Біохімічні методи досліджень

Стан біохімічних процесів, що протікають в організмі піддослідних тварин, оцінювався за рядом показників, що характеризують функціональні зміни обміну речовин, які обумовлюються дією чинників навколишнього середовища. Під їх впливом дискоординація ферментних систем може стати пусковим механізмом у розвитку метаболічних і функціональних порушень в організмі. При пошкодженні проникливості біомембран важливим показником є стан ферментативної активності [178, 179, 180].

Біохімічний аналіз крові починається з визначення вмісту загального білка, що має велике значення для характеристики функціональних станів організму, які супроводжуються синдромом гіпер-, гіпота парапротеїнемії. Білки — це високомолекулярні біоорганічні сполуки, молекули яких побудовані із залишків амінокислот, зв’язаних амідними (пептидними) зв’язками. Білки входять до складу всіх клітинних компонентів організму та міжклітинних структур, виконуючи каталітичну, структурну, регуляторну, рецепторні, транспортну, механічну, захисну та інші функції. Білковий спектр кожного організму є унікальним, і це зумовлює особливу роль білків в оцінці функціонального стану організму. Більші частина білків плазми крові синтезується в печінці. Зміна вмісту загального білка в плазмі крові відбувається при зменшенні процесів синтезу білка, порушенні водного балансу, посиленому розпаді і втраті білка організмом. Зростання вмісту білка свідчить про порушення обмінних процесів у нирках, а на фоні зниження альбумінів може свідчити про ураження нирок і печінки [167]. Визначення загального білку у біологічному матеріалі проводили з використанням реактиву Фоліна за методом Lowry в модифікації Peterson [163]. Велику функціональну групу білків плазми крові складають транспортні білки. Вони переносять з кровотоком від клітини до клітини гідрофобні речовини — гормони, метаболіти, вітаміни, жирні кислоти, мікрота мікроелементи. Основний транспортний білок плазми крові - альбумін — синтезується в гепатоцитах. Зв’язаний з альбуміном пул біологічно активних сполук у крові функціонально неактивний. Альбумін виділяють в окрему групу білків — білкові фракції. Визначення альбуміна використовується для діагностики захворювань печінки і почок, ревматичних та онкологічних захворювань. Вміст альбуміна в крові та органах визначали уніфікованим методом за допомогою тест-набору фірми Sentinel (Італія).

Для характеристики білкового обміну важливу роль має визначення вмісту кінцевих продуктів обміну білка — залишкового азоту, майже 50% якого складає сечовина. Сечовина синтезується з аргініну в циклі Кребса у гепатоцитах. Відомо, що зростання вмісту сечовини відмічається при порушеннях гемодинаміки, при отруєнні, є однією з головних ознак порушення видільної функції нирок. Зниження концентрації сечовини спостерігається в крові в результаті порушення сечовинотвірної функції печінки [167].

Зростання глюкози тісно пов’язані зі зростанням білку сечовини може свідчити також про пошкодження функції нирок та підшлункової залози при гострій інтоксикації хімічними речовинами [166].

Глюкоза — основний представник вуглеводів плазми крові, основне джерело енергії у організмі. Завдяки тому, що глюкоза представлена альдегідною формою, вона має відновлюючі властивості. З кров’ю воротної вени вона надходить до печінки, частково затримується гепатоцитами, а частково потрапляє в загальний кровоток і використовується клітинами і тканинами. Підвищення вмісту глюкози в крові - гіперглікемія може бути при токсичних ураженнях печінки [165]. Гіпоглікемія може бути спричинена порушеннями процесів глікогенезу та глікогенолізу, посиленим розщеплення глюкози в тканинах, посиленим виділення глюкози через нирки.

