних значеннях середовища імуноглобуліни G та її підкласи займають область (- гдобулинов, М й О зону (- глобулинов.

Антигенні властивості. 1. Молекули імуноглобулінів мають різні антигенні структури. Усі їхні антигенні детермінанти кодуються трьома несцепленными групами аутосомных генів. Одна група кодує важку ланцюг тієї чи іншої класу, інша — легку kтипу, третя — легку (-типа.

2. Оскільки полипептидные ланцюга складаються з цих двох різних діляноквариабельного (V) та сталого (З), кожна гілка трьох груп генів включає набір генів вариабельной — V і голову постійної областейС-гены. Отже, синтез кожної полипептидной ланцюга молекули імуноглобуліну контролюється двома структурними генами, а чи не одним, як із синтезі інших білків. Один ген кодує вариабельную область ланцюга, іншийпостійну. Це доповнює існуюче правило «один ген — одна полипептидная ланцюг «(Фуденберг та інших., 1975). Причому існують багато гени для вариабельных областей полипептидной ланцюга, що пов’язані з різноманіттям специфічних активних центров.

3. З’ясувалося, що V-гены тісно зчеплені з С-генами і розташовуються як в одній хромосомі", а й у безпосередній наближеності. Складання цілої молекули імуноглобуліну відбувається з цих двох важкі крейсери та двох легких ланцюгів (2Н2Lк чи 2Н2L (), синтезованих по генетичним матрицями, розміщеним у різних хромосомах. За деякими уявленням (Кульберг, 1985; Петров, 1987), спочатку з'єднується одне з легкої і важкої ланцюгів, та був обидві частини збираються на всю молекулу.

4. Показано, що у однієї хромосомі розташовані гени, детерминирующие синтез Vділянки важкої ланцюга, і навіть гени С-участка імуноглобулінів G, М, А, тобто. лише у ланцюжку перебувають гени V, З (, З (, З (. Встановлено, чтоVH ділянку ланцюга, кодируемый одним геном, то, можливо виявлено у складі IgМ, IgG і IgA, тобто. то, можливо з'єднаний із постійними ділянками важких ланцюгів різних класів — З (, З (, З (. Питання про вибір клітиною Vабо згена при синтезі імуноглобуліну вивчався багатьма авторами.(Незлин, 1972, Рохлін, 1976, Петров, 1982, 1987).

Кожна індивідуальна клітина виробляє антитіла лише однієї специфічності за правилом «одна клітина «одне антитіло «(Петров, 1987). Це означає, що у клітині активно функціонують лише одне варіант гена VH, один — гена СH й поодинці відповідному гену одній з легких ланцюгів. Усі інші структурні гени відімкнено. У кожній окремо взятому антитілокотра утворює клітині з усього безлічі структурних генів імуноглобулінів функціонує їх мінімум, необхідне синтезу антитіл однієї специфічності і самого типу. Отже, основу різноманіття специфічності антитіл лежить функціонування лімфоїдної системі великого кількості клітин та їх нащадківклонів клітинпродуцентів жодного виду антитіл. Отже, кількість специфичностей антитіл відповідає кількості клонів клітинантителопродуцентов, різняться генами, функціонуючими в них.

Встановлено, що V-ген даної специфічності здатний поо^ чередно асоціювати з генами, кодирующими З (, З (, З (, т. е.антителообразующие клітини здатні переключати синтез імуноглобуліну М на IgG і IgA, не змінюючи антитільної специфічності. Отже, антитіла проти альбуміну бика можуть бути як у фракції IgG, і у фракціях: імуноглобулінів М і А.

КЛАСИ І ПІДКЛАСИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ.

Як вказувалося, імуноглобуліни мають загальні характерні властивості. Проте їх окремі класи і підкласи відрізняються первинної структурою, антигенними і фізико-хімічними властивостями і біологічну активність. а) Імуноглобуліни класу G. IgG є найбільш вивчене антитіло, було багато яке у сыворотках крові всіх ссавців і птахів. IgG становить близько 70−80% від загального змісту імуноглобулінів. Молекулярна маса — 150 000 — 160 000 (Незлин, 1972).

