Атф індуковане зміна внутрішньоклітинної концентрації кальцію в нейронах неокортекса крыс

МІНІСТЕРСТВО ВИЩОЇ І СЕРЕДНЬОГО СПЕЦІАЛЬНОГО ОСВІТИ РОССИИ.

[pic] МОСКОВСЬКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО ЧЕРВОНОГО ПРАПОРА ФІЗИКО-ТЕХНІЧНИЙ ИНСТИТУТ.

ДИПЛОМНАџЯ РАБОТА.

АТФ індуковане зміна внутриклетоЧной концентрації кальцияЯ в нейронах неокортекса крыс.

НАУЧНЫЙ КЕРІВНИК академік Магура І.С. КОНСУЛЬТАНТ до. б. зв. Войтенко Н. В. рецензент к.б.н. Ісаєв Д ДИПЛОМНИК кругликов И.А.

Москва 1998.

1. ЗАПРОВАДЖЕННЯ 4.

2. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 5.

2.1 Гомеостаз кальциЯя в нервових клітинах 5.

2.1.1 Кальцієві канали плазматичної мембрани 5.

2.1.2 Кальцієві буферы 7.

2.1.3 Кальцієві канали эндоплазматического ретикулума 8.

2.1.4 Кальцієві насоси 11.

2.1.5 Кальцієві обмінники 13.

2.1.6 Са2±связывающие органели 13 2.2 ВлиЯяние АТФ на кальцієвий гомеостаз 14.

2.2.1 Будова й властивості АТФ 15.

2.2.2 Номенклатура і субклассификация пуринорецепторов. 16.

2.2.3 Р1 пуринорецепторы. 16.

2.2.4 Р2 пуринорецепторы 17.

2.2.5 Реклассификация пуринорецепторов. 20.

3. ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ 21.

3.1 Підготовка препарату 21 3.2 Характеристики кальцієвого зонда 22 3.3 Забарвлення зрізів флуоресцентним барвником 24 3.4 Структура експериментальної установки дляЯ двух-волнового виміру концентрації кальцияЯ 24 3.5 Розчини і зміна розчинів 27.

4. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ 28.

5. ОБГОВОРЕННЯ 39.

6. ВИСНОВКИ 41.

7. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 42.

Молекула АТФ давно відома як повсюдно поширений джерело енергії для внутрішньоклітинного метаболізму. Але її властивості як нейротрансмитера знайшли порівняно недавно. Сьогодні не залишилося жодних сумнівів, що АТФ є нейротрансмитером в автономних нейромышечных з'єднаннях, ганглиях і центральної нервової системі. До прикладу, засвідчили, що АТФ залучена до генерацію больових сигналів через Р2Х1 і Р2Х2 рецептори. Однак місія і розподіл пуринорецепторов в корі мозку і особливо у моторної корі досі залишається слабко вивченій. Тому вивчення механізмів дії АТФ в корі мозку представляє безсумнівний інтерес. Ми вивчали дію АТФ у вигляді виміру концентрації внутрішньоклітинного кальцію, — однієї з найболее важливих і універсальних регуляторів клітинних функций.

Мета роботи полягало у вивченні механізмів генерації АТФ — индуцированных внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів в нервових клітинах моторної коры.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Гомеостаз кальцію в нервових клетках.

Концентрація цитозольного кальцію в эукариотических клітинах регулюється трансмембранным транспортом і цитоплазматическим зв’язуванням кальцію. Рух іонів кальцію через мембрану контролюється: 1) двома сімействами Са2+ каналів, а саме: кальцієвими каналами плазмалеммы і кальцієвими каналами, розташованими в мембрані эндо (сарко)плазматического ретикулума (ЕР чи СВ), які формують шляху входу кальцію в цитоплазму; 2) висновком кальцію з цитоплазми завдяки активності кальцієвих насосів плазмалеммы і/або кальцієвих обмінників; і трьох) акумуляцією іонів кальцію внутриклеточными кальцієвими депо і митохондриями. Останні служать системами кальцієвого буфера, здатними акумулювати й накопичувати іони кальцію, підтримуючи в такий спосіб гомеостаз кальцію в цитоплазме.

1 Кальцієві канали плазматичної мембраны.

Нервові клітини экспрессируют різні типи кальцієвих каналів плазмалеммы, які можна активовані різними впливами. Базуючись на механізми активації, кальцієві канали можна розділити сталася на кілька типів потенціал — керованих і рецептор — керованих каналов.

Потенціал — керовані канали вносять значний внесок як і регуляцію входу кальцію в цитоплазму, і у нейрональный электрогенез. Бєлки, що утворюють кальцієві канали, складаються з 5 субъедениц (a1, a2, b, g, d). Головна субъеденица a1 формує власне канал і має місця зв’язування щодо різноманітних модуляторів кальцієвих каналів. Було виявлено кілька структурно різних a1 субъедениц кальцієвих каналів в нервових клітинах ссавців (позначених як A, B, З, D і E). Функціонально кальцієві канали різних типів відрізняються одна від друга активацією, кінетикою, провідністю одиночного каналу та фармакологією. У нервових клітинах описано до 6 типів потенціал — керованих кальцієвих каналів (T-, L-, N-, P-, Q-, Rканали). Активність потенціал — керованих каналів плазмалеммы регулюється різними внутриклеточными вторинними посередниками і мембраносвязанными G-белками (33,26).

Другий шлях потоку іонів кальцію через мембрану пов’язані з активацією агонист — керованих каналів. Багато агонист — керовані канали мають значної кальцієвої проницаемостью при фізіологічних умовах. Таку кальциевую проникність виявляють нейрональные ацетилхолин (Ach)-управляемые, глутаматкеровані (NMDA і AMPA/Каинат типи) і пуринорецепторы (10,18,49,34). Крім кальцієвих каналів плазмалеммы, керованих зовнішніми впливами, в эукариотических клітинах було відкрито також кілька типів кальцієвих каналів, контрольованих внутриклеточными вторинними посередниками. Зокрема, IP3-управляемые кальцієві канали виявили нейронах Пуркинье мозочка (34), а IP4- керовані кальцієві канали — у клітинах ендотелію (35).

Третій, недавно виявлений, особливий тип Са2+ каналів, який контролюється заполненностью внутрішньоклітинних кальцієвих депо, здійснюючи в такий спосіб пряме сполучення між визволенням Са2+ в цитоплазму з депо і вхід у ній Са2+ через плазмалемму.

2 Кальцієві буферы.