Холестерин, 3-в-гідроксихолест-5-ен, — мононенасичений стерин складу С₂₇Н₄О (ОН)₅; за хімічною структурою це одноатомний вторинний спирт (холестерол). Холестерин добре розчиняється в органічних розчинниках, особливо в спиртах, у воді майже не розчиняється. Хімічна структура холестерину обмежує число хімічних реакцій, у яких він приймає участь. Основне хімічне перетворення холестерину — утворення ефірного зв’язку з кислотами, зокрема вільними жирними кислотами, з утворенням ефірів холестерину. 80% холестерину в організмі складає вільний холестерин (у складі біологічних мембран). В той же час 2/3 холестерину у плазмі крові знаходяться у формі ефірів з жирними кислотами. Основна функція холестерину — структурна: у складі біологічних мембран холестерин визначає проникність мембран і створює мікрооточення для інтегрованих у мембрану рецепторів.

Основна маса холестерину синтезується в гепатоцитах та надходить з їжею. Холестерин, як і інші ліпіди, транспортується в крові у складі ліпопротеїнів. Ліпопротеїни низької густини (ЛПНГ) є основною транспортною формою холестерину від печінки до периферичних тканин. І навпаки, холестерин, що виділяється з плазматичних мембран, транспортується у печінку у складі ліпопротеїнів високої густини (ЛПВГ). Холестерин, що надходить у печінку у складі ЛПВГ, частково виводиться у формі вільного холестерину або його ефірів.

Порушення обміну холестерину проявляється гіперабо гіпохолестеринемією. Дослідження вмісту холестерину характеризує ступінь порушення обміну ліпідів та ліпопротеїнів. Гіперхолестеринемічний стан розвивається в процесі порушення вуглеводневого обміну. Гіпохолестеринемія виникає при зниженому синтезі холестерину у печінці під час дії токсичних речовин, що супроводжується тяжким ураженням печінки [166,167]. Вміст холестерину може коливатись, то підвищуючись, то знижуючись при гострому пошкодженні печінки [171].

Біохімічні механізми впливу МП на рівні ЦНС включають зміни адренергічних і холіненергічних процесів. Домінуючими є функціональні зрушення, пов’язані з впливом ЕМЕ на холінергічні механізми. Під впливом ЕМВ настає пригнічення холінестеразної активності крові, що випереджає клінічні прояви. Зниження активності холінестерази веде до нагромадження ацетилхоліну, надлишкова кількість якого викликає розвиток гальмових процесів у корі. Функціональний стан холінергічних процесів оцінювали по активності холінестерази крові.

Активність холінестерази визначали по збільшенню оптичної щільності інкубаційного середовища при 405 нм. Метод заснований на визначенні каталітичної концентрації з дітіо-тріс-нітробензойною кислотою (тест-набір Hospitex).

Процеси підтримки концентрації та основних функцій біохімічних субстратів, реакцій їх трансформації залежать від стану активності ряду ферментів, що беруть участь у регуляції мембранного транспорту при дії різних екзогенних впливів.

Метаболічне перетворення амінокислот здійснюють ферменти аспартатамінотрансфераза (АСТ) та аланінамінотрансфераза (АЛТ).

Аспартатамінотрансфераза (АСТ; глутамат-оксалоацетаттрансаміназа, КФ 2.6.1.1) каталізує реакцію переамінування до оксалоацетата. У ссавців найбільш висока активність АСТ відмічена у печінці, нервовій тканині, скелетних м’язах та міокарді.

Аланінамінотрансфераза (АЛТ; глутамат-піруваттрансаміназа КФ 2.6.1.2) каталізує реакцію переамінування до пірувату. АЛТ — друга активна амінотрансфераза, присутня у багатьох органах: печінці, скелетних м’язах, міокарді, підшлунковій залозі. Найбільше АЛТ міститься у гепатоцитах і є основним діагностичним ферментом деструкції тканин печінки [166].

Зміни активності амінотрансфераз відмічено при багатьох патологічних процесах та при токсичних ураженнях організму. Підвищення активності АСТ або зростання АЛТ — достовірний діагностичний тест при токсичних ураженнях печінки, зокрема, при отруєнні ядами та хімікатами. При гострих отруєннях значно зростає активність АЛТ у порівнянні з АСТ, що супроводжується різким підвищенням коефіцієнта де Рітіса [165, 167].