Молекула імуноглобуліну Gпобудована з цих двох важкі крейсери та двох легких полипептидных ланцюгів, з'єднаних дисульфидными зв’язками. Характерні важкі полипептидные ланцюга. IgG людини існує у вигляді 4 підкласів (G1, G2, G3, G4, відмінних будовою постійних ділянок важких ланцюгів, отже, і антигенними і біологічними властивостями (Незлин, 1972, Герман та інших., 1977, Басова, Стефані, 1977). Підкласи різняться 2 кількістю дисульфидных зв’язків, що з'єднують важкі ланцюга: в молекулах G1 і G4 їх за 2, в G2, — 4, а G3, -5. IgG1 становить 70% від загального змісту IgG, а IgG2, IgG3, IgG1 18, 8 і трьох%, соответственно.

В усіх вивчених видів звірів знайдено два підкласу IgG: щодо повільно пересуваються в електричному полі G2 і більше рухливі G1. Їх молекули мають різні антигенні й біологічні властивості, і навіть спроможність до перетравлювання протеолитическими ферментами (Незлин, 1972).

Розшифровано первинна структура обох ланцюгів імуноглобуліну G1 (Edelman, 1973). Важкі ланцюга його складаються з однієї вариабельной області - VH і трьох постійних ділянок — Сн1, Сн2 і Сн3. Довжину вариабельных областей становлять 114, а постійних — 330 амінокислотних залишків, легкі з областей V1, СL.

З допомогою електронної мікроскопії (Valentine, Jreen, 1967), з’ясовано, що молекула імуноглобуліну G має V-образную форму, у своїй Fab фрагменти утворюють «лапки «молекули, а Fcфрагмент — її «хвіст ». Вона має дві активних центру, що у вариабельной частини молекули, а саме у кінчиках Fab фрагментов.

При электрофорезе в лужних значеннях рН IgG пересувається повільніше всіх сироваткових білків. При иммуноэлектрофорезе він утворює витягнуту в дугу лінію преципитации, прокрывающую зону розташування (- глобулінів (Незлин, 1972). Нативная молекула IgG1 звичайно містить вільних сульфгидрильных груп (Троїцький та інших., 1965, Cristian, 1965). IgG містить близько 2,9% вуглеводів, що у важких ланцюгах (Незлин, 1968).

Людина лише IgG здатний проникати через плаценту і потраплятимуть у кровоносну систему плоду, забезпечуючи цим пасивний імунітет новонароджених у ранній постнатальний період (Брондэ, Рохлін, 1978). б) Імуноглобуліни класу М. IgМ — одне із високомолекулярних білків сироватки крові й має молекулярну масу близько 1 млн, константу седиментации 19 Se. Молекула IgМ складається з 5 субодиниць, кожна з яких нагадує молекулу IgG (рис. 2). Субъединица і двох важкі крейсери та двох легких ланцюгів з молекулярними масами 23 000 і 60 000 відповідно, (- ланцюг складається з 5 доменів VH, С1(- С4(, легка — изVL, і СL. Молекула 1IgM має 10 активних центрів, розміщених у Fab областях (Прокопенко, РавичЩербо, 1974, Литмен, Гуд, 1981).

IgМ містить близько 20% вуглеводів., функція яких обумовлена з освітою макромолекули IgM з 7 P. S субодиниць до формуванням просторової структури молекули (Каверзнева, 1984). IgМ по рваному реагує На оновлення 2- меркаптоэтанолом: при м’якому він розпадається на 5−7 P. S субодиниць, а за більш глибокому на лихоліття і легкі полипептидные цепи.

Рис. 2. Схема будівлі молекули IgМ.

(з оповідання «Імуноглобуліни ». -М.: Світ, 1981).

Радіальна упаковка субъедикиц IgМ, одній із яких розташування гомологичных областей (доменів) L- (VL .і СL) і H—цепей (VH, С1(, С4(). Показано найважливіші продукти ферментативної фрагментації IgМ і передбачене становище Jцепи.

Найважливіша властивість молекули IgМ, необхідне її функціонування — конформационная рухливість за зміни умов довкілля (Каюшина і ін., 1985, Свергун та інших., 1585). При электрофорезе IgМ пересувається швидше імуноглобулінів класу G у фракції (2- глобулінів. Знайдено 2 підкласу IgМ, з різними антигенними властивостями (Гауровец, 1969, Бернет, 1971, Незлин, 1972, Кульберг, 1975).