Більшість іонів Са2+, які входять у клітину, практично негайно пов’язується цитоплазматическими місцями зв’язування кальцію. Показано, що менше 1% іонів кальцію, які пробираються у цитозоль, залишається в незв’язаному стані (11). Цитозольные кальцієві буферы представлені переважно Са2±связывающими білками, такі як парвальбумин, кальмодулин, тропонин-С, кальретинин, кальциунеурин, білок S-100 (25). З іншого боку, цитозольная буферна ємність то, можливо опосередкована АТФ, що може пов’язувати значну кількість Са2+ (64). 20−50% цитозольных кальцієвих буферів може бути віддалені з цитоплазми при перфузировании клітини, що їх мобільність, тоді як решта Са2±связывающей ємності належить до фіксованим буферам. Мобільні кальцієві буферы можуть відіграти важливу функціональну роль, сприяючи дифузії іонів Са2+ в цитоплазмі та поширенню Са2+ сигналу клітиною. Внутрішньоклітинний запровадження ендогенних Са2+ буферів (кальбиндина D28k і парвальбумина) через микропипетку зумовлювало збільшення швидкості наростання [Ca2+]i кілька порядків й суттєво впливало на кінетику зміни [Ca2+]i, що підтверджує роль мобільних Са2+ буферів з низьким молекулярным вагою ефективному регулюванні внутрішньоклітинної концентрації кальция.

3 Кальцієві канали эндоплазматического ретикулума.

Са2+ канали ЕР є олигометрическими протеїнами, умонтованими в мембрану ЕР. Ці канали можна щодо легко виділення з клітини для подальшого структурного аналізу тому, що білки каналу зв’язуються специфічно і з великим спорідненістю з IP3 (для IP3-управляемых каналів) і з рианодином (для Са2±управляемых каналов).

Са2±управляемые Са2+ канали ЕР. Ці кальцієві канали були вперше виділено з кістякових і по-особливому сердечних м’язів. Виявилося, що Са2+ канали ЕР в цих м’язових тканинах мають молекулярні розбіжності й закодовані різними генами. Са2+ канали ЕР в серцевих м’язах безпосередньо пов’язані з высокопороговыми Са2+ каналами плазмалеммы (L-тип) через кальцийсвязывающие білки, створюючи, в такий спосіб, функціонально активну структуру — «тріаду». У кістякових м’язах деполяризация плазмалеммы прямо активує звільнення Са2+ з саркоплазматического ретикулума тому, що Са2+ канали плазмалеммы служать потенціал — чутливими передавачами активирующего сигналу безпосередньо Са2+ каналам ЕР через котрі пов’язують білки (44). Таким чином, Са2+ депо кістякових м’язів мають механізмом звільнення Са2+, викликуваним деполяризацией (RyR1-тип). На відміну від кістякових м’язів, саркоплазматические Са2+ канали кардіоміоцитів пов’язані з плазмалеммой, і для стимуляції звільнення Са2+ з депо потрібно збільшення концентрації цитозольного кальцію (RyR2-тип). ДНК, кодирующая білки двох типів каналів Са2+ звільнення, була клонирована з тканин чоловіки й кролика, що було можливість экспрессировать Са2±управляемые Са2+ каналів навіть у модельні клітинні системи. Бєлки, вбудовані в ліпідний бислой, формують чутливі до рианодину канали, активируемые іонами Са2+ (50 нмоль/л) в присутності АТФ (29). Крім цих двох типів Са2±активируемых Са2+ каналів, нещодавно було ідентифікований третій тип Са2+ каналів ЕР (RyR3-тип), який є продуктом іншого гена. Цей третій тип Са2+ каналів ЕР, як було зазначено показано, не чутливий до кофеїну (21). Експерименти, проведені на нервових тканинах, продемонстрували присутність всіх трьох типів Са2± керованих Са2+ каналів ЕР у мозку ссавців, проте RyR2-тип є домінантним (38). Са2±управляемые Са2+ канали ЕР є гомотетрамерами, які з мономерів з молекулярным вагою 500 КБ (39).

IP3-управляемые Са2+ канали ЕР. Існування IP3-управляемых Са2+ каналів було вперше виявлено в нейронах Пуркинье. Пізніше засвідчили, що вони вмонтовані в мембрану эндоплазматического ретикулума. Структура IP3- керованих Са2+ каналів подібна зі структурою Са2±управляемых Са2+ каналів ЕР. Вони також є гомотетрамерами з молекулярным вагою мономера 260 КБ. 50% цих каналів активується 15 мкмоль/л IP3 і блокується рутенієм червоним і La3+. IP3-управляемые Са2+ канали виділили з мозку ссавців, та його аминокислотная послідовність була розшифровано. Було показано, що сімейство генів, экспрессирующих IP3-управляемые Са2+ канали, складається з 3 або чотирьох різних генів; вони характеризуються різної чутливістю до IP3 та відстаючі по-різному розподілені у мозку ссавців (45). Поріг активації цих каналів варіює між 0.2 — 0.5 мкмоль/л в нейронах Пуркинье мозочка зростає до 9 мкмоль/л в астроцитах.

4 Кальцієві насосы.

Існує дві сімейства Са2+ насосів, відповідальних ліквідовувати іонів Са2+ з цитоплазми: Са2+ насоси плазмалеммы і Са2+ насоси эндоплазматического ретикулума. Хоча вони відносяться до одному сімейству білків (так званому P-классу АТФ-аз), ці насоси виявляють деякі розбіжності у будову, функціональної активності і фармакологии.

Кальцієвий насос плазмалеммы. Са2+ насос плазмалеммы, який видаляє іони Са2+ з цитоплазми в межклеточное простір, було відкрито 1966 року. Молекулярні властивості Са2+ насосів плазмалеммы описані у кількох оглядах (18), проте достовірних даних про швидкості виведення Са2+ і регуляції Са2+ насосів в нервових клітинах трохи. Нещодавно розроблений двухфлуоресцентный микрокапельный метод (58), дозволяє одночасно вимірювати [Ca2+]i і вихід Са2+ назовні на одиночних клітинах. Дослідження, проведення допомогою цього методу на нейронах молюска і секреторных клітинах, показали, що активність Са2+ насоса плазмалеммы контролюється безпосередньо [Ca2+]i: збільшення концентрації цитоплазматического кальцію активує Са2+ насос (58). У нейронах молюска близько сорока% іонів кальцію, які входять у клітину у відповідь деполяризацию мембрани, виводиться з нейрона вже під час фази наростання [Ca2+]i, відбиваючи в такий спосіб активацію кальцієвого насоса плазмалеммы збільшенням концентрації цитозольного Са2+ (58).

