Электронно-микроскопические методи дослідження, у медицине

ЕЛЕКТРОННА МИКРОСКОПИЯ.

Електронна мікроскопія — метод морфологічного дослідження об'єктів із допомогою потоку електронів, дозволяють вивчити структуру цих об'єктів на макромолекулярном і субклітинному рівнях. Після випуску першої промислової моделі просвітчастого (трансмиссионного) електронного мікроскопа ЕМ пройшла великий шлях розвитку і дозволила перейти на якісно нового рівня вивчення матерії. ЕМ знайшла широке використання у морфології, мікробіології, вірусології, біохімії, онкології, медичної генетиці, імунології. Завдяки ЕМ розкрито субмикроскопическая структура клітин, відкритий ряд невідомих раніше клітинних органел, як-от лизосомы, рибосоми, эндоплазматический ретикулум, микротрубочки, цитоскелет, структури, специфічні окремих видів клітин. ЕМ дозволила зрозуміти багато тонкі механізми розвитку хвороб, зокрема на ранніх етапах їх виникненню, ще до його появи чіткої клінічної симптоматики. ЕМ дедалі ширше застосовується для ранньої діагностики захворювань, і навіть для виявлення етіології інформаційних процесів. Її використав онкології для визначення гистогенеза пухлин, що є важливого значення при лікуванні і прогнозі онкологічного захворювання. У нефрології дослідження з допомогою ЕМ матеріалу, отриманого при пункційної біопсії, дає змоги виявити раніше морфологічні зміни структур пачок, діагностувати форму гломерулонефриту тощо. При ЕМ пунктатов печінки вдається провести диференціальну діагностику гепатитів, гепатозов та інших захворювань печінки, визначити активність процесу нерідко його етіологію. Дослідження будівлі матерії на субклітинному і макромолекулярном рівнях стримуються можливостями роздільної здатності електронних мікроскопів. Використання ЕМ разом із іншими методами, наприклад, з авторадиографией, гистохимическими, імунологічними, зумовили створення електронної авторадиографии, електронної гистохимии, імунної електронної мікроскопії (електронної иммуноморфологии) та інших. Це й дозволило значно розширити інформацію, отримувану з допомогою ЕМ, спостерігати структурне вираз течії біохімічних процесів у клітині, що, на свій чергу, підтвердило одна з основних методологічних принципів сучасної біології - діалектичне єдність структури та функції. ЕМ потребує спеціального підготовки об'єктів вивчення, від якої у значною мірою залежать можливості методу. Відповідно до цілями дослідження методика такий підготовки може бути різною. Проте неодмінною умовою для будь-яких електронно-мікроскопічних досліджень є фіксація тканин чи мікробів з максимальним збереженням їх прижиттєвого будівлі. Існують принципово різних способи фіксації: хімічний і тяжка фізична, кожен із яких має різні варианты.

У ЕМ, зазвичай, використовують хімічну фіксацію з допомогою фіксаторів, які мають стабілізуючими властивостями. Універсального для будь-яких тканин фіксатора немає, у залежність від завдання конкретного дослідження застосовують відповідні фіксатори. При виборі хімічних фіксаторів походять від їх спроможність коагулировать білки (спирти, ацетон, деякі кислоти, солі важких металів та інших.) або стабілізуються ліпіди і гелі (четырехокись осмію, глутаровый альдегид, формалін, двухромовоксильный калій та інших.). Для дослідження беруть біопсійний матеріал чи матеріал від трупа людини або тварин невдовзі після наступу смерті. Існують оптимальні терміни взяття різних тканин і клітин, зазвичай обчислювані хвилинами. Чим раніше тканину завадять в фіксатор, тим паче достовірні дані одержують про прижиттєвої структурі клітин. Фіксатори мають різної швидкістю проникнення тканину: від цього можлива величина об'єкта дослідження. Так, четырехокись осмію і глутаровый альдегид пробираються у тканину на 0,1−0,5 мм приблизно за 1 — 1,5 години, але декому тканин воно може бути збільшене до запланованих 4 годин чи до 20−30 хв. У окремих випадках допускається протягом однієї доби. Найбільшого поширення набула отримала фіксація матеріалу в глутаровом альдегиде із наступною дофиксацией в четырехокиси