Реєстрація сигнальних молекул

РефератДопомога в написанніДізнатися вартістьмоєї роботи

Проблема збереження чужорідних генів, перенесених в растение Чужеродные ДНК, перенесені в рослинні клітини з допомогою різних методів, зазвичай вбудовуються в ядерний геном і успадковуються відповідно до законами Менделя. Області ингерации, ймовірно, розподілені випадково за геномом. Вбудовування генів з певних сайтах було раніше описано в системах тварин клітин і UMC нещодавно такий підхід… Читати ще >

Реєстрація сигнальних молекул (реферат, курсова, диплом, контрольна)

літератури | | |додаток | | | СПИСОК СОкРАЩЕНИЙ НУК — нафтиуксусная кислота БАП — бензиламинопурин MS — LB — тДНК — Ар — ампицилин Cs — цефотоксин ЗАПРОВАДЖЕННЯ Актуальність роботи: Властивість бактерій виду Agrobacterium tumefaciens викликати в рослин корончато-галловую хвороба пов’язані з присутністю у тому клітинах великих (95- 156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (від анг. tumor-inducing — викликає пухлина). У процесі идентифицирования рослин частина генетичного матеріалу Ti-плазмид — тДНК (від анг. transferred DNA — передана) переміщається в рослинні клітини, і інтегрується в хромосоми, залишаючись частиною спадкового матеріалу. Гени тДНК экспрессируются в трансформарованных рослинних клітинах, порушують їх фитогормональный баланс визначають синтез специфічних ———- сполук. Отже, агробактерї є природними «генними інженерами », здійснює разючий по філогенетичної дальності перенесення генетичної інформації. За підсумками агробактерій сконструйовані ефективні векторні системи для генетичної інженерії рослин. Агробактириальная трансформація відбувається внаслідок складного процесу взаємодії між бактеріальними і рослинними клітинами. У цьому вся процесі одній з вирішальних стадій є рецепція агробактериями особливих сигнальних молекул, присутніх в экссудатах ушкоджених тканин рослин. Сигнальні молекули індукують експресію генів області vir (агробактериальных Ti-плазмид), контролюючих вирізання тДНК і його перенесення у клітини рослин. Агробактерильная трансформація практикується в широкого кола голонасінних і двочасткових рослин, проте, вона відзначено тільки в дуже незначної кількості однодольных рослин. Однією з причин їхнього обмежень агробактериальной трансформації однодольных вважається присутність у їхній клітинах сигнальних молекул, индуцирующих процессинг і перенесення тДНК. Мета роботи: Нині є суперечливі дані щодо наявності таких сигнальних молекул у однодольных рослин. У зв’язку з цим, метою даної роботи був аналіз ряски на присутність вони сигнальних молекул, индуцирующих процессинг тДНК. 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 1.1. Використання Ti-плазмид агробактерій у генетичній інженерії рослин 1.1.1. Коротка характеристика Agrobacterium tumefaciens.

