Як гені людини завдають на карту

Красноярский Державний Педагогічний Университет Реферат Тема: Як гени людини завдають на карту работу виконав: студент групи 40 факультету інформатики Шишканов Д. В. перевірив: Никольский Красноярск 2000 р.

Введение

.

Генетика людину, як фундаментальна, і прикладна наука. Як фундаментальна наука — це область генетики, що вивчає закони спадкоємності та мінливості найцікавіших організмів — людських істот. Наукові результати, отримані у своїй, цінні для нас потребу не лише у теоретичному плані. Саме тому генетика — це і прикладна наука. Важливість її добробуту людства дуже великий, успіхи, досягнуті у цій галузі, приносять ученим велику радість, ніж нові відомості, отримані в доти чисто теоретичних або суто прикладних исследованиях.

За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я, близько 2,5% новонароджених народжуються з різноманітними вадами розвитку. У цьому 1,5−2% їх обумовлені переважно несприятливими зовнішніми (екзогенними) чинниками, інші ж мають переважно генетичну природу. Генетичні чинники пороків розвитку відбивають так званий загальний генетичний вантаж популяції, що виявляється у 5% населення планети. Приблизно 1% генетичного вантажу посідає генні мутації, 0,5% - на хромосомні мутації, близько 3−3,5% відповідає хворобам з вираженим спадковим компонентом (діабет, атеросклероз, ішемічна хвороба серця, деякі пухлини тощо.). Якщо до цього додати, що майже 40−50% ранньої дитячої смертності та інвалідності з дитинства обумовлені спадковими чинниками і роблять приблизно 30% ліжок у дитячих стаціонарах зайняті дітьми зі спадковими патологіями, стає зрозумілою безумовна необхідність правильна й раціонально організованою ранньої діагностики уроджених і спадкових хвороб (пренатальної діагностики). Знання в області генетики дозволив би як встановити діагноз до народження, а й запобігти появі світ дітей із тяжкими, невиправними пороками розвитку, з соціально значимими смертельними генними і хромосомними болезнями.

Кількість генних хвороб, доступних молекулярної діагностиці, вже перевищує 1000 і продовжує швидко збільшуватися. Створено й постійно вдосконалюються дедалі нові ефективні і універсальні методи ДНК-діагностики, такі, як засіб полімеразної ланцюгову реакцію (ПЛР), автор якої - американського вченого Кэй Муллис відзначений Нобелівської премією 1994 року, метод гібридизації, який увічнив ім'я її творця Ед. Саузерна (1975 рік), й ефективні методи ДНК-секвенирования (аналіз первинної послідовності нуклеотидів в ланцюжку ДНК), розроблені П. Сэнджером.

Кілька років тому почалися дослідження з міжнародної програмі «Геном людини », що поєднувала зусилля учених багатьох країн. Кінцевою метою її - створити докладну карту людського геному, тобто повного набору його генів. А мета запропонованого реферату значно більше скромна: пробившись крізь завісу заумних термінів (в каковом відношенні генетика — дисципліна нелегкотравна навіть самих генетиків), запровадити читача в курс однієї з найбільших наукових проектів века.

География генома.

До цього часу можливості науки дозволяли складати успіхів хіба що генетичні карти зовсім простеньких організмів, на кшталт кишкової палички. Якщо всю послідовність її генів, складових єдину замкнуту хромосому, роздрукувати на папері в стовпчик дрібненько, присвоївши кожному гену короткий ім'я з трьох-чотирьох літер, вийде книжечка сторінок на 300 звичайного формату. Якщо ж як і бути з людським геномом — підсумковий працю займе 200 томів по 1000 сторінок каждый.

Нині ця неосяжна «бібліотека «нагадує скоріш смітник книжок: більшість аркушів не заповнене, інші переплутані, і взагалі далеко ще не відомо, який тому якого йде. Відомо, геноми людини налічує близько 80 000 генів, які у сумі з майже 3 млрд. пар нуклеотидів (так називається мономер подвійної спіралі ДНК, аналогічно як амінокислота — мономер білкової молекули). Локалізовано ж тільки 7000 генів — менше 10%. Для деяких районів геному, які мають особливий інтерес, складено досить детальні карти, інших — дуже приблизний або взагалі никаких.