осмію. Глутаровый альдегид краще, ніж четырехокись осмію фіксує білки, але гірше стабілізує ліпіди, як і зумовлює використання обох фіксаторів як доповнюють одне одного. Для виборчої фіксації окремих субклеточных структур використовують більш специфічні фіксатори (перманганат калію, двухромовокислый калій і ін.). Якість фіксації значною мірою залежить від рН і осмотического тиску котрий фіксує розчину. Оптимальним є рН 7,2- 7,4, що він відповідає фізіологічним параметрами. Тому застосовують буферні розчини. Частіше застосовують фосфатні чи какодилатный буферы. Фізіологічне осмотическое тиск створюють шляхом додавання осмотически активних речовин, наприклад сахарози чи деяких солей. Є кілька методів хімічної фіксації: перфузионный, коли фіксатор вводять у струм крові, фіксація дома, коли фіксатор вводять у тканину до її висічення, метод занурення висічених шматочків тканини в фіксатор. Для уповільнення аутолитических процесів, що відбуваються в висічених шматочків тканини до їх фіксації, останню проводять за нормальної температури 2- 5 градусів. Після фіксації потрібно здійснити зневоднення тканини. Цей процес відбувається може бути щодо швидким, поступовим разом із тим забезпечити максимально повне видалення води з зразка, яка досягається проведенням підлягає дослідженню тканини через батарею спиртів чи ацетонов висхідній концентрації (від 30 до 100%) впродовж години. Наступним важливим етапом підготовки матеріалу для ЕМ є заливання (висновок) тканин в заливочные середовища для одержання блоку, який володіє оптимальним поєднанням твердості і еластичності, що дозволяє приготувати тонкий зріз тканини (завтовшки щонайменше 100 нм), з якого може пройти електронний промінь. Першими заливочными матеріалами були метилметакрилат і бутилметакрилат. Нині вже майже не застосовуються, т.к. токсичні і легко возгоняются під пучком електронів, що зумовлює вираженим артефактам і забруднення електронного мікроскопа. Найширше для заливання тканин використовують эпоксидные смоли, переважно аралдит і эпон, уживані спільно. Менш поширені поліефірні смоли (вестопал), водорозчинні заливочные суміші, у тому числі частіше користуються гликольметакрилатом і дуркупаном. Проте, жодна заливочная середовище не є хімічно інертної й у якійсь мірі впливає на тканину: це потрібно враховувати під час інтерпретації результатів микрокопирования. Останніми роками широке застосування знайшла заливання в звані компаунды, тобто. в суміш певних речовин: основу (мономера), отвердителя, придающего образующемуся полимеру міцність і твердість, пластификатора, забезпечує еластичність і пружність полімеру, ініціатора, диссациирующего із заснуванням вільних радикалів, прискорювача, який, взаємодіючи з мономером, звільняє активні додаткові радикали, і каталізатора, що сприяє початку реакції полімеризації. У практиці зазвичай використовують компаунд, що з основи, отвердителя, пластификатора і каталізатора, роль якого не може грати прискорювач чи ініціатор. Є досить багато способів просочення тканини заливочными засобами. Процес просочення зазвичай протікає при кімнатної температурі чи термостаті за нормальної температури 30? протягом 48 годин. Потім шматочки тканини переносять в маркіровані желатинові капсули чи спеціальні форми, наповнені заливальної сумішшю. Для полімеризації суміші капсули на 48 годин вміщують у термостат за нормальної температури 60?. Через війну полімеризації утворюється блок, у якого відповідними властивостями. Для отримання ультратонких зрізів завтовшки 30−50 нм використовуються скляні чи діамантові ножі. Діамантові ножі довговічніше скляних, але зза високу вартість вони отримали поширення. До задньої боці ножа прикріплюють спеціальну ванночку і встановлюють на ультратом, в ванночку наливають 10% розчин етилового спирту і десяти% розчин ацетону на дистильованої воді. У рухливому тримачі ультратома закріплюють блок з тканиною. Різка блоку здійснюється з допомогою поступального руху стрижня власника, а підвищення і опускання власника щодо що краючою крайки