За останнє десятиліття сфері генетичної інженерії рослин досягнуто неабиякі успіхи. Розроблено різноманітні методи генетичної трансформації й у час здійснена експресія чужорідних генів у рослинах багатьох видів. Найважливішим у розвиток генетичної інженерії рослин було відкриття молекулярних основ пухлинних утворень з допомогою Agrobacterium tumefaciens [7]. Вирулентные штами Agrobacterium tumefaciens (цьому. Rirobiaceae) характеризуються присутністю у клітинах великий плазмідами, так званої Tiплазмідами, вагою більш 150 т.п.н. (див. Додаток) [9]. Агробактерї викликають пухлинний зростання в багатьох двочасткових і голонасінних, а як і в деяких однодольных рослин [2,3]. Для інфікування in vivo необхідно ушкодження тканин рослини [12]. Після прикріплення до клітинної стінці рослинної клітини агробактерї переносять частина Ti-плазмиды (так званої тДНК) в ядро, де відбувається її стабільна інтеграція в хромосому рослини. Доведено, що функція розпізнавання клітин та прикріплення до них, а як і вирізання, перенесення і, можливо, інтеграція тДНК в рослинний геном кодується двома хромосомними генами — Chva і Chvb [13] і низкою генів virобласті, що є на Ti-плазмиде [14]. Після перенесення в ядро рослинної клітини, тДНК може інтегрувати в геном у вигляді одного чи навіть кількох копій [15]. Вбудована тДНК властиво, характерні для ДНК эукариот, що показано в експериментах по гіперчутливості до ДНК-азе I (Schafer, 1984). Залежно від типу Tiплазмідами, в тДНК перебуває від семи до тринадцяти генів, відповідальних за пухлинний фенотип. Гени 1 і 2 кодують ферменти, що у синтезі ауксина, индолилуксусной кислоти, тоді, як ген 4 кодує изопентенилтрансферазу, що синтезує цитокинин изопентенила денозин 5 «- монофосфат [16]. Одночасна транскрипція генів 1,2 і 4 приводить до підвищення рівня фитогормонов всередині трансформованих клітин. Результатом цього є підвищення митотической активності й освіту пухлини. Інші гени тДНК кодують синтез про опинов, у тому числі найбільш вивчені нопапин і октопин. Опины є похідне амінокислот і цукрів, які є джерелом харчування для агробактерій [14]. У цілому нині, освіту корончатого галла є добре охарактеризований приклад генетичної інженерії рослин, у природі. Мутації в вирулентных генах агробактерій. Наявність Ti-плазмид у клітинах агробактерій є цілком необхідною умовою патогенності мікроорганізму. Вилікувані від Ti-плазмид штами агробактерій авирулентны. На вірулентність Agrobacterium tumefaciens впливають різні мутації, картируемые як у пухлинних плазмидах, і на хромосомах. Ранні етапи взаємодії агробактерій з рослинами, як і хемотаксис, прикріплення до рослинної клітини, і специфічне зв’язування в центрах інфекції контролюються генами, мають хромосомну локалізацію. У хромосомі розташовані деякі гени, регулюючі експресію vir-генов Ti-плазмид [19]. Приєднання агробактерій до клітинам рослини одна із перших етапів, визначальних ефективне взаємодія. Цей етап у Agrobacterium tumefaciens контролюють два пов’язаних між собою хромосомних локусу Chva і Chvb, розмірами 1,5 kb і 5kb, відповідно [Дуглас та інших, 1985]. Гени цих локусів экспрессируются конститутивно. Через війну транспозонного мутагенезу цих галузей отримують авирулентные чи дефекнтые по прикреплению агробактерї. Мутації у тих локусах сильно знижують чи інгібірують вірулентність бактерії, але з всім господарів. Локус Chvb визначає синтез нейтрального циклічного (-Dгликана, який трансформується на периплазматическое простір клітини з допомогою продукту гена Chva. Роль нейтрального (-D-гликана в інфекційному процесі точно не встановлено. Крім циклічного (-D-гликана в прикреплении патогенних агробактерій до рослинним клітинам приймають співчуття й інші полісахариди, зокрема внеклеточные экзополисахариды. Організація vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гени агробактерій на Tiі Ri-плазмидах кластеризованы у сфері vir разметом близько 30−35 kb, яка проявляє у тих плазмидах значну гомологию ДНК. Виявлено також гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens з tra-генами конъюгитивных плазмід. У ——- Ti-плазмидах у сфері vir локалізовано шість різних груп комплементации A, B, З, D, E і G, організованих в єдиний регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 має додатковий локус vir F, розташований праворуч від локусу vir E [Kooykaas et al., 1984]. Мутації в генах і ————- vir A, vir G, vir B і vir D надають агробактериям авирулентный фенотип, на відміну більшості хромосомних мутацій, мають коло трансформованих растений-хозяев. Продукти генів vir-области контролюють процессинг тДНК в бактеріальної клітині, її перенесення в рослинну клітку та інтеграцію в ядерний геном рослини, причому ці процеси гени vir можуть визначати у цис, але й у транс становищі стосовно тДНК (тобто перебувають у різних репликонах). Виходячи з цього властивості області vir, сконструйовані і успішно використовують у практиці зручні бінарні вектори для генетичної інженерії рослин [Дрейпер з співавт, 1991]. Для процесів «вирізання «тДНК з плазміди (точніше, вивільнення у процесі репликативного синтезу) і його перенесення на рослину необхідно фланкування цій галузі особливими межами: недосконалими прямими повторюваними послідовностями ДНК розміром 24 ——, але виявляють значну гомологию в усіх вивчених Tiі Ri-плазмид. Кордони тДНК гомологичны області oriT конъюгативных плазмід. У цій сфері сайт-специфические эндонуклеазы виробляють одноцепочечный розрив, службовець початком реплікації на кшталт разматывающегося рулону, яка відбувається у процесі транспорту плазмідами. Реплікація забезпечує збереження плазміди в материнської клітині й поява її копії в дочірньою. Для нормального процесингу тДНК і його перенесення в рослинну клітину дуже багато важить її права кордон, яка одна може визначати полярність перенесення тДНК. Видалення правої кордону з Ti-плазмид робить агробактерї повністю авирулентными. Заміна в штучно синтезовану, як і як і ліву, відновлює вірулентність мікроорганізму. На процессинг тДНК у клітинах бактерій впливають мутації в генах vir D, vir З і vir E — оперонов, на транспорт т-комплекса в рослинну клітину — мутації в генах vir B і vir D — оперонов.