Карти геному, як і географічні, можна будувати по-різному масштабі, з різним рівнем дозволу — останній залежить від точності методу аналізу. Існує чи два різновиди карт геному — власне генетичні, одержувані непрямими методами, і її фізичне — результат прямого дослідження молекули ДНК. Максимально можлива ступінь деталізації - з точністю до пари нуклеотидів (далі п.н.). Інакше кажучи, сама великомасштабна карта — повна послідовність нуклеотидів з зазначенням, де закінчується один ген і розпочинається наступний. Але це межа мрій, і що перед ним далеко. Бо, чому ми сьогодні маємо, — переважно мелкомасштабные карти всіх 23 пар людських хромосом з відстанню між окремими маркерами — дрібними «помітними на місцевості об'єктами «- 7−10 млн. п.н.

Почати з карт, який складають з допомогою непрямих методів вивчення генома.

Карти генетичного сцепления.

Передусім зазначимо, що людське ДНК полягає, слід сказати, не тільки з генів. Ген, чи экзон, — це экспрессируемый ділянку молекули ДНК, інакше кажучи, її відрізок, у якому, як у верстаті, «штампуються «молекули тієї чи іншої білка. Але переважна більшість нуклеотидних послідовностей в ДНК — интроны, не які кодують нічого. Не відомо, навіщо вони потрібні І що роблять, але — явно потрібні і роблять, інакше їх было.

Карта генетичного зчеплення складається так. Спочатку потрібно вибрати маркери — якісь ознаки організму, про які достеменно відомо, що вони спадкові, а чи не «набуті «. Щоправда, ознака годиться на роль маркера, тільки якщо у ній є різницю між індивідами і якщо ці відмінності легко виявити. Скажімо, колір очей, чи група крові, чи схильність до якоїсь болезни.

Коли маркери обрані, починається аналіз їхній наслідування. У генів є одне цікаве властивість — можуть рекомбинировать, тобто. перерозподілятися. Або у розвитку сперматозоїдів і яйцеклітин ланцюжок ДНК випадково розривається і возз'єднується на різних роботах, або дві хромосоми, складові пару (гомологичные), обмінюються відповідними ділянками. У обох випадках виходить нове поєднання ознак — ті, які зазвичай успадковуються спільно, разделяются.

Отож, відома закономірність: чим ближче друг до дружку розташовані два гена на хромосомі, важче їм «розпрощатися «при рекомбінації - один «тягне «у себе інший. У цьому й грунтується побудова карт зчеплення. Чим рідше відбувається рекомбінація між даними двома признаками-маркерами, тим менше відстань між генами, їх кодирующими.

Щоправда, у такий спосіб бачимо лише взаємне розташування «діючих «геном (экзонов) — вірніше, обчислити відстань з-поміж них на хромосомі за частотою рекомбінацій. Встановлено, що й остання дорівнює 1%, дистанція між генами становить приблизно млн. п.н., чи 1 МБ (одну мегабазу — останнім словом і означає «мільйон підстав », тобто. нуклеотидів). Одна мегабаза «на місцевості «відповідає 1 дИВ на карті (однієї сантиморганиде — назва цієї одиниці дали честь великого генетика Т.Х. Моргана).

Але аналогічним чином можна картировать і интроны. Їх маркерами зазвичай служать звані сайти впізнавання. Річ у тім, що є спеціальні ферменти, призначені для розрізування ДНК, — рестриктазы. Це білкові молекули особливого устрою. Наприклад, вони просто «шинкуют «ДНК, ріжуть на відтинки, але як потрапило, а певних місцях. Будь-яка рестриктаза може впізнати лише один стандартну послідовність з кількох нуклеотидів. Остання і ГЗК стає сайтом впізнавання для ферменту. І вже як і той «покромсает «ДНК, залежить від цього, як густо вона «всіяна «сайтами впізнавання. Молекули рестриктазы хімічно пов’язуються з ними у цих місцях рвуть ланцюг ДНК.

Є порівняно простим методам виміру довжин ділянок, на які порізала молекулу ДНК рестриктаза. Будь-яка зміна сайту впізнавання веде до того що, що той стає «невидимим «для ферменту. Отже, ДНК розрізається деінде й утворяться інші за довжиною фрагменты.