ножа забезпечуються електронної схемою. Зазвичай на початку виготовляють звані тонкі зрізи завтовшки 1 мкм, вивчаючи які, вибирають цікавий для дослідника ділянку. Сориентируя відповідним чином полутонкий зріз та Блок, проводять заточення блоку з таким розрахунком, щоб у вершині зчинений піраміди перебував необхідний ділянку. Потім виготовляють ультратонкие зрізи завтовшки 30−50 нм. З ванночки зрізи переносять на металеві сітки. Для констатування зрізів застосовують речовини з великим атомним вагою, такі як солі важких металів, природно рассеивающие електрони. Іони деяких із цих речовин можуть утворювати через відкликання киснем і приєднаються до фосфатным групам нуклеїнових кислот. Інші, особливо уранилацетат, крім того, діють як універсальні барвники. Свинець пов’язують із комплексами тканини і осмиевыми чинниками. Зазвичай проводять контрастування ультратонких зрізів чи поєднують контрастування шматочків і ультратонких зрізів тканини, після чого вивчають в електронному мікроскопі. Хімічні методи фіксації і заливання матеріалу випливає низка недоліків. Так, за її використанні відбуваються хімічні зміни макромолекулярной структури клітин: при фіксації і зневодненні клітин та тканини втрачають деякі речовини: при взаємодії тканини, фіксатора і заливальній середовища не може змінюватися локалізація внутрішньоклітинних структур. Тому інтенсивно розробляються фізичні методи приготування тканини для ЕМ і особливо гистохимии і цитохимии. Більшість цих методів полягає в дуже швидкому заморожуванні шматочків тканини. З використанням методу замораживания-высушивания шматочки тканини поміщають в хладагенты (пропан, изопентан чи фреон), охолоджені до -150?, й у клітинах миттєво припиняються обмінні процеси. Причому у тканини не встигають утворюватися кристали льоду, і тому субклітинні структури не руйнуються, а вода перетворюється на склоподібне стан. Потім у високому вакуумі (10−6 -10−7 мм рт.ст.) відбувається сублімація, після чого тканини спеціальним чином заливають заморожені метакрилаты, аралдит чи вестопал У. Проте, який завжди вдається досить швидко рівномірно заморозити тканину, отже, убереже від освіти кристалів льоду, які при підвищення ушкоджують внутрішньоклітинні структури. Виникають і інші труднощі, що призводять до появи артефактів. Тому, частіше застосовують різновид цього: замораживание-замещение. Після заморожування воду, яка в склоподібне стан, видаляють, поміщаючи тканину на обезвоживающие речовини при низької температури. У умовах спирт і ацетон мало впливають на структуру клітин. Метод криоскалывания (замораживание-травление) дозволяє запобігти виникненню хімічної реакції при обробці тканин. Фрагменти тканин заморожують в хладагенте зі швидкістю перевищує 1000? один з. Об'єкт вміщують у вакуумну камеру і тих чи іншим чином розколюють чи розривають. На поверхні відколу завдають платиноуглеродное покриття (репліку). Потім репліку очищають від органічних залишків в розчині сильного окислювача, промивають у воді й поміщають на сіточку для електронної мікроскопії. Для досліджень поверхні біологічних тканин використовують і метод відтінення. Найбільшого поширення набув метод приготування реплік шляхом напилювання у вакуумній камері вуглецю на поверхню зразка тканин. Для контрастування що виникла репліки її у під гострим кутом напыляют электронно-плотные речовини (платину чи платиноиридиевый сплав). У цьому кількість атомів металу значно більше, того боці контурів зразка, яка ближчі один до джерелу напилювання: для дослідження в електронному мікроскопі вона здається неконтрастной. Протилежна поверхню контуру маємо замало атомів металу: в електронному мікроскопі вона контрастна і як відтінює неконтрастну поверхню контуру. Метод відображення дозволяє розрахувати висоту контурів досліджуваного об'єкта, так як відомий кут напилювання, довжина тіні й боротися збільшення, у якому вироблялося фотографування репліки в електронному мікроскопі. Для вивчення поверхні ізольованих клітин та тканин служить сканирующая (растрова) ЕМ. Однією з