Так само значно перебування його за поверхні (-лімфоцитів в якості їхніх основних рецепторів (Петров, 1987). IgM виявлено в усіх досліджених хребетних (Koshland, 1975). Людина після 45 років міститься 1,71 мг/мл IgМ або близько 10% від загальної кількості імуноглобулінів (Стефані, Вальтищев, 1977). IgMантитіло первинного імунної системи, оскільки синтезується першим після антигенної стимуляції. За кілька днів синтез IgМ переключається на IgG, тана IgА (Петров, 1987).

IgM переважно має внутрисосудистую локалізацію, невеличке ньому виявлено в тканинних рідинах, але у слизових виділеннях він відсутня (Jonas, 1972). Більшість тварин (крім кроликів) IgM через плаценту проходити неспроможна (Маслянко, 1973). в) Імуноглобуліни класу А. IgA вперше ідентифікований в сироватці крові людини иммуноэлектрофорезом як (2А-глобулин (Burtin et al, 1957, Грабар, Буртэн, 1963).

Імуноглобулін Аодне із найменш вивчених захисних білків людини і тварин. Це виключно низьким змістом в нормальної сироватці крові, труднощами виділення, і навіть деяким подібністю з иммуноглобулинами класу 6 та інші білками неиммуноглобулиновой природы.

Існують компоненти IgА з константами седиментации 7S, 11S, 13S, 15S5, 17S. У полімерних формах імуноглобуліну, А (рис. 3) виявлено додатковий полипептид J ланцюг (Halpern, Koshland, 1970).

Рис. 3 Будова молекули IgA.

(з оповідання Р. У. Петрова «Імунологія ». -М.: Медицина, 1987). SСсекреторный компонент; jз'єднує; H-тяжелые; L-легкие цепи.

У нормальної людської сироватці знайдено два антигенно різняться підкласу IgA — А1 і А2 (Vaerman, Hereman, 1966, Kunkel, Prentergast, 1966, Feinstein, Franklin, 1966, Fomasi, Yrey, 1972). IgA2 існує у вигляді димеров, з'єднаних дисульфидной зв’язком, а лихоліття і легкі ланцюга пов’язані нековалентными зв’язками (Yrey et al, 1968, Незлин, 1982). Обидва підкласу IgA мають активністю антитіл (Dorrington, Fanford, 1970, Бернет, 1971). Молекули IgА, які у різних секрети — молоці, молозиві, травних соках, слині, сечі тощо., мають константу седиментации 11S мають додаткову полипептидную ланцюжоксекреторный компонент з молекулярної масою 50 000 — 60 000 (Brandt et al, 1968, 1975, Fomasi et al, 1965, 1968).

Імуноглобуліни, А слини і травлення стійкі до дії протеолітичних ферментів — пепсину і трипсина (Ballierex et al, 1969, Porter, Noakes, 1970). Ця резистентність пов’язані з присутністю секреторного компонента синтезованого в выделяющей секрет залозі і далі приєднаного до молекули IgA із заснуванням димеров з цих двох його молекул (Стефані, 1973, Чернохвостова, 1974, Першин, 1980).

Тож у секрети IgA звичайно знаходиться як димеров чи тримеров Гаврилова, 1976). Мономери IgА мають молекулярну масу 160 000. IgА у деяких видів звірів має як високу электрофоретическую рухливість, ніж IgМ. Зміст вуглеводів високе -10%. Молекулярна маса переважно, однакова з IgG1, а й у певної частини популяції молекул IgA вона проміжна між IgA і IgM. Як і в інших імуноглобулінів, відновлення призводить до розпаду молекули на лихоліття і легкі ланцюга. Характерні важкі цепи.