Чим хороший метод картирования генетичного сцеплению — може бути застосовувати, які мають найменшого уявлення про структуру генів розв’язання тих чи інших ознак. Досить впевненості, що такі гени — є, а подальші заходи спрямовані те що, щоб отримати, ДЕ вони, а чи не ЯКІ они.

Недоліки методу — досить низька що дозволяє здатність (7−10 МБ) та висока трудомісткість. З іншого боку, ген на карті постає не протяжним відрізком ДНК (який він «на місцевості «), а точкою на лінії, яка зображує її подвійну цепь.

Нарешті, на жаль, людина — не дрозофіла. Дуже легко вважати частоту рекомбінації маркерів, схрещуючи дрібних мушок тисячами і десятками тисяч. А Homo sapiens такий спосіб крім того не годиться, і частоті рекомбінації доводиться судити з статистичним даним — скажімо, про захворюваність таким-то спадковим недугою в стількох сім'ях за стільки-то десятиліть (або навіть століть). До речі, саме генетичне картування допомогло знайти точне розташування на хромосомах генів багатьох тяжких спадкових хвороб — муковісцидозу, серпоподібноюклітинної анемії, хореї Гентингтона, хвороби Тея-Сакса, поликистоза нирок, миотонической дистрофії і других.

Мелкомасштабные фізичні карты.

До них відносять хромосомні й карти кДНК («до «отже «яка кодує «).

Хромосомне картування досить грубо, але є сенс, коли потрібний ген тримають, що називається, до рук: відома його структура, він хімічно виділено, але не відомо, де зараз його «сидить ». Тоді хромосоми, витягнуті з ядра клітини під час її розподілу (що вони товсті і добре помітні), обробляють особливими барвниками, надають їм «полосатость »: виходять звані бэнды — разноокрашенные ділянки хромосом. Зазначений ген розмножують у пробірці і навіть мітять його копії, підміняючи, наприклад, водень тритієм. За таким радіоактивним зондом зручне стежити: якщо підмішати його до препарату хромосом і витримати кілька днів, він хімічно пов’яжеться з певним бендом певної хромосоми, ставши «на своє місце «(це й називається «гібридизація in situ », тобто. «дома »). Так були картированы гени альбуміну, колагену, гормону розвитку і деякі другие.

Середня величина бенду — близько 20 МБ: така й точність хромосомної карти. Щоправда, пізніше вдосконалення — гібридизація з флуоресцентної міткою (FISH — fluorescent in situ hybridization) — підвищило дозвіл до 5−2 МБ. Понад те, розроблений навіть метод гібридизації мічених генів з хромосомами, витягнутими з ядра неделящейся клітини — і отже, де конденсированными, «развинченными », а чи не упакованими в компактні освіти. У результаті вдалося локалізувати ділянки до 0,1 Мб.

Карти кДНК відбивають розташування экспрессирующихся нуклеотидних послідовностей. Російською це що. Припустимо, у клітині активно працює, виробляючи білок, якийсь ген. Ну й ген — невідомо. Де він — теж. Тоді користуються та обставина, що з синтезі білка в клітинному ядрі спочатку «штампуються «молекули мРНК — точні копії працюючого гена («м «- матричні). Цей проміжний продукт можна виловити з клітки і розмножити у пробірці, позначивши тритієм або радіоактивним фосфором. А далі усе як при хромосомному картировании: зонд прилаштувався до дільниці N — отже, експресія йшла тут і, отже, міститься ген, який кодує даний белок.

Великомасштабні карти генома.

Їх становлять за загальним принципу: спочатку шматують ДНК на шматки, розганяють утворені фрагменти в електричному полі (електрофорез) і потім гибридизируют з міченим зондом. Через війну фрагменти упорядковуються — відтворюється їх вихідна послідовність. І тому використовують різні методи пошуку перекрывающихся участков.

У кожному випадку необхідно передусім одержати фрагменти ДНК картируемого ділянки багато. ДНК розмножують зазвичай двома способами — клонуванням і ПЦР.