основних умовою приготування об'єкта для що сканує ЕМ необхідно збереження відповідного поверхового натягу клітин щоб уникнути їх деформації. Поверхня досліджуваної тканини промивають збалансованими изотоническими забуференными солевыми розчинами чи безбелковыми культуральными середовищами з рН 7,3−7,4, подогретыми до температури 37?. Для фіксації зазвичай застосовують ізотонічний розчин глутаровоальдегида із наступною дофиксацией четырехокисью осмію. Тканина збезводнюють в спиртах чи ацетонах, та був висушують методами замораживания-высушивания чи переходу критичної позначки. Останній грунтується на використанні такого фізичного явища як виникнення при певних умов критичного стану рівноваги пара і рідини. У цьому методі тканину перебувають у газової середовищі (тобто. висушеною), що дозволяє уникнути повреждающего дії поверхового натягу. Для досягнення високих ступенів дозволу підвищують електропровідність об'єкта, напыляя нею важкі метали: золото, платину, срібло чи його сплави. Застосовується також метод іонній бомбардування в вакуумі платівки металу іонами інертного газу. «Вибиті» атоми металу осідають лежить на поверхні об'єкта дослідження. Для виявлення внутритканевых і внутрішньоклітинних структур застосовують механічні, термічні, хімічні та інші методи. Для ЕМ мікробів застосовують подібні методи з урахуванням будівлі мікробів їх розмірів, осмотического тиску та інших. Особливий підхід здійснюється за ЕМ вірусів. Вивчення структур вірусів утруднено через малих ж розмірів та слабкої рассеивающей здібності вириона. На перших етапах ЕМ вірусів ця труднощі переборювалася оттененением частинок при випаровуванні важких металів в вакуумі. Аж по кінця 50-ых років 20 століття методика відтінення вірусних частинок була основною щодо вірусів у суспензіях. Частіше з цією методики використовували уран 238, платину, паладій чи сплави платини з палладієм. Найбільшого поширення набув сплав платини з палладієм в співвідношенні 4:1. Знаючи поставлене кут відтінення, за довжиною образующейся тіні визначають висоту вірусної частинки й її діаметр. Оттенение металами досліджуваного об'єкта при поєднані із криогенными методиками (заморожуваннявисушування) дозволяє їм отримати важливу інформацію щодо структури вириона изометрических вірусів. Широке поширення отримала методика негативного контрастування вірусів з допомогою вольфрамофосфорной кислоти (Н3РW12О40), яка за подщелачивании їдким калієм чи їдким натрієм (від значення рН 2,0 до рН 7,0) змінюється і після нанесення препарату на вірус створює зону високого розсіювання електронів, у результаті виявляються морфологічні ознаки вірусу. Розвитку знання структурі вириона сприяли кріогенні методики. Одне з найпростіших варіантів таких методик ось у чому: сітки з підкладкою перебувають ними вірусами після нанесення контрастирующего розчину вміщують у скраплений пропан (температура -150?) чи переохлажденный азот (температура -200?). Подальше висушування зразка за нормальної температури -100? глибокій вакуумі сприяє збереженню тривимірної організації вириона. Виняток цих умовах деформирующей ролі сил поверхового натягу води призвело до перегляду погляду, що форму для вириона у липидосодержащих вірусів має високої лабильностью. Більше складні кріогенні методики, застосовувані в електронної мікроскопії (наприклад, криоскалывание), також внесли помітні внески у розвиток поглядів на структурі вирионов, особливо про мають липопротеидную оболонку. Структура геному вірусів вивчається з допомогою модифікованої в 1959 року Клейштейном і Лангом методики відтінення лінійних макромолекул важкими металами, які випаровуються з В-образным катодів під кутом 5−10?. Умовою, що дозволяє вивчити нуклеїнові кислоти, і особливо однонические (поперечний розмір 1−1,1 нм), є зв’язування його з основними білками, т.