1.1.2. Створення векторів з урахуванням Ti-плазмид В початку 1980;х років було зроблено перші спроби перенести чужорідні послідовності ДНК в рослинні клітини або з допомогою транспозонного мутагенезу [Uernals-teens et al., 1980], або шляхом сайтспецифічної міграції генів у тДНК і наступного подвійний рекомбинацией з Ti-плазмидой дикого типу [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981]. Проте, ці ранні експерименти, засновані на подвійний рекомбінації, займали чимало часу, були доволі-таки складні і трансформації проходили з дуже низької частотою. І було розробити ефективніші вектори, щоб полегшити генетичні маніпуляції з бактеріями й дозволити селекцію і регенерацію трансформатов. Зараз використовують дві принципово різні системи запровадження чужорідних генів у рослини з допомогою Ti-плазмид: —— вектори бінарні вектори. У основі створення ———— векторів лежить те що, що гени тДНК не ———- для рослинних клітин, і кожна последовтельность ДНК, вбудована між межами тДНК, може інтегрувати в хромосому рослинної клітини, і нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. У ———— векторых системах тДНК усунути, наприклад, на послідовність pBR322, а чужорідну ДНК, яку передбачають перенести в рослини, потрібно проклонировать у тому ж векторі. Потім шляхом гомологичной рекомбінації ця чужорідна ДНК то, можливо перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штами агробактерї (рис. 2). Одним із перших таких векторів виходячи з Ti-плазмид авляется pGV3850 [Zambryski et al., 1983]. У ньому не всі гени, відповідальні синтез фитогормонов, було замінено на послідовність pBR322. ДНК pBR322 забезпечувала гомологию для ———- області тДНК pGV3850 із будь-якими производыми pBR, несучими клонований ген. Гени, які кодують різні маркерні білки до швидшого відбору трансгенних рослин, були вмонтовані в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Було розроблено система трехродительного схрещування для перенесення будь-яких похідних pBR322 з E. coli в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. У цей час сконструйовані успішно використовуються та інші —- ————— вектори з урахуванням Ti-плазмид [Royers et al., 1988]. Рис. 2. Схеми ———— (А) і бінарною (Б) векторних систем. vir — область вірулентності. HOM — області гомології, у яких може відбуватися рекомбінація, яка веде до утворення коинтегратов. LB і RB — ліва і права кордону тДНК. MCS — ——- сайт для клонування. РТМ — маркет трансформації для рослин. RES — маркер опірності антибіотика для бактерій. OriT — початок перенесення і bom-сайт для мобілізації векторів при кон’югації. Col E1 — початок реплікації з плазмідами Col E1. RK2 — початок реплікації з плазмідами кола господарів RK2. Система бінарних векторів полягає в тому, що область тДНК і гени vir можуть распологаться різними плазмидах [Hockemu et al., 1983]. У цих системах звичайно є два елемента: Ti-плазмида-помощник, у якій тДНК польностью делетирована. Ця плазмида несе на собі гени vir, діючі in trans. Плазмида кола господарів, має сайти для клонування і маркерні гени для селекції рослин, обмежені правої та скільки лівої фланкирующими послідовностями тДНК [An et al., 1988] рис Обидві згадані вище системи векторів припускають ————- етапах складання потрібних конструкцій в проміжних вектори, наприклад, у pAP2034 [Veltena, Sehell., 1987] чи pRT103 [Topter et al., 1983] та був перенесення з в готовому вигляді у рецепиентные штами агробактерий.

1.1.3. Процессинг тДНК в бактеріальної клітині і його перенесення у клітини рослин Форми процессированной тДНК. При культивуванні Agrobacterium tumefaciens з механічно пошкодженими частинами рослин, регенерирующими протопластами чи присутності ————- з клітин бактерій можна назвати різні молекулярні форми процессированной тДНК — одноцепочечные лінійні, двуцепочечные лінійні і двуцепочечные кільцеві, що потенційно можуть бути посередника в перенесення генетичного матеріалу в рослинну клітину [———-, 1980]. Причому кільцева форма, що настає з допомогою гомологичной рекомбінації між правої та скільки лівої кордоном тДНК з освітою однієї гібридної кордону, є у дуже малих кількостях. За її освіті немає репликативного синтезу ДНК, в нас саме у разі створення двох за інші форми, можливо проходження реплікації тДНК в бактериах у її транспотра в рослини (до появі одноцепочечных форм може приводити переривання, ингибирование переривчастого синтезу запізнілої ланцюга). Реплікація покликана забезпечити збереження тДНК в вихідної Ti-плазмиде, за умови що недопущення можливість існування фізичного вирізання матеріалу тДНК з Tiплазмід з допомогою освіти двухцепочечных розривів у межах. Зникнення тДНК з Ti-плазмид головне недоліком що відійшла на другому плані як і «эксцезионной моделі «. Проте, освіту двуцепочечных розривів всередині меж упорядкування і поява детектируемых кількостей лінійної двуцепочечной форми тДНК при культивуванні бактеріальних клітин у присутності ————— дослідники спостерігали вже 30 хвилин після додавання цього індуктора у середу. Також за умов індукції vir-генов —- ——— у клітинах агробактерій можна знайти лінійна одноцепочечная форма процессированной тДНК [Stachel et al., 1986]. Поява цього интермедиата можна знайти через восьму годину після додавання індуктора, та її кількість накопичується протягом наступних 40 годин більш, ніж у двічі, та був зменшується, показуючи, що лімітований. Яка форму транслоцируется через бактеріальну мембрану в бактеріальну клітину досі залишається не з’ясованим через труднощі визначення відносного кількості кожної форму і виявлення динаміки їх перетворення. Можливо, процессинг і транспорт тДНК не роз'єднані у часі і йдуть сопряженно подібно конъюгационному переносу плазмід, цих подій в місці контакту мембран конъюгирующих клітин [Clark and Warren, 1979]. Тоді все виявлені интермедиаты може бути аберрантными формами перерваного якомусь етапі неділимого процесу (чи неправильно завершеного). У разі індукованої експресії vir-генов ———- відсутня головний елемент взаємодії - контакт бактеріальної клітини, і рослинної клітини, і, тому, все виявлені у разі форми можуть бути посередника лише з деякими допущеннями. Достеменно відомо, що у рослинну клітину потрапляє лише одне ланцюг тДНК і конвертується в двуцепочечную вже у рослинної клітині. Обговорюється, у разі проходження у клітині Agrobacterium tumefaciens —- ——- полуконсервативной реплікації тДНК друга ланцюг може у процесі перенесення гидролизоваться, звільняючи енергію для транспорту стерпної цепи.