КЛОНУВАННЯ — по сучасним поняттям порівняно примітивний метод. Послідовність дій така: порізали рестриктазой изучаемый ділянку ДНК — вставили кожен її відрізок у молекулу вектора (бактеріальної, дріжджової або інший кільцевої ДНК), розрізану лише у точці тієї ж рестриктазой: вийшла рекомбінантна кільцева ДНК з «чужій «вставкою. Таку змішану ДНК «вселяють «в ядро клетки-хозяина (зазвичай бактерії), й приймається ділитися у культурі, завдяки рекомбінантна ДНК — в.о. її геному — розмножується практично до будь-якого кількості копій. Результат — набір клонів різних фрагментів картируемой ДНК, чи, як зазвичай називають, бібліотека клонов.

ПОЛІМЕРАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ (ПЛР) — лабораторний синтез фрагментів ДНК без клетки-хозяина. У пробірку до фрагмента, які треба розмножити, «підсаджуватимуть »: а) фермент ДНК-полимеразу, що здійснює відтворення ДНК в живих клітинах; б) будматеріал, тобто. окремі нуклеотиди; в) прамеры — короткі ланцюжка нуклеотидів, відповідні кінців размножаемого фрагмента. Тут, як бачите, слабке місце: про згаданий ділянку треба дещо знати заздалегідь — саме структуру праймеров…

Потім пробірку нагрівають — фрагмент від спеки «розклеюється », розділяючись на дві ланцюга; пробірку охолоджують — праймери приєднуються до кінців фрагмента і полимераза розпочинає свою справа. Чергуючи нагрівання і охолодження, можна протягом півтори години довести кількість копій потрібної ділянки ДНК за кілька мільйонів — чого й полягає найголовніша перевага ПЛР перед клонуванням. Але в має дві вади. Один вже згаданий — треба знати праймери «межи очі «, інакше реакцію вдасться запустити. Другий — технічна неможливість копіювати фрагменти довші 5−6 п.н.

Коли все фрагменти ДНК одержані достатню кількість копій, їх упорядковують, навіщо спочатку поділяють электрофорезом, та був хімічно пов’язують (гибридизуют) з міченим зондом, щоб кожен фрагмент встав на місце й дуже сказати, просигналізував себе: ось він я!

Великомасштабні фізичні карти геному бувають двох типів. Перший — МАКРОРЕСТРИКЦИОННЫЕ (за принципом «згори донизу »): ДНК ріжуть редкощепящей рестриктазой на великі шматки, упорядковують їх, потім ділять більш дрібні, теж упорядковують. Така карта охоплює досить високі ділянки геному — до 10 МБ — і містить прогалин. Але її дозвіл порівняно невелика — від 1 МБ до 100 кб.

Набагато вище точність у КАРТ КОНТИГ. Їх будують по зворотному принципу — «знизу вгору ». Хромосому шинкуют на дуже короткі фрагменти, розмножують їх і упорядковують. Набір упорядкованих коротких фрагментів, покриваючих певний ділянку хромосоми, — і є контига. Де само собою воно розташована на хромосомі, можна встановити методом FISH.

Щоправда, карту контиг важко розширити до великих районів хромосоми, оскільки не можна розмножувати великі фрагменти ДНК — ні клонуванням, ні ПЛР. Хоча у останні роки досягнуть серйозний успіх: удалося створити гігантську молекулу-вектор, у якому можна вбудувати ділянку людської ДНК розміром до мегабазы. Цей вектор називається YAC — the yeast artificial chromosome, штучна дріжджова хромосома. До впровадження YAC як векторів застосовувалися переважно бактеріальні плазміди — малесенькі каблучки ДНК, що несли вставки чужорідного матеріалу максимум в 20−40 кб. Сенс застосування YAC — значне зменшення кількості клонів, потрібно упорядочивать.

Прогулянка на хромосоме.

Усі згадані вище методи дозволяють створювати або приблизні карти великих регіонів геному, або докладні «топографічні плани «дрібних його ділянок. Як поєднати й інше — закартировать великий район, але детально?

Сучасна стратегія заповнення прогалин — прогулянка по хромосомі. Її починають із якогось короткого ділянки, чия нуклеотидная послідовність вже розшифровано. Нею синтезують праймер, гибридизируют його з цим допитаним клоном з неупорядкованою геномної бібліотеки, та був «підключають до діла «полимеразу — вона робить ланцюг, комплементарную даному клону. Потім цю ланцюг секвенируют, та її хвостик використовують як праймера у наступний крок по хромосоме.