Кальцієвий насос эндоплазматического ретикулума. Багато эукариотических клітинах, поруч із Са2+ насосом плазмалеммы, існує кальцієвий насос сарко (эндо)плазматического ретикулума (SERCA). У цей час описано по крайнього заходу 3 різних изоформы SERCA-насосов у клітинах ссавців. SERCA1-подтип зосереджений тільки у швидких кістякових м’язах, SERCA2-насосы поширені за іншими тканинах. Значимість SERCA3-насосов менш зрозуміла (13). Бєлки SERCA2-насосов поділяються на дві різні изоформы: SERCA2а, характерні для кардіоміоцитів і гладких м’язів, і SERCA2b, характерні для тканин мозку. Передбачається, що насоси SERCA у різний спосіб регулюються цитоплазматической і интралюминальной концентраціями Са2+: Збільшення [Ca2+]i активує захоплення іонів кальцію в ЕР, тоді як зростання вільного кальцію всередині ЕР ингибирует насоси SERCA (12). Насоси SERCA ефективно й селективно блокуються тапсигаргином в наномолярных концентраціях (37) і микромолярными концентраціями циклопиазоновой кислоти. Проте, тапсигаргин викликає також блокаду потенціал — керованих кальцієвих каналів плазмалеммы, як і показано на клітинах коркового шару надниркових залоз і сенсорних нейронах (Shmigol et al., 1995), тому його треба використовувати із певною осторожностью.

5 Кальцієві обменники.

Додатковим механізмом, відповідальних висновок іонів кальцію з цитоплазми, є натрий-кальциевый обменник, який Са2+, використовуючи енергію натриевого електрохімічного градієнта. Наявність Na± Са2+ обменника засвідчили у різних типах збудливих і невозбудимых клітин; у клітинах нервової системи він було у кінці 1960;х років (9). У нейронах молюска, поміщених у середу ввечері з зниженим натрієм (тобто. з зворотним натриевым градієнтом), спостерігалося зростання [Ca2+]i, що є наслідком роботи обменника в інвертованій формі. Проте, внесок Na± Са2+ обменника в регуляцію [Ca2+]i в нейронах ссавців до цього часу не оцінено. У деяких роботах засвідчили, що обменник приймає незначне що у видаленні цитоплазматического Са2+, у те час в інших роботах представлені дані про те, що обменник грає істотну роль перенесення Са2+ через мембрану (57).

6 Са2±связывающие органеллы.

Крім швидкого зв’язування цитозольного Са2+ внутриклеточными Са2± связывающими білками, іони кальцію, які у цитозоль, можуть акумулюватися апаратом Гольджи чи клітинним ядром, захоплюватися мітохондріальними Са2+ депо, мають досить невисока спорідненість до Са2+, чи швидкими депо, пов’язані з ЕР чи СВ, мають високе спорідненість до Са2+. Але якщо [Ca2+]i перевищує 0,5 мкмоль/л, спостерігається істотне перерозподіл [Ca2+]i до області мітохондрій. Буферні системи мітохондрій беруть участь у видаленні надлишкового Са2+ з цитоплазми в клітинах кишечника, деякі типи нервових клітин (59) й у секреторных клітинах після підвищення [Ca2+]i, стимулированного агонистами. Зв’язування кальцію митохондриями забезпечується активністю систем, розташованих на внутрішньої мітохондріальній мембрані. Са2+ вступає у мітохондрії по электрохимическому градієнту; різницю потенціалів, забезпечує транспорт кальцію, створюється перенесенням електронів під час клітинного подиху і що з ним перенесенням протонів. Перенесення електронів по дихальної ланцюга є основним механізмом, які забезпечують енергетику транспорту кальцію. Придушення дихальної ланцюга карбонил-цианид-мхлорофенил-гидразоном (СРСР) ефективно блокує акумуляцію кальцію митохондриями (41).

2 Вплив АТФ на кальцієвий гомеостаз.

Останні засвідчили, що АТФ займає сталу місце у ряду нейромедиаторов центральної і периферичної нервової систем (Burnstock 1990). Можна не сумніватися, що АТФ не лише найважливішим внутриклеточным метаболитом, а й слугує важливим об'єктом міжклітинного взаимодействия.

1 Будова й властивості АТФ.

[pic].

АТФ (див. мал.1) є нуклеотид як і всякий нуклеотид полягає із трьох компонентів: азотистого підстави, цукру пентози і фосфату. У ролі азотистого підстави у нуклеотидах присутні похідні пурину і пиримидина. Фосфати з'єднані в полифосфатную ланцюг, кількість що у природних нуклеотидах вбирається у трьох. Проте синтезовано нуклеотиди, містять лінійні ланцюзі з більш як 3-х фосфатів, приміром аденозинтетраі аденозинпентафосфаты. Назви нуклеотидів, які у ролі цукру рибозу, складаються з назви відповідного нуклеозида, приставки, що означає кількість фосфатних груп у нуклеотиде й фосфат. Для найпоширеніших нуклеотидів прийнято скорочені назви, наприклад АТФ для аденозинтрифосфата, ГТФ — для гуанозинтрифосфата, ИМФ — инозинмонофосфата.

У сфері нейтральних значень pH нуклеїнові основи, а рибоза в розчині не заряджені (Мартін, Маріам, 1982). Нуклеотиди, через наявність фосфатів, є сильні кислоти. АТФ містить чотири ВІН групи, здатні до іонізації, троє фахівців з яких мають pKa нижче 3, а pKa четвертої - 6,5 (Ленинджер, 1976). Отже, при pH 7,4 переважна більшість молекул АТФ є четырехзарядные аніони АТФ4-, ще, в розчині присутній небагато АТФ3-.

2 Номенклатура і субклассификация пуринорецепторов.

Перше поділ пуринорецепторов на Р1 і Р2 типи грунтувалося на наступному критерії: нуклеозиды такі як аденозин активували Р1 пуринорецепторы, тоді як АТФ стимулювала Р2 пуринорецепторы, а метилксантины (кофеїн, теофиллин) є селективными антагоністами Р1 пуринорецепторов. Також Р1 пуринорецепторы пов’язані з аденилатциклазой, а активація Р2 пуринорецепторов може спричинить виробленні простогландинов (Burnstock 1978).

3 Р1 пуринорецепторы.

У 1979 року (Van Calker et al 1979) показали, що аденозиновые, Р1 — пуринорецепторы можна підрозділити на дві групи. Рецептори, а такою мали дуже високий спорідненістю до аденозину (константа дисоціації Кd = 3 — 10 нМ). При взаємодії аденозина з цим групою рецепторів спостерігалося ингибирование аденилатциклазы і, отже, зменшувався рівень внутрішньоклітинного цАМФ. Цей клас рецепторів було названо А1 -рецепторами (Ri рецептори по (Londos et al 1980)). Аденозиновые рецептори, що відносяться до другий групі, мали нижча спорідненість до аденозину (Кd комплексу аденозина з рецептором 5−10 мкМ). Активація цього рецепторів наводила до стимуляції аценилатциклазы. Ці рецептори Ван Колкер назвав А2- рецепторами (Ra рецептори по (Londos et al 1980)). Знайдено ще й потужні антагоністи для А1 — R-N6-Фенилизопропиладенозин (R-PIA). Для А2 сильнішим антагоністом був 5'-N-этилкарбоксамидаденозин (NЕСА). Також існують роботи, у яких описуються аденозиновые рецептори, не пов’язані з аденилатциклазой ці пуринорецепторы запропонували назвати А3 (Ribeiro and Sebastiao 1986). Передумовою до поділу А2 пуринорецепторов на А2а і А2b підтипи стало відкриття різного спорідненості NECA до Р1 пуринорецептору, — високого в стриатуме (А2а) і низького в фибробластах (А2b) (Bruns et al 1986).