1.1.4. Розробка система трансформацій рослин з допомогою Agrobacterium tumefaciens.

Большинство початкових экспериметнов по генетичної трансформації рослин було зроблено з допомогою зараження поранених рослинних клітин із допомогою агробактерій з немодифікованими Ti-плазмидами. Для збереження стерильності часто инфицировали эксплантаты in vitro замість цілих рослин. Бактерії потім видаляли, додавали у середу цефотоксин чи карбенициллин. Трансформанты відбирали на безгормональной середовищі. Надалі принаймні створення обеззброєних векторів і нових селективних маркерів, розробили ефективніший метод, дає велика кількість трансформантов: кокультивирование агробактерій з рослинними протопластами або з эксплантантами листя. Було показано, що кокультивирование протопластів з агробактериями, або з бактеріальними ——- —-, призводить до утворення пухлини [Marton et al., 1979, Wullems et al., 1981]. Потім такий підхід успішно застосовано для трансформації рослинних клітин агробактериями, несучими у складі тДНК химерні селективні маркери [Fraley et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983]. Цей метод був у подальшому поліпшився використанням про фидерных культур [Fraley et al., 1983]. Проте, усі ці методи придатні лише трансформації рослин, які можна легко регенерувати з протопластів (наприклад, тютюн і петунія). Ця проблема мрожно легко подолати кокультивируя агробактерї з листовыми дисками замість протопластів [Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986]. Стерильні листові диски ————- з агробактериями, несучими у складі обезоруженного вектора будь-якої селективний маркер опірності антибіотика. Потім шматочки листя культивують 2 дні на фидерных чашках з середовищем для освіти втеч. Після цього їхні переносять на середу ввечері з цефотоксином знищення бактерій і із будь-яким антибіотиком (наприклад, з ————-) для відбору трансформантов. Регенерировавшие пагони дають коріння, після чого рослини переносять у грунт щодо подальших експериментів. Оскільки метод трансформації листових дисків є ідеальне поєднання високої частоти трансформації з легкої і швидкої ———- і регенерацією трансформантов, цей підхід використовують у багатьох лабораторіях світу. З іншого боку було запропоновано деякі модифікації методу. На підвищення частоти трансформації листових дисків Arabiodopsis було запропоновано обробляти агробактерї ————- [Sheikholeskam a. Week P. S, 1987], що є індуктором генів vir [Stachel et al., 1985]. Проте метод трансформації листових дисків застосуємо для трансформації лише з тих видів рослин, які можуть опинитися регенерувати пагони з недиференційованих клітин на місці поранения. Поруч із методом трансформації листових дисків широко використовуються конъюгированные агробактерї зі стеблевыми сегментами [An et al., 1986], клітинами суспензированной культури [Scott a. Draper, 1987], микрокаллусами [Pollock et al, 1985] і прорастающими насінням [Feldmam a. Markis, 1987]. Метод трансформації насіння агробактериями було вжито для арабідопсису і заслуговує на увагу, бо вимагає роботи з культурою ткани.

1.1.5. Проблема збереження чужорідних генів, перенесених в растение Чужеродные ДНК, перенесені в рослинні клітини з допомогою різних методів, зазвичай вбудовуються в ядерний геном і успадковуються відповідно до законами Менделя [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Області ингерации, ймовірно, розподілені випадково за геномом. Вбудовування генів з певних сайтах було раніше описано в системах тварин клітин [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] і UMC нещодавно такий підхід успішно застосовано для трансформації рослин [Paszkowski et al., 1988]. Найчастіше послідовності чужорідної ДНК вбудовуються до одного локус або у однієї копії, або у формі кластера тандемных вставок, було показане з допомогою гібридизації in situ [Mouras et al., 1986]. Проте, часто спостерігаються множинні вставки удвічі або як ділянок різними хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a. Marus, 1987]. У зв’язку з цим у багатьох случах отримали контрансформация фізично несцепленных генів, сегрегація деяких відбувалася поколінні F1 [De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986]. Чужеродыне гени зазвичай передаються нащадку з високим рівнем стабільності при мейозе [Muller et al., 1987]. Проте, іноді спостерігали випадкову втрату трансформованого фенотипу після мейоза [Potrykus et al., 1989]. Возмножно, це діялося через активації чужорідного гена (наприклад, при метилировании ДНК). Інтеграція чужорідної ДНК у внеядерные геноми, наприклад, в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], як і іде за рахунок неменделевскому типу наслідування — за материною лінії. Використовуючи метод гібридизації по Саузерну [Southern, 1975] для аналізу трансформантов та їхніх нащадків, багато дослідників показали, що часто спостерігається убудовування укорочених, тандемных чи перебудованих копій чужорідних генів, особливо — по прямого перенесення ДНК в протопласти [Krens et al., 1985]. Поява тандемів, часто від 5 до 20 копій, можна пояснити поруч рекомбінацій перед інтеграцією в геном [Szernilofsky et al., 1986; Wirtz et al., 1987]. Освіта инвертированных повторів є основним типом перебудов чужорідної ДНК при застосуванні векторів, містять тДНК —- — Ti-плазмиды [Jorgensen et al., 1987]. Отже, під час проведення дослідів по трансформації рослин, необхідно ухвалити до уваги те що, що чужорідна ДНК може зазнавати різним модифікаціям перед встраиванием в геном хазяїна. Проте, і після інтеграції можуть відбуватися різні її перебудови, звичайно під час мейоза [Czernilofsky et al., 1986]. У разі лише перехресне запилення старанно відібрані трансформантов з найбільш бажаним генотипом і фенотипом дає потомство з передбачуваними призанаками.