IgA в сироватці крові людини міститься у щодо більшому кількості, ніж IgМ і як близько 19% від загальної кількості імуноглобулінів (Hobby, 1971). У сироватці крові багатьох видів тварин, зокрема овець і великої рогатої худоби, IgM переважає над IgA. Багато цього білка виявлено в лимфе, де концентрація їх у 2−18 разів більше, ніж у крові (Стефані, 1971). Антитіла знайшли й у вмісті кишечника і фекаліях, 80% якої припадає на частку IgА. Антитіла, котрі виділяються в кишечник в стійкою до гидролизу формі, відіграють істотне значення у позиційному захисті організму кишкових інфекцій (Fomsi, Yrey, 1972). IgА перебуває в поверхні слизових оболонок і активна бере участь у місцевій імунологічної захисту (Герберт, 1974). р) Імуноглобуліни класу D. IgD також вивчений недостатньо. Вперше він охарактеризований як четвертий клас імуноглобулінів D. Rowe, G. Fahey (1965). Його молекулярна маса близько 180 000. Молекула IgD і двох легень і двох важких полипептидных ланцюгів, пов’язаних дисульфидными містками (Vunnar, Fohansson, 1969, Spiegelberg, 1977, Ruddick, Leslie, 1977). Роль в людини майже вивчена. Вважають, що він — секреторный імуноглобулін. Сироватковий IgD виявлено тільки в чоловіки й приматів. При электрофорезе в агаровом гелі рухливість IgD відповідає подвижностям (і (глобулінів. Точних експериментальних даних про присутності IgD у тварин наразі немає. буд) Імуноглобуліни класу Є. IgE вперше ідентифікований K. Ishisaka, F. Fshisaka (1966). Молекулярна маса IgЕ 190 000, константи седиментации 8 P. S. Молекула IgE також і двох легень і двох важких полипептидных ланцюгів, молекулярна маса яких 22 600 і 72 500 відповідно. Зміст вуглеводів понад 12% (Шаханина, Стоев, 1981). IgE відіграють істотне значення в патогенезі алергії (Isgizaka, Ishizaka, 1976, Dorrington, Bennich, 1978). К. Г. Стоев (1979) розробив методи виділення, тож кількісного визначення D та О імуноглобулінів в сироватці крові здорових і хворих людей.

ПРЕПАРАТИВНОЕ ВИДІЛЕННЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ.

Для виділення імуноглобулінів з сироватки крові тварин, особливо G1, М й О, використовують різноманітні методи отримання попередньо очищених білків, збагачених відповідними иммуноглобулинами. Подальшу очищення проводять ионообменной хроматографією на ДЭАЭсефадексе А-50, ДЭАЭцелюлозі ДЕ-52, гель-фильтрацией на сефедексе G-200 чи препаратным электрофорезом.

ПРИГОТУВАННЯ ПОПЕРЕДНЬО ОЧИЩЕННЫХ.

ПРЕПАРАТІВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ.

Для цього він зазвичай застосовують методи попереднього виділення иммуноглобулинов.

ОСАДЖЕННЯ 4 М РОЗЧИНОМ СУЛЬФАТУ АММОНИЯ.

4 М розчином сульфату амонію глушаться всі білки сироватки, включаючи альбумин.

У цьому фракції, міститься переважна більшість імуноглобулінів G1 і G2 і значну кількість IgМ і IgА, хоча вони зазвичай виявляються й у в надсадочной рідини. Тому осад, отриманий 4 М розчином сульфату амонію, може бути джерелом приготування всіх класів імуноглобулінів, що є велике значення, особливо виділення з однієї проби сыворотки.

ОСАДЖЕННЯ 2,78 М РОЗЧИНОМ АММОНИЯ.

До холодної сироватці крові додають рівний обсяг холодного 2,78 М розчину сульфату амонію, перемішують при 40С 2 год. Солодкий розчиняють в изотоническом розчині хлориду натрію і в облогу ще 2 разу. У цьому 2,78 М розчином сульфату амонію переважно глушаться імуноглобуліни класу G. Причому, така концентрація солі бере в облогу IgG2 і, що дуже важливо, найповніше IgG1 за мінімальної осадженні фракцій (- і (- глобулінів. Тому цей метод найзручніша виділення імуноглобулінів G1 і G2 що з сироватки крові коней, і овець і великої рогатої скота.

ОСАДЖЕННЯ 1,39 М РОЗЧИНОМ СУЛЬФАТА.

АМОНІЮ ШЛЯХОМ ДИАЛИЗА.

Охолоджену сироватку крові тварин за целофановому мішечку вміщують у 1,39 М розчин сульфату амонію, перемішують не в холодильнику магнітної мешалкой 2 діб при триразовій зміні розчину солі. Осад двічі промивають 1,39 М розчином аммония.

У цьому з сироватки крові вівці і великої рогатої худоби глушаться імуноглобуліни G1 і G2, проте імуноглобулін G1, (- і (- глобулины присутні лише слідових кількостях. З сироватки крові коней, переважно виділяється імуноглобулін G2, IgG (Т) є лише в невеличкому количестве.