4 Р2 пуринорецепторы.

Накопичені фармакологічні докази, якось: тип відповіді, порядок активності агонистов, десенситизация, викликане АТФ і його структурними аналогами, послужили підвалинами першого субделения Р2 пуринорецепторов. У 1985 року Бернсток і Кеннеді (10) засвідчили її неоднорідність популяції Р2- пуринорецепторов. Такий висновок було зроблено з те, що у деяких тканинах (наприклад поздовжня м’яз сліпий кишки) АТФ викликав розслаблення гладких м’язів, а інших (м'язова стінка сечового міхура) — скорочення. Перший підтип рецепторів було означено як Р2у, а другий — Р2х. Для Р2х пуринорецепторов найактивнішим агоністом був (, (- метилен АТФ ((,(- мАТФ), а Р2у — 2 — метилтио АТФ (2-МеSАТP). Оскільки порядок активності лигандов може залежати від швидкості їх гідролізу до неактивних сполук, яка може значно різнитися залежно від тканини, чіткішим доказом для підрозділи Р2 — рецепторів на підтипи служить наявність селективних блокаторів. Зараз відомі селективні антагоністи як Р2х, і Р2у-рецепторов для Р2х — (,(-мАТФ (десенситизирующее дію), арилазидаминопропионил АТФ (АНАПП3), пиридоксалфосфат-6-азофенил-2', 4'- дисульфидная кислота (PPADS), сурамин та інші; для Р2у пуринорецепторов — реактив блакитний 2, сурамин. У 1986 року Гордон (23) запропонував виділення з класу Р2 пуринорецепторов решта 2 підтипу Р2t і Р2z. Перший рецептор розташований у тромбоцитах і управляє їх агрегацией. Він, на відміну решти підтипів P2 — рецепторів, активується АДФ, і блокується АТФ. Р2z рецептори перебувають у опасистих клітинах. Вони АТФ у великих концентраціях (> 100 мкМ), а точніше четырехзарядный аніон АТФ4-, викликав кальцийзависимую секрецію гістаміну. Інші пуриновые нуклеотиди, включаючи негидролизуемые аналоги АТФ, не активували рецептор. Також було виявлено неселективный антагоніст такого типу рецепторів DIDS — аналог PPADS (Soltoff et al 1993). У 1991 року O’Connor запропонував так званий нуклеотидный рецептор однаково чутливий як до АТФ, і до УТФ, але не чутливий до 2 — MeSATP. Цей рецептор отримав позначення Р2u. Можливим антагоністом даного рецептора є сурамин. Також було виявлено, що аденін динуклеотид полифосфаты також є в фармакологічній периферії (Hoyle 1990). Hildermann (1991) индентифицировал сайт зв’язування для диаденозин тетрафосфата (Ap4A) в мозку пацюки, що отримав назву дипуринергического рецептора, а пізніше Р2d (Pintor et al 1993). Антагоністи цього виду пуринорецепторов доки виявлено. |пуринорецепторы | | | | |Р1 — пуринорецепторы | |Р2 — пуринорецепторы | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |A1 | |A2a |A2b | |A3 | |P2x | |P2y | |P2t| |P2z| |P2u | |P2d |.

Таблиця 1. Класична схема субклассификации пурино-рецепторов.

5 Реклассификация пуринорецепторов.

Из — за усезростаючих труднощів і неузгодженостей у «класичній схемою класифікації Р2 пуринорецепторов і увеличивающемся числі підтипів рецепторів, стала очевидною, що класична схема потребує перегляду. У 1994 року Abbracchio and Burnstock запропонували нову схему класифікації Р2 — пуринорецепторов. З усіх Р2 — пуринорецепторов вони вичленували три основних сімейства: Р2Х сімейство, що з ионотропными каналами, котра включала чотири підтипу; Р2У — що з активацією G — білків, у тому числі сім підтипів і сімейство Р2Z — сімейство неселективных пір. Їх гіпотеза грунтувалася здебільшого вивченні літературних джерел постачання та аналізі фармакологічного профілю новообнаруженныж агонистов. Надалі теорія підтвердилася клонуванням різних підтипів Р2 — пуринорецепторов. Нині сімейство Р2Х в 6, а Р2У — сім підкласів. Завдяки інтенсивним дослідженням, мало залишається сумніву у цьому, що ці сімейства зростатимуть і далі (Collo et al 1996).

|Р2 — пуринорецепторы | | | | | | |P2Z — неселективные пори | | | | | | |Р2Х — сімейство | |Р2У — сімейство | |ионотропных | |метаботропных | |рецепторів | |рецепторів | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |Р2Х1|Р2Х2|Р2Х3|Р2Х4|Р2Х5|Р2Х6|Р2У1|Р2У2|Р2У3|Р2У4|Р2У5|Р2У6|Р2У7|.

Таблиця 2. Сучасна класифікація Р2 типу пуринорецепторов. ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1 Підготовка препарата.

Дослідження проводили на пірамідальних нейронах моторної області нової кори в тонких зрізах мозку, виділеного з 14-ти денних пацюків. Після декапитации мозок містився у холодний сольовий розчин (0 — 40С). Процедура з початку декапитации до виділення мозку тривала трохи більше 60−90 секунд. Потім мозок закріплювався полиакриламидным клеєм на підкладці вибротома (Campden, Campden Instruments Ltd, U.K.); камера вибротома заливалася холодним солевым розчином. Зрізи нарізалися сагитально завтовшки 250 — 300 мкм; швидкість подачі леза — 1 см/с із частотою 10 гц. Після приготування зрізи поміщалися в розчин постійно насыщаемый карбогеном (5% СО2 + 95% О2). Перед завантаженням флуоресцентним барвником зрізи инкубировались в постійно оксигенируемом розчині 30 хвилин за нормальної температури 32 градуси. Забарвлення зрізу здійснювалася протягом 30 — 35 хвилин, у СО2 насиченому термостаті за нормальної температури 35 градусів. Після забарвлення зрізи відмивалися 1 — 1,5 години на постійно оксигенируемом розчині при кімнатної температурі. Усі експерименти проводилися за нормальної температури 32 градуса.

2 Характеристики кальцієвого зонда.

[pic].

Для кількісного визначення концентрації кальцію в пірамідальних нейронах моторної області нової кори використовувався барвник Фура-2 AM (малюнок 2) (16). [pic].