1.1.6. Аналіз експресії чужорідних генів у трансформованих растениях Для якісного і кількісного аналізу експресії чужорідних генів у рослинах використовують безліч методів, включаючи Нозери-анализ РНК [Nagy et al., 1988] і Вестери-анализ продуктів трансдукції [Burnette, 1981]. Крім того, вивчають фенотипічні ознаки такі як, опірність антибіотиків і гербіцидів. Для аналізу експресії таких репортерных генів, як cat, npt II, гени октопині ———— розроблено чутливі методи [Otten a. Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982]. Такі аналіз може мати велике значення, оскільки можна комбінувати які кодують послідовності репортерных генів з підходящими регуляторними послідовностями рослинних генів, творити подвійні гени, экспрессирующиеся з однієї й того промотора. Активність гена і промотора можна в такий спосіб визначити або з допомогою ферментативного аналізу, або гибридизацией рослинної РНК з зондами, комплементарними репортерному гену. Перераховані вище різноманітні методики можна успішно застосовувати для аналізу експресії чужорідних генів у трансгенних рослинах, зокрема, генів опірності гербіцидів, комахою, опроміненню, антибіотиків і др.

1.2. Використання методу генетичної інженерії для трансформації однодольных рослин 1.2.1. Стислі характеристики ряски Сімейство рясковые, Lemnaceae включає 6 родів та 30 видів, можна зустріти на всіх континентах. Найширше вони поширені у Північній та Південної Америці, Африці, Австралії. Представники сімейства рясковые є найменшими у світі цветковыми рослинами, віночки яких рідко перевищують 1 див. Через війну гидрофильной еволюції вони крайньої ступеня редукції всіх своїх органів, тому й за простотою будівлі займають місце квіткових. Рясковые — водні, свободноплавающие, здебільшого багаторічні трав’янисті рослини. За природою рясковые є неотеническими формами що сталися від предків сучасного водоплавающего роду Пистия з сімейства Ароидных. Рясковые служать кормом для диких та домашніх качок, а так інших водоплавних і болотних птахів, для риб, особливо коропа, і ондатри. У сільське господарство їх використав свіжому і сушеному вигляді як цінний білковий корм для свиней і виконання домашньої птахи. Застосовуються рясковые і очищення води, оскільки беруть із нього і запасають у своєму листі азот, фосфор, калій, а як і поглощиют вуглекислий на газ і збагачують воду киснем. Вживаються і людини. Останні 50 років рясковые розглядаються, як надзвичайно цінний експериментальний об'єкт для морфогенетических, фізіологічних і біохімічних досліджень завдяки невибагливість до середовища, малим розмірам, швидкому зростанню, що дозволяє вживати лише генетичний клон протягом усього эксперимента.

1.3. Сигнальні молекули, спроможність індукувати процессинг тДНК Экспрессию генів vir-области індукують специфічні сигнальні молекули у вигляді позитивної регуляції системи до складу якої входять гени virA і virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986]. Активаторами транскрипції vir-генов є низькомолекулярні моноциклические фенольные сполуки, синтезовані в механічно ушкоджених тканинах рослин [Stuchel, 1985]. Прикладами таких сполук є —————- і досить широке коло похідних ———- биосинтетического шляху метаболітів захисної природи чи попередників лігніну. Сигнальні молекули були вперше виявлено в экссудатах коренів і листя двудольного рослини Nicotiano tabacum, вони були ідентифіковані як ——- і ———-. Ці сполуки синтезували метаболически активні пошкоджені тканини рослин. Нині встановлено сигнальна индуцирующая активність у великий групи ———- сполук рослинної природи. Механічне ушкодження тканин рослин призводить до посиленню синтезу таких сигнальних сполук. Відомо, що —————— і коричная кислоти, виявляють сигнальну активність, мають як і антимикробными властивостями і є проміжними метаболітами по дорозі синтезу ———-. ————— розпізнаються специфічними рецепторами агробактерій, можуть бути трансмембранными хеморецептргыми білками з різноманітною ———- до таким молекулам [Leroux, 1987]. Для оптимальної індукції експресії генів vir потрібно присутність у эксцудатах рослин різних вуглеводів: глюкози, глюкуроновой кислоти, галактозы, галактуроновой кислоти, арабинозы, маннозы, фукозы, целлобиозы і ксилози, які мають компоненти клітинної стінки рослин. Такі вуглеводи пов’язуються з периплазматическим доменом рецептора як попередньо обробленого комплексу з білкомпродуктом хромосомного вирулентного гена Chv E, причому кінцевий результат індукції процесингу тДНК залежить від синергічної активності сигнальних сполук і цукрів эксцудатов рослин. Структурна формула:

Позитивная регуляторна система vir A — vir G, контролює експресію генів vir ——-, працює так. Экспрессируемый конститутивно ген vir A виконує функцію рецепції сигнальних молекул рослин i трансмісії цього сигналу в бактеріальну клітину. Цей мембранний хеморецептор після ухвалення зовнішнього сигналу активує продукт гена vir G, який у часи чергу виступає в качетве позитивного регулятора власної транскрипції і транскрипції інших генів vir ——-. Механізми активації такі. Білок vir A, двічі пронизуючий мембрану бактерії, у разі сигнальних молекул автофосфорилируется ————- своєму С-конце, переходячи в активну форму. (За відсутності індукції С-терминальный домен білки vir A взаємодіють із W-терминальным доменом, ингибируя киназную активність). Активоване білок vir A своєю чергою ————- внутрішній клітинний білок — трансдуктор сигналу vir a по залишку аспарагина — 52 [Jin et al., 1990]. Фосфорований білок vir G пов’язують із промоторами інших генів регулона зі своїм власним, виступаючи у ролі транскрипционного активатора. Індукція vir генів поправна, і каскад реакцій то, можливо перерваний, що дуже важливо задля патогена: у разі, якщо господар хворої мами та нежиттєздатний організм, перенесення тДНК у його клітини не здійснюється [Hess et al., 1991]. Крім позитивної регуляторної системи vir A — vir G, локалізованої на Tiплазмиде, в регуляції експресії vir-генов беруть участь і хромосомні гени. Про це свідчать виявлення спонтанного хромосомного мутанта ros, яка має гени vir З і vir D — оперонов экспрессируются за відсутності сигнальних молекул рослин. 3. Матеріали й методи 2.1. Матеріали 2.1.1. Оборудование Копалка, термомиксер 5436, центрифуга «Эппиндорф », прилад для горизонтального електрофорезу, джерело харчування 2197, термостат ТС-80 Мг.

2.1.2. Бактеріальні штами і плазмиды Штамм: |Escherichia coli HB 101 Agrobacterium tumefaciens C58C1 | |Плазмідами: |рGV3850 | |тДНК: |рBR322 маркер Ар, Тс | | 2.1.3. Растения В ролі об'єктів дослідження використовували двох-, тримісячне однодольное рослина ряски крихітної (Lemna perpusilla). Рослини вирощували в теплиці в вегетационных посудинах за нормальної температури 18−250 З повагою та 12 годинному світловому періоді. Відносну вогкість повітря в теплиці підтримували не більше 65−70%. Для аналізу брали стерильні тканини листя. Стерилізацію проводили гипохлоридом натрію протягом 5−10 хвилин, а потім матеріал 3 разу промивали стерильною водою й використали в експериментах по індукції vir-генов Ti-плазмид. Порівняйте було взято двудольные рослини тютюну червоного та льону долгунца.

2.1.4. Середовища мікробіологічні для культивування растений В роботі використовували середовища: Для мікроорганізмів — LB (Лурия-Бертани) NaCl Дріжджовий екстракт Бантотриптон |10 мг/л 5 г/л 5 г/л | |рН 7,5 Температура 240 З Довжина світлового дня 16 годин На чашку Петрі: LB штам |10 мл 1 мл | |Для культивування рослин — середовище MS (Мурасиге-Скуча) приведено в таблице.

2.1.5. Інші растворы Фосфатный буфер ТІ буфер (10 мМТрис-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА) Саркозилат Na Проназы — 1,5 мг/мл Фенолу Хлороформ Агарозные гелі Фитогормоны: БАП (6-бензиламинопурин) розчиняли в розчині 0,1 — NaOH HУК (2-нафтилуксусная кислота) розчиняли в етанолі і розводили водою до 10 мг/мл. Стерилізували фільтруванням через фільтри У 485. Ацетосирингон розчиняли в 70% спирті (етанолі) у незначній концентрації 10 мг/мл. Додавали у середу MS до кінцевої концентрації 100 мМ.

2.1.6. Ферменти, використовувані у генній инженерии Гидролиз ДНК проводили рестрикционными эндонуклеазами: Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.

2.1.7. Антибиотики Ампицилин 50, Н2О 50. Для селекції бактерій з деякими плазмидами.

Методы 2.2.1. Інкубація Agrobacterium tumefaciens з экссудатами тканин растений Ночную культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), вирощену на ротационном шейкері (20 циклов/мин) при 290 З в рідкої середовищі LB, збирали центрифугированием і суспензировали серед МС — 0,1 М фосфатном буфері (рН 5,5) до кислотності А600 — 0,05. Після 5 годин зростання бактеріальну культуру додавали мелконарезанные стерильні тканини рослин (листя, стебла) у кількості 2 р на 10 мл середовища і продовжували инкубацию протягом 48 годин. У качетве позитивного контролю використовували агробактериальную культуру з додаванням як індуктора 100 мкМ ацетосирингона. Як негативного контролю використовували агробактериальные клітини, вирощені на середовищі без ацетосирингона і эксцудатов рослин. Ефективність індукції процесингу тДНК церез 48 годин інкубації агробактерій з тканинами рослин. Титр життєздатних бактерій після інкубації з эксцудатами рослин перевіряли шляхом їх висіву у різних розведеннях на чашки Петрі з агаризованной середовищем LB. Кожен варіант дослідів проводили у трьох повторностях.