Паралельно проводилось визначення концентрації гемоглобіну в крові. Фізіологічне значення цього показника ілюструє кооперативний характер зв’язування кисню гемоглобіном, що забезпечує транспортну функцію білка. Також вивчали загальний вміст холестерину, його показники використовуються в діагностиці атеросклерозу та лікуванні порушень ліпідного обміну. Холестерин — це одноатомний циклічний спирт, в основному він синтезується в печінці та стінках шлунку. Кількісний вміст холестерину в крові та органах визначали уніфікованим методом за допомогою тест-набору фірми Sentinel (Італія).

Кількісний вміст глікогену в гомогенатах тканин печінки та головного мозку визначали антроновим методом по Morris [164].

Церулоплазмін — природний антиоксидант, який захищає біологічні мембрани від окислення, запобігає порушенням цілісності та функціонування біомембран. Визначення церулоплазмина проводилось за методом, принцип якого оснований на тому, що церулоплазмін, як компонент плазми крові, володіє оксидативними властивостями, каталізує окислення деяких поліамінів, у тому числі, парафенілендіамінгідрохлориду. В результаті реакції ступінь окислення пропорційна концентрації церулоплазміну [165].

Важливішим показником стану метаболічних процесів є перекісне окислення ліпідів (ПОЛ). ПОЛ — це вільно-радикальне окислення ненасичених жирних кислот, як вільних, так і тих, що входять до складу ліпідів, з утворенням гідроперекисів, альдегідів, кетонів, окислених жирних кислот. В результаті впливу факторів середовища в молекулярних структурах безупинно здійснюється первинне ініціювання вільних радикалів. У присутності кисню, який знаходиться в клітинах, первинні радикали при взаємодії з органічними сполуками (ненасиченими жирними кислотами) утворюють гідроперекиси і вторинні вільні радикали. Ланцюгова реакція вільно-радикального окислення повторюється багаторазово, що може привести до нагромадження як гідроперекисів, так і вторинних вільних радикалів. Ініціювання вільних радикалів можливо і ферментативним шляхом, що протікає при участі мікросомальних ферментних систем, зокрема, НАДФН і НАДН специфічних флавопротеїдів. У нормі процес вільно-радикального окислення утримується на відносно низькому стаціонарному рівні завдяки присутності в тканинах біоантиоксидантів і нейрогуморальних регуляторних систем. Зміни їх вмісту чи активності можуть з’явитися причинами посилення або інгібування процесу перекісного окислення ліпідів.

Інтенсивність ПОЛ визначали за рівнем метаболітів кінцевого продукту ПОЛ. В основі методу лежать реакції 2-тіобарбітурової кислоти з вторинними продуктами ПОЛ, в результаті яких утворюється речовина з максимумом поглинання оптичного випромінення за довжини хвилі 532 нм. Основна роль у цьому окисленні належить МДА [173].

Вміст ТБК — активних продуктів оцінювали згідно методу Стальної [175.].

Вміст ТБКактивних продуктів на 1 мг білка розрахували на основі значення малярного коефіцієнта екстинкції комплексу малонового діальдегіду (МДА) з 2-тіобарбітуратовою кислотою.

Стан ферментативної антиоксидантної системи досліджували визначенням активності каталази в крові. Активність каталази визначали за методом, принцип якого полягає в тому, що каталаза руйнує субстрат Н₂О₂, незруйнована частина пероксиду водню при взаємодії з солями молібдену створює стійкий комплекс, інтенсивність забарвлення якого пропорційна активності ферменту [174]. Активність визначали у нМоль Н₂О₂ на хвилину на 1 мг білка.

Вміст відновленого глутатіону оцінювали згідно методу Beutler E [176, 177].