На малюнку 3 представлений спектр зонда Хура -2 AM. При зв’язуванні з кальцієм відбувається характерне зміна спектра порушення цієї барвника: при порушенні світлом із довжиною хвилі 390 нм відбувається зменшення флуоресценции, а при порушенні світлом, із довжиною хвилі 340 нм — збільшення. Проте, 340 нм вже є ультрафіолетовим світлом, і її використання необхідний мікроскоп з кварцовими лінзами. Бо у нашому разі використали звичайний мікроскоп, то друга хвиля було обрано довжиною 390 нм. 360 нм — це изобестическая точка зонда Хура -2, тобто. флуоресцентний сигнал при порушенні світлом цієї довжини хвилі залежить від концентрації Ca2+ це і є функція лише концентрації зонда.

Вимірювання флуоресценции при порушенні двома довжинами хвиль дозволяє легко розрахувати [Ca2+]i у клітині за такою формулою (24):

[Ca2+]i= Kd * b * (R — Rmin)/(Rmax-R) де Кd — константа дисоціації комплексу Хура -2 з кальцієм, R=F360/F390 — поточне ставлення флуоресцентних сигналів, Rmin = F360/F390|Ca0 — те ставлення до розчині з низькою концентрацією Ca2+, Rmax = F360/F390|CaҐ - те ставлення до розчині із високим концентрацією Ca2+, b = F390|Ca0/F390|CaҐ - ставлення флуоресцентних сигналів в низької культури й високої концентрації Ca2+ при порушенні довжиною хвиль 390 нм. Параметри Rmin, Rmax і b визначали експериментально. І тому були приготовлені базовий розчин (в ммоль/л): KCl — 100, Tris-Cl — 10 (pH=7.2), Хура -2 — 0.005; розчин з низькою концентрацією Ca2+ готувався не додаючи Ca2+ з добавкою EGTA — 10; розчин із високим концентрацією Ca2+ - з добавкою CaСl2 — 10. Ставлення величин флуоресценции визначалося в краплях наведених вище розчинів, вміщених на дно експериментальної камери. Через війну нашій системи Rmin= 0.33, Rmax= 8.9 і b=12.8. Параметр Кd був зі роботи [Grinkiewicz et al, 1985] і дорівнював 224 нмоль/л.

3 Забарвлення зрізів флуоресцентним красителем.

Для запровадження кальцій — чутливого зонда у клітину, зрізи инкубировались в розчині Тироде, що містить эстерифицированную незаряженную форму барвника Фура-2 ацетоксиметилэстер у концентрації 5 мкмоль/л, розчинену в диметилсульфоксиде з додаванням детергента Плуроник F-127 (0.02%). У такій формі барвник проникає у клітину, потім ендогенними эстеразами ефірні групи отщепляются, зонд стає зарядженим залишити клітину неспроможна. Забарвлення здійснювалася 20 хвилин при температурі 35оС. Концентрація зонда у клітині визначалася шляхом титрування забарвлених клітин розчином барвника, який додавався у внеклеточный розчин. Оцінена у такий спосіб концентрація зонда у клітині був у діапазоні 30 — 70 мкмоль/л.

4 Структура експериментальної установки для двух-волнового виміру концентрації кальция.

Принципова схема установки представлена малюнку 4. Основними елементами її є: джерело світла, система зміни фільтрів, мікроскоп, ФЭУ, модуль попередньої обробки сигналу і компьютер.

Джерелом збудливого світла служить ртутна лампа потужністю 50 ватів. Бо у ролі кальцій — чутливого зонда використовували індикатор Хура -2 ГАМ, є з порушення двухволновым (див. вище), то тут для кількісного визначення [Ca2+]i потрібно було одночасно індукувати флуоресценцию обома довжинами хвиль. У нашій конфігурації періодична зміна фільтрів порушення реалізували з допомогою обертання колеса із вмонтованими до нього двома интерференционными фільтрами 360 і 390 нм. Частота обертання була 5 гц. Управління системою зміни фільтрів здійснювалося з допомогою кальцій — вимірювального модуля фірми Luigs und Neumann, Німеччина. Той самий модуль був інтерфейсом попередньої обработки.

Оптична частина установки було змонтовано з урахуванням мікроскопа Axioskop, Zeiss. Поділ потоків збудливого світла, і флуоресценции вироблялося з допомогою дихроического дзеркала. Світло, минулий через фільтр для порушення флуоресценции, відкидався дихроическим дзеркалом і з допомогою высокоаппертурного иммерсионного об'єктива (40*, апертура 0.75) фокусировался на об'єкті. Флуоресцентний світло проходив через відповідний інтерференційний фільтр і подавався на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Для зменшення рівня шумів фіксована діафрагма (1 мм) була розташована перед ФЭУ. Через війну флуоресцентний сигнал збирався з фокальної площині діаметром 50 мкм, що дозволило значно поліпшити співвідношення сигнал/шум.

Модуль попередньої обробки дозволяв виробляти компенсацію автофлуоресценции й за необхідності, посилювати сигнал, після що він оцифровывался з допомогою цифрового інтерфейсу TIDA і оброблявся комп’ютером з допомогою програм Tida 5.0 і Wintida, розроблених в Гейдельберзі, Німеччина. [pic].

Малюнок 4. Принципова схема експериментальної установки для двухволнового виміру кальция.

5 Розчини і зміна растворов.

Працюючи зі зрізами все розчини готувалися з урахуванням розчину Тироде (в ммоль/л): NaCl — 125, KCl — 5.4, MgCl2 — 1, CaCl2 — 2.5, NaHCO3 — 26, KH2PO4 — 1.6, глюкоза — 10, постійно аэрировавшийся газової сумішшю 95% О2 + 5% СО2 (pH=7.4). Бескальциевый розчин готувався эквимолярной заміною CaCl2 на MgCl2 і добавкою 1 ммоль/л EGTA, розчини з підвищеним змістом калію чи кофеїну — заміною NaCl відповідний кількість KСl чи кофеина.

Зміна розчинів здійснювалася протокою, швидкість якого було варіювати від 10 до 20 мл/мин. Обсяг експериментальної камери становив 0.5 мл. Усі експерименти було проведено за нормальної температури (32 ©.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

[pic].

Апплікація АТФ переважно нейронів моторної кори (98 з 102) викликає швидке і короткочасне підвищення концентрації цитозольного кальцію [Ca2+]i. Концентрація [Ca2+]i сягає свого максимуму на протязі 6−8 секунд і далі відновлюється до базального рівня при що триває присутності АТФ. Відмивання АТФ призводить до відновленню [Ca2+]i рівня спокою. Характерний вид АТФ — індукованого кальцієвого транзиента представлений малюнку 5.

[pic].

Амплітуда АТФ — індукованого кальцієвого транзиента варьировалась в межах від 50 до 450 нМ. Середнє значення викиду [Ca2+]i викликаного додатком АТФ у незначній концентрації 100 мкМ перебував у межах 200−250 нМ.

Спостерігалася доза — залежність амплітуди відповіді концентрації АТФ в межах від 10 до 2000 мкМ. На малюнку 7 представлена апроксимация експериментальних точок сигма — функцією. Концентрація АТФ, коли він амплітуда відповіді становить половину максимальної, — 220 ± 20 мкМ. [pic].