2.2.2. Виділення тотальної ДНК Agrobacterium tumefaciens.

ДНК виділяли по модифікованого методу Draper з соавт. Через 48 годин спільного культивування агробактерій з тканинами рослин з пробірок видаляли рослинну тканину, бактерії збирали, центруфугировали при 9000 g. Осад, полученый з десяти мл інкубаційної середовища лизировали протягом 45 хв при 370 З на 500 гривень мкл ТІ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА), що містить 1% сарколизата Na і 1,5 мг/мл проназы. Лизат двічі экстрагировали фенолом і двічі хлороформом. ДНК брали в облогу спиртом і розчиняли в ТЕ-буфере.

2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну В цілях додаткової перевірки наявності індукції процесингу і в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерій у кількості 5 мкг завдавали в лунки 0,8% агарозного гелю й провели електрофорез при 25−100 У протягом 2 годин на буфері, що містить: 40 мМ трис-ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА і п’яти мкг/мл бромистого этидия. Як маркерів молекулярного ваги використовували ДНК фага (, гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind III. Блод-гибридизацию проводили на ----- фільтрах. Як зонда использвали ДНК плазмідами pBR322, меченную 32 -- з допомогою ДНК-полимеразной системы.

2.2.4. Трансформація клітин Esherichia coli.

Штаммы E. сoli HB101 вирощували в рідкої середовищі LB при 370 З до концентрації 5*107 клеток/мл (А600 = 0,45). Для кількісного вивчення процесингу тДНК використовували комплементарные клітини бесплазмидного штами E. сoli HB101, які трансформували тотальної ДНК агробактерій, що була виділено (М-2), претерпевших різну переробку. Трансформанты кожного варіанта высевали втричі чашки Петрі з агаризированной середовищем LB, що містить ампицилин (50 мкг/мл). Кількість колоній підраховували. У контрольних експериментах клітини трансформували плазмидой pBR322, і інший контроль ні підданий трансформації і колоній виявлено не было.

3. результаты Для виявлення процесингу агробактериальной тДНК, індукованого экссудатами анализированных рослин, у роботі застосовували метод «порятунку плазміди », запропонований Koukolikova-Nikola з співавт. Цей метод грунтується на використанні модифікованої Ti-плазмиды pGV385 [11], що містить між правої та скільки лівої межами значно делетированной вихідної тДНК бактеріальної плазмідами вектор pBR322. Отже, індукування процесингу тДНК в модифікованої Ti-плазмиде pGV3850 можна простежувати по вирізання з її низкомолекулярного фрагмента ДНК, до складу якої входить плазмида pBR322. Цей процес відбувається можна тестувати різними методами. Одне з них — це трансформація клітин E. сoli тотальної агробактериальной ДНК і відбір трансформантов по селективним маркерным ознаками плазмідами pBR322 — стійкою до антибіотиків. Іншим методом то, можливо блодгібридизація — аналіз тДНК з допомогою плазмідами pBR322 як гибридизационного зонда. Обидва ці методу було використано у «справжній роботі. Порівняли ефективність індукції процесингу экссудатами різних рослин проведено стосовно активності 100 мкМ ацетосирингона. Відомо, що це токсифенольное з'єднання, що виділяється деякими двудольными рослинами, належить до сигнальним молекулам, индуцирующим вирізання і перенесення агробактериальной тДНК. Результати трансформації клітин E. сoli НВ101 тДНК підданих впливу экссудатов листя різних рослин представлені у таблиці. Таблиця 3.1. Чинники індукції |Кількість трансформованих E. Coli | |L. perpusilla (ряска) L. perpusilla (ряска) Ацетосирингон (контроль) Льон долгунец Nicotiana tabacum (тютюн) Без ацетосирингона і трансформації |25 колоній 30 колоній 35 колоній 40 колоній 30 колоній — | | Экссудаты листя ряски индуцировали вирізання тДНК, що доказом присутності їх складі сигнальних сполук, специфічних для індукції транскрипції генів vir агробактериальной Tiплазмідами. Прямий блод-гибридизационный аналіз тДНК агробактерій свідчить про присутності у ряски сигнальних молекул, индуцирующих освіту тДНК [12].