Отже, препарат отримуваний 1,39 М розчином сульфату амонію шляхом діалізу зручний виділення IgG2 з сироватки крові овець і великого рогатого худоби, проте найбільш чистий IgG2 виходить з сироватки крові лошадей.

ОСАДЖЕННЯ СУЛЬФАТОМ НАТРИЯ.

До охолодженою сироватці крові по краплях додають холодний 2,53 М розчин сульфату натрію до кінцевої концентрації, рівної 1 М. Перемішують 2 година за холодильнику, осад розчиняють і диализируют. 1 М розчином сульфату натрію глушаться імуноглобуліни G1 і G2, практично вільні від фракції (-глобулінів. За даними, його досить простий і вигідний виділення імуноглобулінів G1 і G2 з сироватки крові овець і великої рогатої худоби. Недолік методу у цьому, що ця концентрація солі не забезпечує повного осадження імуноглобуліну G1. По складу, препарат, що виділяється сульфатом натрію, ідентичний препарату, получаемому 1,39 М розчином сульфатом амонію, й тому він найкращий для виконання імуноглобуліну G2.

ВИДІЛЕННЯ БІЛКІВ НА ДЭАЭ — СЕФАДЕКСЕ А-50.

Попередньо очищені білки сироватки виділяли на ДЭАЭ-сефадексе А-50 типу середній (100−200 меш). Попередню обробку та регенерацію ДЭАЭсефадекса А-50, і навіть виділення білків, 0,01 М калійфосфатным буфером, рН 6,5 проводили по J. Baumstark et al (1964) із змінами (Сеитов З.С., Жумашев Ж. Ж., 1966).

Виділений білок вивчали электрофорезом в агаровом гелі, де у зоні (-глобулінів виявляли дві нечітко розділені (-глобулиновые фракції - IgG1 і IgG2, а иммуноэлектрофорезом, — три лінії преципитации — IgG1, IgG2 і IgM. Отже, застосувавши метод J. Baumstark et al (1964) не отримали чисті фракції IgG1 і IgG2 з сироватки крові овець і великого рогатого худоби, лише їх смесь.

Слід сказати, що ці автори розробили спосіб виділення чистого IgG з нормальної сироватки крові людини, испольэуя ДЭАЭсефадекс А-50 типу грубий і 0,01 М калійфосфатне буфер рН, 6,5. Проте З. С. Сеитов і Ж. Ж. Жумашев (1966) цим методом ми змогли виділити иммунохимически чистий імуноглобулін G2 з сироватки крові коней. Їм вдалося виділити суміш білків що складається з IgG2 і IgМ і IgА. Аналогічні результати отримано при виділенні IgG2 з з нормальної сироватки овець (Ж.Ж.Жумашев, З. С. Сеитов, 1968 а, б).

Результати, які від результатів Baumstark et al (1964), очевидно, обумовлені особливостями білкового складу сироватки крові цих видів тварин. Отже, зазначений метод — також спосіб попереднього виділення IgG2 з нормальної сироватки крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

На закінчення слід зазначити, що американському біохіміку G. Edelman (1972) і англійської біохіміку К. РогIgг (1972), працюють у області вивчення людських імуноглобулінів присуджували Нобелівську премію 1972 року. Присудження Нобелівської премії свідчить про багато уваги світової громадськості до імуноглобулінам і досягнення певних успіхів із вивченні імуноглобулінів человека.

Що ж до імуноглобулінів сільськогосподарських тварин, чи до жалю, багато запитань виділення, ідентифікації і кількісного визначення цих захисних білків залишається слабко разработанными.

Головний захисний білок сільськогосподарських тварин IgG. Причому він залежить існує у вигляді двох підкласів: G1 і G2, які різняться аминокислотным складом, электрофоретической рухливістю, антигенным і біологічним властивостями. Проте виділення з сироватки крові чистих препаратів IgG1 — дуже непроста, і отже, не вирішена проблема.

Тому більшість літературних даних із цього питання стосується IgG і лише окремі IgG1 і IgG2.

IgM одне із високомолекулярних і сложноорганизованных білків сироватки крові, що з 5 субодиниць, з'єднаних лабильными дисульфиными зв’язками. Цим і пояснюється труднощі його виділення, тож вивчення. Хоча є кілька сучасних методичних прийомів, які допомагають його виділенню, жодного з них же в окремішності не забезпечує отримання чистого IgМ. Тому необхідно використовувати комбіновані методи, засновані на особливостях його фізико-хімічних свойств.