к. у своїй утворений нуклеопротеид має діаметр до 18 нм в двунитчатых структурах і по 15 нм — в однонитчатых. Як такого білка частіше використовують цитохром З. Вміщена на підкладку нуклеїнова кислота в білковому чохлі має найвигадливіший контур, і можливість побачити в всьому протязі можна здійснити в тому разі, якщо у час відтінення металами буде зроблений хоча б тільки поворот сітки з об'єктом для напилювання на 360?. Найкращі результати досягаються при тривалому оттенении (до 10 хвилин) сплавом платини з палладієм і багаторазовому поворачивании напыленной сітки на обертовому столику. Численні модифікації методики Клейшмидта і Ланга дають змогу одержувати дані як про довжині геному, але вивчати і рівень гомології геному різних вірусів, локалізувати вставку тієї чи іншої гена у складі гібридних молекул, досліджувати гібридні молекули нуклеїнових кислот. Загальна інформацію про морфогенезе вірусів отримано з допомогою ультратонких зрізів вірусів. Техніка отримання ультратонких зрізів вірусів не відрізняється від загальноприйнятої. Останніми роками зростає питому вагу ЕМ як экспресс-метода чи діагностики вірусних інфекцій. Особливо велика роль методу імунної мікроскопії, що дозволяє встановити родову приналежність вірусу. Імунна ЕМ відіграла визначну роль на перших етапах дослідження інфекційного гепатиту (гепатиту А), і навіть вірусних гастроэнтеритов і внесла значний внесок у вивчення гепатиту У. Теоретичні основи иммуноморфологии на светооптическом рівні розроблено у 1942 року Кунсом з працівниками, які вперше показали, що у молекулу антитіла можна запровадити деякі речовини, не порушуючи істотно їх специфічності. Розвиток цієї ідеї дозволило 1959 року Зингеру розробити иммунноморфологический метод на электронномикроскопическом рівні, заснований використання антитіл, мічених ферритином. Ферритин-белок із високим вмістом заліза, у якому атоми металу організовані на чотири субъединицы, розташовані близько друг до другу, що забезпечує високе розсіювання електронів при ЕМ і чітке виявлення молекули. Конъюгация білка з антитілом можлива з допомогою різних бифункциональных агентів, найбільшого поширення серед яких отримали 3,4-толуендиизоцианат і ксиленметадиизоцеанат. Імунна електронна мікроскопія з допомогою антитіл, мічених ферритином, ефективна для виявлення экстрацеллярных антигенів мікробів в інфікованих тканинах, у цьому числі вірусних антигенів лежить на поверхні клітини, і навіть поверхневих антигенів у клітині. Разом про те ця методика часом неефективна, наприклад, якщо потрібно досліджувати внутрішньоклітинні об'єкти, антигени мікробів всередині клітини, що відбувається, насамперед, при вірусних інфекції. Це пов’язано з тим, що молекулярний вагу (маса) антитіл, мічених ферритином, близько 800 тис., і тому проихождение їх крізь плазматическую мембрану клітини неможливо, а антитіла, мічені ферритином, проникли неї шляхом эндоцитоза не входять у контакт зі специфічним антигеном. Тому нині основне маса досліджень, що з виявленням внутрішньоклітинних антигенів з допомогою антитіл, мічених ферритином, виконано при руйнуванні плазматичної мембрани шляхів замораживания-оттаивания чи обробки компліментом. Заміна феритину низкомолекулярными сполуками, що містять ртуть, йод, не знайшла широко він через низьку специфічності методу. З кінця 60-ых років 20-го століття імунології застосовується иммуннопероксидазная методика ЕМ щоб виявити антигенів усередині якого і на поверхні клітин. Перексидаза, використовувана для мітки антитіл, дозволяє отримати найкращий ефект проти іншими ферментами (фосфотазы, деякі оксидазы) завдяки більш низькому молекулярному вазі (близько сорока тис) і опірності різним гистологическим процедурам. Антитіла, мічені пероксидазой, пробираються у клітку та пов’язуються з гомологичным антигеном. Конъюгирование антитіл з ферментом здійснюється поруч бифункциональных агентів, серед найбільш доступним є глутаровый альдегид. Коли відбулася зв’язок антитіла з відповідним антигеном, локалізація ферменту виявляється після контакту його з певним субстратом — бензидином, а-нафтолом, сумішшю анафтола, з р-ферментом. У присутності перекису водню утворюється продукт з більш вираженої рассеивающей здатністю електронів проти оточуючими структурами.