4. обсуждение Использованный підхід дає змогу реєструвати присутність сигнальних молекул в экссудатах різних тканин рослин однієї зі найважливіших результатів індукції генів області vir, саме по вирізання тДНК з агробактериальной Ti-плазмиды. У даний роботі ми застосували два методу детекции процесингу тДНК модифікованої агробактериальной Ti-плазмиды. PGV3850 [11]. Отримані результати дозволяють розширити список однодольных рослин (на одне рослина), синтезують сигнальні молекули, що індукують процессинг агробактериальной тДНК. Застосований метод «порятунку плазмідами «дозволяє виявляти поява циклічних форм модифікованої тДНК pBR322 і його лінійних форм [20]. Розглянутий у роботі метод дозволяє враховувати присутність у экссудатах рослин речовин з бактериостатической активністю. Речовини такий природи може істотно проводити ефективність трансформації рослин агробактериями. Не аналізували хімічну природу сигнальних молекул ряски. Не виключено, що сигнальні молекули можуть бути різні від сигнальних фенольних сполук двочасткових рослин. Специфічний процес взаємодії між агробактериями і покрытосеменными рослинами існував, очевидно, ще до їх дивергенції на двудольные і однодольные [15]. Штами агробактерій мають багатьма особливостями що саме рецептори (продукти гена vir A), різняться за спроможністю впізнавати сигнальні молекули різної природи. Слід зазначити, що рослинні речовини з сигнальній функцією для агробактерій перестав бути унікальним прикладом існування сполук, виконують цю значної ролі у взаємодії мікроорганізмів з растенями [22]. Молекулярні сигнали рослин відіграють істотне значення у встановленні паразитичних і симбиотических відносин між бактеріями і рослинами, визначаючи у своїй коло рослин для певного мікроорганізму. Всебічні структурно-функціональні дослідження специфічних молекулярних сигналів у взаємодії між мікроорганізмами і рослинами мають відповісти на численні запитання про молекулярно-генетичних механізмах цих взаємин української й сприяти розвитку ефективних методів генетичної інженерії найважливіших сільськогосподарських і экологически-индикаторных культурах рослин (як ряска).

писок литературы.

1. 2.

10. |Аналіз геному. Методи. Під ред. М. Дейвіса. — М.: Світ, 1990. — 247 з. Великов В. А., Бур’янів Я.И. Освіта делеционных похідних Ti-плазмиды pGV3850 при конъюгационном перенесення з Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. // Генетика.1998. № 8. т. 34. з. 1056−1062. Великов В. А., Бур’янів Я. И. Вивчення конъюгационного транспорту Ti-плазмиды pGV3850 з Agrobacterium tumefaciens в Escherichia coli. // Тези доповідей III Пущинської конференції молодих учених. Пущино, 27−30 квітня 1998 р, з. 49. Генна інженерія рослин. Лабораторне керівництво. — М.: Світ, 1991. — 408 з. Клонування ДНК. Методи. Під ред. Д. Гловера. — М.: Світ, 1988. — 538 з. Малиатис Т., Фрич Еге., Сэмбрук Дж. Молекулярне клонування. Методи генетичної інженерії. — М.:Мир, 1984. — 463 з. Методи молекулярної генетики та генної інженерії. Під ред. А.І. ——. — Новосибірськ: Наука, 1990. — 248 з. Мобільність геному рослин. Під ред. Б. Хол і Е. С. Делинс. — М.: Агропромиздат, 1990. — 272 з. Плазмідами. Методи. Під ред. Д. Хорда. — М.: Агропромиздат, 1990. — 272 з. Пехов О. П. Основи плазмидологии.- М.: 1996. — 231 з. Сільськогосподарська біотехнологія. Векторні системи молекулярного клонування. Під ред. Р. Л. Подреперс і Д. Т. Денхардт. — М.: Агропромиздат, 1991. — 535 з. Солова Г. К., Кривопалов Ю. В., Великов В. А., Чумаков М. И. Прикріплення Agrobacterium до витоків пшениці. // Мікробіологія. 1995. т. 64. № 4, з. 526- 530. Захарченко М. С., Комиви М. А., Бур’янів Я.И. Індукування процесингу тДНК. // Фізіологія рослин. 1999. т. 46. № 2, — з. 282−291. Baker R.F., Idler I.B. and al. Nucleotide sequence of the tDNA region from Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTi / 5955. Plant Mol. Biol., 1983, V.2, pp. 335−350. Douglas C. J and al. Identification and genetic analisys of an Agrobacterium tumefaciens chromosomal virulence rigion. J. Bacteriol., 1985, v. 161, pp. 850−860. Holster S.M., Villaroel and al. An analisys of the boundaries of the octopine TL — DNA intumors induced by Agrobacterium tumefacies. Mol. Gen. Genet., 1983, v. 190, pp. 35−38. Howord E.A., Zupan J.R. and al. The vir Dr protein of A. Tumefaciens contaen sal-terminal bipartite nuclear localization sygnal: implication for nuclear uptake of DNA in plant cells. Cell, 1992, v. 68, pp. 109−119. Janssens A., Engler., Zambryski P. The nopaline c58 tDNA region is teansribed in Agrobacterium tumefaciens., Mol. Gen. Genet., 1984, v. 195, pp. 341−350. Melchers L.S., Hooykaas P.J.J., virulence in Agrobacterium tumefaciens. Oxford Surv. Plant Mol. Cell Biol., 1987. № 4. pp. 167−170. Stachel S.E., Nester E.W. The genetic and transcriptional organization of the vir regulon of the A6 Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., v. 5, pp. 1145−1454. Zambryski P., Joos N., Genetello G., Leemans. Ti plasmid veefof for the introduction of DNA in to plant cells without alteration of their normal regeneration Capacity. EMBO J., 1983. v. 2, pp. 2143−2150. | |.

Показати весь текст

Заповнити форму поточною роботою