Метою перших із них було визначити підтипів пуринорецепторов втягнутих у генерацію [Ca2+]i транзиента. Відомо, що АТФ активує кілька типів пуринорецепторов, саме Р2 пуринорецепторы підтипів Р2х і Р2у (Peter Illes et al, 1993, Burnstock and Kennedy 1985), і навіть Са2+ канали плазмалеммы (Кришталь, 1983).

З метою забезпечення достовірності даних, приймаючи у увагу те що, робота проводилася на тонких зрізах мозку, ми провели серію експериментів із придушенням распостранения потенціалів дії з допомогою тетродотоксина (TTX). З використанням TTX з’ясувалося, що амплітуда і форма [Ca2+]i транзиентов не змінюється чи змінюється незначно. Отримані результати дозволяють нам припускати, що які ми отримували дані відбивають процеси які у окремої що спостерігається клітині. На жаль ми мали як проводити все експерименти з тетродотоксином через дорожнечу препарату. Для вивчення характеристик аналізованих пуринорецепторов, що у генерації [Ca2+]i транзиента, застосовувалися такі протоколи экспериментов.

1. Додаток АТФ в розчині не що містить Ca2+. Видалення кальцію з внеклеточного розчину незначно впливало на кальцієвий транзиент, викликаний аплікацією 10 мкМ АТФ, але у водночас придушувало на 45% ±.

7% кальцієвий транзиент викликаний 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).

[pic].

1. Для дослідження здібності внутрішньоклітинного Ca2+ депо до перезаполнению ми послідовно апплицировали АТФ кілька з інтервалом в $ 60 секунд у звичайному розчині й у розчині не содержащем.

Ca2+. Як очевидно з малюнка 9 друга аплікація АТФ викликала Ca2+ транзиент меншою (на 30% (4%) амплітуди проти первой.

(контрольної) аплікацією. Наступні аплікації АТФ розділені 60 ти секундним інтервалом викликали помітного зменшення амплитуды.

[Ca2+]i транзинета порівняно з другий аплікацією в стандартному розчині [pic].

У бескальциевом розчині - навпаки, друга аплікація АТФ викликала значне зменшення Ca2+ транзиента на 40% (5% від контроля.

Наступні аплікації АТФ в бескальциевом розчині призводили до послідовному зменшенню амплітуди [Ca2+]i транзиента і після двох — трьох послідовних аплікацій сигнал зникав вообще.

(малюнок 10). Таке зменшення мабуть зумовлено виснаженням внутрішньоклітинних депо. [pic].

1. Ингибирование захоплення Ca2+ эндоплазматическим ретикулом тапсигаргином.

(спецефическим блокатором Ca2+ насоса эндоплазматического ретикулума) зменшувало [Ca2+]i транзиенты, викликані додатком АТФ, на 63% (5% для концентрації АТФ 100 мкМ АТФ (рис. 11). Як очевидно з малюнка 11 додаток тапсигаргина не впливало на базальний рівень Ca2+ в клетке.

1. Додаток кадмію у незначній концентрації 50 мкМ, верапамила в концентрации.

100 мкМ і 50 мкМ нікелю можна зупинити зменшувало амплітуду [Ca2+]i транзиента викликаного додатком 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, і 15% сответственно. Дані представлені малюнку 12. [pic].

1. Додаток різних агонистов пуринорецепторов викликало різні за амплітудою відповіді. Порядок відносної активності лигандов для даного об'єкта був такий ATP (S (ATФ (AДФ (((,(-methylene ATP.

(AMФ (УТФ ((аденозин (ADO), дані преставлены малюнку 13. [pic].

1. Сурамин, відомий антагоніст Р2 типу пуринорецепторов, уменьшал.

[Ca2+]i транзиенты, викликані додатком 100 мкМ АТФ на 76% (7% і залишався вірним концентрацію [Ca2+]i у спокої. Дані представлені малюнку 14. [pic].

ОБСУЖДЕНИЕ.

При дослідженні середніх верств неокортекса пацюків ми знайшли їх здатність відповідати на додаток АТФ. Отже ми в змозі зробити висновок про наявність у даному об'єкті пуринорецепторов. Відповідь на АТФ є доза — залежним з амплітудою половинного відповіді в 220 нМ. Послідовні докладання АТФ, другого докладання, викликали зменшення амплітуди [Ca2+]in транзиентов. Із цього можна дійти невтішного висновку про відсутність десенситизации такого типу рецепторов.

Досліджуючи джерела підвищення цитозольного кальцію ми виявили, що АТФ активує як ионотропные і метаботропные рецептори. Блокатори потенціал — керованих кальцієвих каналів такі як кадмій, нікель і верапамил зменшували АТФ — індуковані кальцієві транзиенты на 35% - 15%, що свідчить про опосередкованому АТФ активировании потенціал — керованих каналов.

Для дослідження активацію метаботропных рецепторів. І тому ми докладали АТФ в бескальциевом розчині, — амплітуда відповіді у своїй зменшувалася на 45% (7%. Цей результат свідчить, що внутрішньоклітинні депо беруть участь у генерації [Ca2+]in відповідей, причому їхній внесок близький до половини. При повторних аплікаціях АТФ в бескальциевом розчині Ca2+ відповідь зникав повністю після Другої аплікації, тобто. внутрішньоклітинні депо повністю виснажуються. Досліджуючи шлях вивільнення внутрішньоклітинного кальцію ми апплицировали тапсигаргин — спецефический блокатор АТФ — ази эндоплазматического ретикулума. [Ca2+]in транзиенты зменшувалися на 63% (5% у присутності тапсигаргина. Апплікація коффеина, агониста рианодиновых рецепторів, у клітинах моторної кори 14 денних пацюків викликали підвищення рівня [Ca2+]in. Отже викид [Ca2+]in з внутрішньоклітинного депо іде за рахунок IP3 — вразливому механизму.

Надалі ми досліджували докладніше типи присутніх пуринорецепторов. Побудувавши ряд активності агонистов для Р1 і Р2 пуринорецепторов по амплітудам відповідей, ми зробили висновок що базується на відсутності відповіді аденозин, що в об'єкті присутні Р2 пуринорецепторы. Проводячи подальшу субклассификацию Р2 типу рецепторів ми використовували сурамин — блокатор деяких типів Р2х і Р2у рецепторів. Додаток сурамина зменшувало амплітуду [Ca2+]i транзинета викликаного додатком 100 мкМ АТФ на 76% (5%, що свідчить про наявності цих типів рецепторів в досліджуваному объекте.

ВЫВОДЫ.