Тому-то й пролунало слово «секвенування ». Так називається новітній, прославлений, найдокладніший, найточніший… і, з дозволу сказати, тягомотнейший метод картирования геному. Його сутність — повне розшифрування послідовності нуклеотидів. Щоб на деталях пояснити, як здійснюється, знадобилася б двогодинна лекція з молекулярної біології. Тож у двома словами: з бібліотеки клонів витягають фрагмент ДНК, знову клонируют, а утворені копії хімічно перетворять в набір відрізків ДНК, різняться за довжиною лише на нуклеотид (який саме цю стадію практично неможливо описати загальнодоступним мовою — настільки вона складна навіть генетика-профессионала). Потім згадані відтинки поділяються на гелевой платівці в пульсуючому електромагнітному полі (пульс-форез). Послідовність нуклеотидів читають по фореграмме: кожен відрізок «їде «по гелевой платівці настільки далеко, наскільки великий його довжина, і місце у одному з чотирьох шпальт — залежно від того який нуклеотид (які лише чотири типу) він довші соседнего.

Хоча сучасні вдосконалення дозволяють вивчати одночасно до 40 клонів однією гелі, витрати часу та коштів однаково величезні. Навіть досвідчена робочу групу на кращому устаткуванні секвенирует на рік трохи більше 100 000 п.н. на рік. Якщо прийняти це вартість аналізу кожної пари підстав за долар — весь геном дозволить бути секвенирован за 3000 років, і обійдеться його вивчення у 3 мільярда доларів. Сума по нинішніх часів цілком прийнятна хоча на слух, а от час… Зараз, щоправда, розвиваються технології секвенування другого покоління — високовольтний капиллярный електрофорез, ионизационная резонансна спектроскопія. Вони прискорюють процес значно — отже, вистачить три століття (свої ж гроші). Обнадіює, але з слишком.

Очевидно, програма «Геном людини «буде виконано лише з технологіям третього покоління, нині чинних в зародковому стані. Проти них частковості, належить пряме читання послідовності нуклеотидів з допомогою що сканує туннельной чи атомною мікроскопії. Сьогоднішня наука робить ставку саме у такі методи — інакше прогулянка по людським хромосомам погрожує затягнутися на тысячелетия.

Заключение

И ось за очі мені попалася журнальна замітка, датована березнем 2000 року, у тому, що розшифровано послідовність ДНК 22-ї людської хромосоми. Це перше найповніша розшифровка цілої структури в генетичному апараті чоловіки й — 1/23 частина глобального проекту «Геном людини ». Вражають масштаби колективного авторства — 216 учених із Великобританії, США, Японії, Канади та Швеції. Тільки ця хромосома містить більш 20 генів, зміни, якими призводять до відомим захворювань людини, зокрема (може бути), і з генів, зумовлюючих шизофренію. Для повного розкриття геному людини трудитися ще доведеться довго. Проте, на думку керівника геномного проекту Френсіса Коллінза, нинішнє досягнення можна вже порівняти з «розщепленням атома чи польотом на Місяць ». Жуль Верн у своїй романі «20 тисяч льє під водою «припускав створення машини, що дозволяє людині вивчати морські глибини. Тепер батискафами, винайденими Жаком Ивом Кусто, користується увесь світ, удосконалюючи знання про морської флорі і фауні. У 1990 року Гаррі Гарриссон у романі «Рятувальна шлюпка «описав створення сильних, здорових, але генетично придушених рабів. Нині ж… Може людству слід подумати з інших наслідками розшифровки геному людини, крім викорінення спадкових захворювань. Не приведи Господи, що вони, ці наслідки самі «зваляться нам на голову ». Згадуючи нацистські чистки, який начитався Ніцше, Гітлера, випробування Водневої бомби, спроби Генріха Гіммлера створити надлюдини, виникає цілком резонне запитання: А ЩО ДАЛЬШЕ?

Список литературы

Журнал «Техніка Молоді «. Різні матеріали за 1999;2000 р.; Матеріали, опубліковані Інтернету на сайтах internet internet internet.