Так, досі залишається складним завданням приготування высокоочищенного IgМ, придатного вивчення його на структурні особливості і аминокислотного складу, антигенних властивостей, і навіть отримання щодо нього моноспецифических імунних сироваток. Очевидно, і пояснюється відсутність робіт з вивченню пептидной структури та аминокислотного складу IgМ в різних видів звірів. Щодо мало робіт, виконаних з допомогою моноспецифических імунних сироваток до IgM у тварин, особливо в коней і овец.

Однак, особливий інтерес, особливу складність виділення представляє IgА, зокрема і жуйних — великої рогатої худоби і овець. Це насамперед пов’язане його невеликим вмістом у нормальної сироватці крові. IgА щодо вивчений тільки в людини завдяки появі гібридом і моноклональних антител.

Вивчення IgА у сільськогосподарських тварин розпочато недавно. Так, не вивчені його структурні особливості і амінокислотний склад, слабко — электрофоретические, хроматографічні і гель-фильтрационные властивості і молекулярні размеры.

Вивчення імунологічного статусу тварин методом радіальної иммунодиффуэии з допомогою моноспецифических імунних сироваток має практичного значення. Однак на цей час майже відсутні дослідження з встановленню рівня імуноглобулінів вітчизняні порід великої рогатої худоби, овець, коней і інших тварин. Невідомо як і змінюється кількісне співвідношення імуноглобулінів залежно від породи, статі, віку, сезонів року й продуктивності тваринного. Поки мало досліджені иммуноглобулиновый спектр новонароджених і динаміка змісту імуноглобулінів в віковому аспекті, особливо в коней і овец.

Вивчення імуноглобулінів людини показало, що в багатьох випадках порушується біосинтез імуноглобулінів, що обумовлює зміни нормального співвідношення їхніх в сироватці. Такі дослідження проведено тільки в чоловіки й відсутня у сільськогосподарських тварин. Поки що вивчені і якісні ці зміни складу імуноглобулінів що за різних захворюваннях інфекційного і инвазионного характера.

Слабко вивчена природа імунної системи у вакцинованих тварин, особливо великої рогатої худоби і овець. Численні дослідження загального білка та її фракцій в різних тварин проведено переважно методом електрофорезу на папері, який має обмежену аналітичну можливість. Це справедливо щодо динаміки білкових фракцій сироватки крові у молодняку сільськогосподарських тварин за віковому аспекті, і навіть иммуноглобулинового, білкового і казеїнового складу молозива і молока овець і лошадей.

Отже, дослідження імунохімічних особливостей і кількісного змісту імуноглобулінів сільськогосподарських тварин має як теоретичне, і практичне значение.

1. Басова О. Н., Стефані Д.В. Деякі особливості виділення миеломных IgG людини різних субклассов та його розподіл по аллотипам, субклассам і типам легких ланцюгів// Журн. мікробіолог. — 1977. — № 5. — З. 77- 81.

2. Басова О. Н., Стефані Д.В., Казанцева Л. З. Иссчледования субклассов IgG людини. Сооб.II. Рівні окремих субклассов IgG в парних сыворотках крові жителів північного села — изолята// Журн. мікробіолог. — 1979. — № 7. — З. 35−39.

3. Бернет Ф. Клітинна Імунологія. — М.: Світ, 1971. — 549 с.

4. Edelman J.M. Antibody structure and molecular immunology//Nobel lecture. Dec. 12 1972; Stocholm, 1973. — p. 147−170.

5. Heimer R., Clark L.C., Mourer P.H. Immunoglobulins of sheep//Arch. Biochem. Biophys. — 1969 — v.131. — p. 9−17.

6. Kehoe J.M., Tomosi T.B., Ellous F., Capra J. Identification of Jchain in a homogeneous canine IgA immunoglobulin//J. Immunol — 1972 — v.109 — p.59−64.

7. Menta P.D., Reichin M. Comparative studies of vertebrate immunoglobulins//J. Immunol — 1972 — v.109 — p.1272−1277.

8. Ж. Ж. Жумашев, М. Б. Бабаев, Ш. С. Алимжанова, М. А. Туганбекова. Імуноглобуліни тварин. Алмати. 1994.