1. Додаток АТФ у різних концентраціях викликає Ca2+ транзиенты у клітинах моторної кори пацюків. 2. Відповідь на АТФ є доза — залежним з амплітудою половинного відповіді в 220 нМ. 3. АТФ активує як ионотропный і метаботропные шляху підвищення внутрішньоклітинного кальцію. 4. У генерації АТФ індукованого підвищення [Ca2+]in беруть участь деякі типи потенціал — керованих кальцієвих каналів. 5. Вивільнення внутрішньоклітинного кальцію відбувається з IP3 чутливих депо. 6. У цьому об'єкті присутсвуют лише Р2 підтипи пуринорецепторов. 7. Сурамин — антагоніст Р2Х2 і Р2Х5 і Р2У рецепторів зменшує амплітуду [Ca2+]in транзиенты, що говорить присутності деяких із перелічених вище рецепторов.

1. A. Shmigol, A. Verkhratsky & G. Isenberg (1995): Calcium-induced calcium release in rat sensory neurones. Journal of Physiology.

(London), 489.3 627−636. 2. A. Shmigol, G. Isenberg, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1994): Calciuminduced Ca2+ release from internal stores in rat dorsal root ganglion neurones. In: European Journal of Neuroscience, Suppl. 7,.

Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting, p. 146. 3. A. Shmigol, N. Svichar, P. Kostyuk & A.Verkharatsky. (1995):

«Incremental» caffeine-induced calcium release in mouse sensory neurones. European Joutnal of Neuroscience, Supple № 8. p111.

Proceedings of the 16th Annual ENA Meeting. 4. A. Shmigol, Yu. Usachev, N. Pronchuk, S. Kirischuk, P. Kostyuk &.

A.Verkhratsky (1994): Properties of the caffeine sensitive intracellular calcium stores in mammalian neurons. Neurophysiology.

/Neirophiziologia, v. 26 No. 2, p. 16 — 25. 5. A. Verkhratsky, A. Shmigol, P. S. Kirischuk, N. Pronchuk & P. Kostyuk.

(1994): Age-dependent changes in calcium currents and calcium homeostasis in mammalian neurons. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 747, p365 — 381. 6. Abbracchio, M. P., Burnstock, G. (1994) Purinoceptors: are there families of P2x and P 2y purinoceptors? Pharmac. Ther. 64: 445−475 7. Anatoly Smigol, Platon Kostyuk, Alexey Verhratsky (1994) Role of caffeine-sensitive Ca2+ stores in Ca2+ signal termination in adult.

DRG neurones // NeuroReport v.5, 2073;2076. 8. Anatoly Smigol, Sergey Kirischuk, Platon Kostyuk, Alexey.

Verhratsky (1994) Different properties of caffeine-sensitive Ca2+ stores in peripherial and central mammalian neurones // Pflugers.

Arch v.426, 174−176. 9. Baker P. F., Blaustein M.P., Hodgkin A.L. and Steinhardt R. A. (1969).

The influence of calcium on sodium efflux in squid axons. J. Physiol.,.

Lond. 200, 431−458.

10. Bean B.P. (1992) Pharmacology and electrophysiology of ATP-activated ion channels. Trends Pharmacol. Sci. 13, 87 — 90.

11. Belan P., Kostyuk P., Snitsarev V. and Tepikin A. (1993) Calcium clamp in isolated neurones of the snail Helix pomatia. J. Physiol., Lond.

462, 47 — 58.

12. Bronner, F. (1990). Intracellular Ca2+ regulation. New York: Wiley;

Liss.

13. Burk P. S. E., Lytton J., MacLennan D. H. and Shull G. E. (1989). cDNA cloning, functional expressing, and mRNA tissue distribution of a third organellar Ca2+ pump. J. Biol. Chem. 164, 18 561−18 568.

1. Burnstock, G. (1972) Purinergic nerves. Pharmacol. Rev. 24: 509−581 1. Burnstock, G. (1978) A basis for distinguishing two types of purinergic receptor. in: book 1. Burnstock, G. (1990) Co-transmission. Arch. Int. Pharmacodyn. 304: 7−33 14. Burnstock, G., Kennedy, C.(1985) Is there a basis for distinguishing two types of P2 purinoceptor? Gen.Pharmacol. 16: 433−440 15. Carafoli E. (1992) Calcium pump of the plasma membrane. Physiol. Rev.

71, 129 — 153.

16. Chen, C.-C., Akopian, A.N. et al, (1995) A P2x purinoceptors expressed by a sybset of sensory neurones. Nature 377: 428 — 431.

17. Кришталь О. А., Марченко С. М. (1983). Рецептори АТФ в сенсорних нейронах ссавців. Докл. Акад. наук УССР.

18. Gianini G., Clementi E., Ceci R., Marziali G., and Sorremtino V. (1992).

Expression of a ryanodine receptor Ca2+ that is regulated by TGF-b,.

Science, 257, 91 — 94.

19. Ginetta Collo et al, (1996) Cloning of P2X5 andP2X6 receptors and the distribution and properties of an extended family of ATP-gated ion channels. The J. of Neurosci. 16(8): 2495−2507 20. Gordon, J. L. (1986) Extracellular ATP: effects, sources and fate.

Biochem.J. 233: 309−319 21. Grynkiewicz, G., Poenie, M., and Tsien, R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescent properties. J. Biol.

Chem., 260, 3440−3450, 1985.

22. Heizmann C.W. and Hunziker W. (1991) Intracellular calcium-binding proteins: more sights than insights. Trends Biochem. Sci. 16, 98 — 103.

23. Heschler J. and Schultz G. (1993) G-proteins involved in the calcium channel signalling system. Curr. Opin. Neurobiol. 3, 360−367.

24. Hiderman, R. H., Martin, M., Zimmerman, J. K., Pivorun, E. B. (1991).

Identification of a unique membrane receptor for adenosin 5(, 5(((;

P1,P4-tetraphosphate. J. Biol. Chem. 266: 6915−6918 25. Hoyle, З. H. V. (1990) Pharmacological activity of adenine dinucleotides in the periphery: possible receptor classes and transmitter function. Gen. Pharmacol. 21: 827−831 26. Hymel L., Inui M., Fleischer P. S. and Schindler H. (1988). Purified ryanodine receptor of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum forms Ca2± activated oligomeric Ca2+ channels in planar bilayers.

Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85, 441−445.

27. Kirischuk S.I., Voitenko N. V., Kettenmann H.O. and Verkhratsky.

A.N. (1994) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Bergman glial cells // Neurophysiology v.26, 417−419. 28. Kirischuk, V. Matiash, A. Kulik, N. Voitenko, P. Kostyuk,.

A.Verkhratsky (1996) Activation of P2-purino, (1-adreno and H1- histamine receptors triggers cytoplasmic calcium signalling in cerebellar Pupkinje neurons // Neuroscience v.73, 643−647 29. Kostyuk and A. Verhratsky (1994) Calcium stores in neurones and glia //Neuroscience v. 63, N.2, 381−404. 30. Kostyuk P. G. (1992). Calcium ions in nerve cell function. Oxford, New.

York, Tokyo: Oxford University Press.

31. Kuno M., Maeda N. and Mikoshiba K. (1994) IP3-activated Ca2±permeable channels in the incide-out patches of cultured cerebellar Purkinje cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 199, 1128 — 1135.

32. Lуckhoff A. and Clapham D.E. (1992) Inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate activates an endothelial Ca2±permeable channel. Nature 355, 356−358.

33. Londos, З., Cooper, D. M. F., Wolff, J. (1980) Subclasses of external adenosine receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2551−2554 34. Lytton J., Westlin M. and Hanley M. R. (1991). Thapsigargin inhibits the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca-ATPase family of calcium pums. Biol. Chem. 266, 17 067−17 071.

35. Mackgrill J. J. and Lai F. A. (1994). Solubilization of the type 3 ryanodine receptor from rabbit brain. Biophys. J. 66, A147.

36. McPherson P. P. S., Kim Y. K., Valdivia H., Knudson З. M., Takekura H.,.

Franzini-Armstrong З., Coronado R. and Campbell K. P. (1991). The brain ryanodine receptor: A caffeine-sensitive calcium release channel.

Neuron 7, 17−25.

37. N. Voitenko, S. Kirischuk, A. Kulik, A. Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones of the mouse cerebellar slices //.

Pflugers Archiv European Journal of Physiology, v.430, Supplement.

4, R124. 38. Nicholls D.G. (1985) A role for the mitochondria in the protection of the cell against calcium overload. Prog. Brain Res. 63, 97−106.

39. Pintor, J., Diaz-Rey, M. A., Torres, M., Miras-Portugal, M. T. (1992).

Presence of diadenosine polyphosphates-Ap4A and Ap5A-in rat brain synaptic terminals. Ca2±dependent release evoked by 4-aminopyridine and veratridine. Neurosci. Lett. 136: 141−144 40. Ribeiro, J. A., Sebastiao, A. M. (1986) Adenosine receptors and calcium: basis for proposing a third (A3) adenosine receptor. Prog.

Neyrobiol. 26: 179−209 41. Rios E. and Pizarro З. (1991) Voltage-sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiol. Rev. 76, 849 — 908.

42. Ross З. A., Danoff P. S. K., Schell M. J., Snyder P. S. H. and Ullrich A.

(1992). Three additional inositol 1,4,5-trisphosphate receptors:

Molecular cloning and differential localization in brain and peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4265−4269.

43. S. Kirischuk, N. Voitenko, P. Kostyuk, A. Verkhratsky (1995) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices //.

Cell Calcium v.18, 464−476 44. S. Kirischuk, N. Voitenko, P. Kostyuk, A. Verkhratsky (1996) Ageassociated Changes of Citoplasmic Calcium Homeostasis in.

Cerebellar Granule Neurones in situ: Investigation on Thin.

Cerebellar Slices. // Experimental Gerontology 45. S. Kirischuk, N. Voitenko, T. Moller, H. Kettenmann and A.Verkhratsky.

(1995) ATP-induced cytoplasmic calcium mobilization in bergman glial cells // J. Neuroscience v.15, 8234−8248. 46. Scheggerburger R., Zhou Z., Konnerth A. and Neher E. (1993). Fractional contribution of calcium to the cation current through glutamate receptor channels. Neuron 11, 133−143.

47. Sergej Kirischuk and Alexej Verkhratsky (1996) [Ca2+]i recordings from neural cells in acutely isolated cerebellar slices employing differential loading of the membrane-permeant form of the calcium indicator fura-2 // Pflugers Arch. -Eur. J. Physiology v.431, 977;

983 48. Sergej Kirischuk, Nana Voitenko, Platon Kostyuk, Alexej.

Verkhratsky (1996) Calcium signalling in granule neurones studied in cerebellar slices // Cell Calcium v.19, 59−71 49. Shmigol A., Kirischuk P. S., Kostyuk P. and Verkhratsky A. (1994).

Different properties of caffeine-sensitive Ca2+ stores in peripheral and central mammalian neurones. Pflьgers Arch. 426, 174−176.

50. Shmigol, D. Eisner & A. Verkhratsky (1995): Cyclic ADP ribose enhances Ca2±induced Ca2+ release in mouse sensory neurones.

Journal of Physiology, London, v. 483P, p63P. 51. Shmigol, N. Svichar, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1996) Gradual caffeine-induced Ca2+ release in mice DRG neurones is controlled by cytoplasmic and intraluminal Ca2+. Neuroscience, 73 N 4, 1061;

1067 52. Shmigol, P. Kostyuk & A. Verkhratsky (1995): Thapsigargin blocks plasmalemmal voltage-operated calcium channels in mouse DRG neurones. Journal of Physiology, London, v. 483P, p64P. 53. Soltoff, P. S. P., McMillian, M.K., Talamo, B.R., Cantley, L. C.(1993).

Blockade of ATP binding site of P2 purinoceptors in rat parotid acinar cells by isothiocyanate compounds. Biochem. Pharmacol. 45: 1936;1940 54. Tatsumi H. and Katayama Y. (1993) Regulation of intracellular free calcium concentration in acutely dissociated neurones from rat nucleus basalis.J.Physiol., Lond.464,165−181.

55. Tepikin A. V., Kostyuk P. G., Snitsarev V. A. and Belan P. V. (1992a).

Extrusion of calcium from a single isolated neuron of the snail Helix pomatia. J. Membrane Biol. 123, 43−37.

56. Thayer S.A. and Miller R.J. (1990) Regulation of the intracellular free calcium concentration in single rat dorsal root ganglion neurones in vitro. J.Physiol. (London), 425, 85 — 115.

57. Ursula Windscheif, (1996) Purinoceptors: from history to recent progress. Review. J. Pharm. Pharmacol. 48: 993−1011 58. Van Calker, D., Muller, M., Hamprecht, B. (1979) Adenosine regulates via two different types of receptors, the accumulation of cyclic AMP in cultured brain cells. J. Neurochem. 33: 999−1005 59. Verkhratsky & A. Shmigol (1996) Calcium-induced calcium release in neurones. Cell Calcium, v.19, No 1, 1−14. 60. Voitenko N., Kirischuk P. S., Verkhratsky A. (1995) Mechanisms of cytoplasmic calcium signalling in cerebellar granule neurones in situ. // Експериментальна та клінічна фізіологія, збірник наукових праць до 100-річчя кафедри фізіології Львівського медичного університету, р.357. 61. Zhou Z. and Neher E. (1993). Calcium permeability of nicotininc acetylcholine receptor channels in bovine adrenal chromaffine cells.

Pflugers Arch. 425, 511−517.

62. Zhou Z. and Neher E. (1993). Mobile and immobile calcium buffers in bovine adrenal chromaffin cells. J.Physiol., Lond. 469, 245−273.

———————————;

Малюнок 1. Будова молекули АТФ.